Summary
キャビテーションマイクロバブルは、ズームレンズに取り付けられた高速カメラを使用して画像化されます。実験のセットアップが説明され、画像解析を使用してキャビテーションの面積を計算します。画像解析は ImageJ を使用して行います。
Abstract
キャビテーション気泡をイメージングし、その面積を計算するための実験的および画像解析技術が提示されています。ここで紹介する高速イメージング実験技術と画像解析プロトコルは、他の研究分野における顕微鏡バブルのイメージングにも適用できます。したがって、それはアプリケーションの広い範囲を持っています。これは、歯科超音波スケーラーの周りの画像キャビテーションに適用されます。画像キャビテーションは、キャビテーションを特徴付け、さまざまなアプリケーションでの利用方法を理解することが重要です。歯科超音波スケーラーの周りに発生するキャビテーションは、現在の歯周治療技術よりも効果的で損傷が少ない歯垢除去の新しい方法として使用することができます。高速カメラとズームレンズを用いて、歯科超音波スケーラー先端付近で発生するキャビテーション気泡雲を撮像する方法を紹介します。機械学習画像解析を用いてキャビテーション面積を計算する。オープンソースソフトウェアは画像解析に使用されます。提示された画像分析は、複製が容易で、プログラミング経験を必要とせず、ユーザーの用途に合わせて簡単に変更できます。
Introduction
気泡の動きをイメージングすることは、システムの流体力学を制御するため、様々な用途にとって重要です。これは、多くの用途で有用である:流動床11、2、2またはキャビテーション気泡33、44で洗浄する場合。泡をイメージングする目的は、気泡のダイナミクスや気泡の雲の方向と動きについてより深く理解することです。これは、画像化された構造を観察し、また画像解析を使用して気泡の大きさなどの定量的情報を得ることによって行うことができます。
キャビテーション気泡は、圧力が飽和圧力値5を下回ると流体中で発生する気体または気蒸気の実体である。超音波周波数で流体に音響場を適用すると発生する可能性があります。彼らは繰り返し成長し、崩壊し、崩壊時に高速マイクロジェットと衝撃波66、77の形でエネルギーを放出することができます。これらは、せん断力を通じて表面上の粒子を取り除き、表面洗浄8を引き起こす可能性があります。キャビテーション気泡は、半導体、,食品、創傷洗浄,99、10、11、12など、さまざまな産業での表面洗浄について調査されています。,101112それらはまた歯からの歯垢をきれいにするために使用され、歯科インプラント12、13,13のような生体材料。キャビテーションは、超音波スケーラーや歯内膜ファイルなどの現在使用されている歯科器具の周りに発生し、これらの器具14で追加の洗浄プロセスとしての可能性を示す。
キャビテーションバブルの振動は数マイクロ秒にわたって発生するため、高速カメラは毎秒数千フレームでの画像化によってモーションをキャプチャする必要があります 8.歯科超音波スケーラーの周りにマイクロバブルキャビテーションをイメージングする方法を実証する。目的は、キャビテーションが異なる超音波スケーラーの周りにどのように変化するかを理解することですので、それは歯垢をきれいにする新しい方法として最適化することができます。
キャビテーションを調査するために使用される以前の方法には、15,16,16のキャビテーションがどこで起こったかを検出するためにルミノールを使用するソノケミルミネッセンスが含まれる。しかし、これは間接的な手法であり、キャビテーション気泡をリアルタイムで可視化することはできません。したがって、機器上でどこで起こるかを正確に判断することはできず、他の撮像技術17と組み合わさっていない限り、気泡動態に関する情報を得ることができない。高速イメージングは、キャビテーション気泡の成長と崩壊だけでなく、キャビテーション雲、マイクロストリーマーおよびマイクロジェット66、7、187,18のキャビテーションの種類をイメージすることができます。これらは、キャビテーションがサーフェスをクリーニングする方法についての詳細を提供します。
高速カメラを用いてキャビテーションマイクロバブルを撮像し、キャビテーションの平均面積を算出する方法を紹介する。この方法は、異なる歯科超音波スケーラーの先端の周りに発生するキャビテーションの例を使用して実証されていますが、実験および画像分析ステップは、他のマクロおよびマイクロバブルのイメージングなど、他のアプリケーションに使用することができます。
Protocol
1. 機器のセットアップ
- イメージを作成するインストゥルメントまたはオブジェクトを選択します。この実験では超音波スケーラーを画像化した。キャビテーション気泡は、水中の超音波スケーラーの先端の周りに発生します。
- XYZの移動と回転で画像化する計測器のマイクロポジショニングステージを選択します。実験室のジャックの上に置きます。マイクロ位置決めステージにインストルメントハンドルを取り付ける
- イメージング用に光学的に透明な水容器を選択します。これらの実験で使用した容器は、ガラス顕微鏡スライドで作成した。
- 回転プラットフォームを備えた XY ステージを選択します。実験室のジャックの上に置きます。水容器をステージに置き、ろ過水(逆浸透または蒸留)で満たします。
2. 高速カメラのセットアップ
- 望ましいフレームレートと解像度を持つ高速カメラと、ファイバーライトガイドを備えた高輝度光源を選択します。
- マイクロポジショニングスライドプレートを高速カメラ本体に取り付け、三脚スタンドに接続します。
- 目的の解像度と焦点距離を持つレンズを選択し、カメラに取り付けます。この実験では、ズームレンズを8.4μm/ピクセルの解像度で使用しました。
- 撮像槽に水を充填し、水タンク内で画像化する器具の先端を所望の向きに配置します。
- カメラを接続し、ソフトウェアでライブビューをロードした後、必要に応じて光源を再配置し、超音波スケーラーの先端に焦点を合わせるために低倍率を使用してください。カメラの前に機器と光源を置き、フォーカスを合わせます。目的のフレームレートと明るさに合わせて調整します。
注: 高いフレームレート、短いシャッター速度、高倍率でのイメージングには、より高い光強度が必要です。照明は反射モードまたは伝送モードで提供することができます。このプロトコルでは、高輝度の冷たい照明装置を使用して、照明は伝送モード(明視野)で提供される。 - 高速カメラの最適なフレームレートとシャッタースピードを設定します。この実験では、フレームレートは6400fpsで、シャッター速度は262ナノ秒でした。キャビテーション気泡などの動きの速い気泡に焦点を合わせるためには、短いシャッタースピードが必要です。
- ズームレンズの倍率と光源の強度を調整して、背景が露出し過ぎないようにします。
3. キャリブレーション
- 先端の位置を記録します(x-yステージでの回転、再現性のための器具の回転角度)。
- 繰り返しごとにビューフィールドの一貫性を保つには、参照点を選択し、座標をメモします。この場合、基準点は超音波スケーラーの先端であった。その後、視野内の同じ場所で、将来の実験で再配置することができます。
- ピクセルサイズが不明な場合は、設定された倍率で10μmのマーキングを持つ経緯線を画像化し、フィジーなどの画像解析ソフトウェアを使用して解像度を計算します。
4. 高速ビデオ録画
- キャビテーションなしで機器をイメージします。これは、キャビテーションバブルの面積を計算する際に、画像解析でキャビテーション画像から減算されます。画像の品質が失われないように、TIFF などの形式でビデオを保存します。
- キャビテーションで作動する器械をイメージする。正確な解析に十分なフレームがあることを確認します (例えば、5 つの繰り返しをそれぞれ 500 フレームで繰り返します)。
5. 画像処理
- ImageJのウェブサイト(https://imagej.net/Fiji)からフィジー19 をダウンロードしてください。ImageJ マクロコードが提供され、以下に説明する画像解析の手順が自動的に実行され、アプリケーションに合わせて変更することもできます。マクロの個々のステップは、ステップ 5.3 から 5.5 で説明されています。
- 必要に応じて、イメージをトリミングして、不均等な照明に起因する暗い領域を除去します。すべての画像が同じサイズにトリミングされ、イメージ内の同じ位置にトリミングされていることを確認します。
- 自動しきい値のいずれかを使用して自動的にしきい値を設定して、イメージをバイナリに変換します。この例では、最小自動しきい値が使用されます。
- [塗りつぶし穴]コマンドを実行して、誤ってセグメント化されたバブルの内側から黒いピクセルを削除します。
- スタックのヒストグラムを計算して、スケーラーに対応するピクセル数と各フレームのキャビテーションを表示します。
- この場合、バブルに対応するピクセルは白で、値は255になります。これらの測定値を保存します。
- 泡なしで作動する器械のビデオのためにステップ5.3-5.6を繰り返す。
- ヒストグラムの結果からのみ超音波スケーラーの先端の平均面積を計算します。
- スケーラーの周りの気泡のビデオから計算された各領域から楽器の平均領域を差し引きます。気泡の面積は測定するために残されています。
- フィジーの画像計算機を使用して、気泡でスケーラーのバイナリ画像からスケーラーのバイナリ画像を差し引くことによって視覚化します。
- 気泡の面積の平均と標準偏差を計算します。
- ピクセルサイズを二乗して、ピクセル数から面積(この場合はμm2)に値を変換します。高速カメラで経緯線を撮像する倍率を撮像と同じ倍率で撮像し、ImageJを使用してスケールを設定することで、各ピクセルのサイズを計算します。
- データをプロットします。また、異なる条件を比較する場合、気泡の面積に有意差を示す統計解析を行うこともできます。
6. ImageJ マクロ
- ImageJ/フィジーメニューで、プラグイン>新規>マクロに移動します。言語メニューで IJ1 マクロがチェックされていることを確認し、次のコードをコピーして貼り付けます。[実行] をクリックしてマクロ (補足ファイル) を実行します。
Representative Results
画像解析のステップは、テストした超音波スケーラーの先端の1つについて図1に示されています。FSI 1000先端と10Pチップは、冷却水をオフにした状態で水タンク内で画像化しました(図2)。キャビテーションは、最大電力で先端FSI 1000の曲がりに近く、かつチップ10Pのフリーエンド付近で発生した(図3および図4)。キャビテーションの平均面積は、FSI 1000先端の場合は0.1±0.07 mm 2、10P先端では0.50±0.25mm2であった(図5)。2 2
図1:高速イメージングの設定と画像解析の手順(a)研究で使用される高速イメージング設定の概略図。(b) 研究で使用された画像解析ステップの概略図であり、スケーラー先端の左側にのみ生画像を表示し、キャビテーションとともに、次いで互いに二項化して減算してキャビテーション雲の面積を計算する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる先端の間の比較 テストされた2つの超音波スケーラーの先端の周囲に生じるキャビテーションを示す高速画像静止画(a)FSI 1000(b)10P.abこの図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3:ヒント10P高速画像:毎秒6400フレームで撮影されたビデオから、先端10Pの高速画像静止画。 キャビテーションは、先端の自由端の周りに見ることができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: ヒント FSI1000 高速画像: 1 秒あたり 6400 フレームで撮影されたビデオから、先端 FSI 1000 の高速画像静止画。 先端の中央の周りにキャビテーションが見える。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:キャビテーション領域画像解析結果 図示した画像解析技術を用いて算出したFSI 1000および10P超音波スケーラー先端の周囲で生じるキャビテーションの平均領域。誤差範囲は標準偏差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
本論文では、空間分解能や時間分解能の高い高速移動マイクロバブルのイメージングが可能になります。化学工学、歯科、医学などの科学分野の広い範囲に利益をもたらす可能性があります。エンジニアリングアプリケーションには、表面を洗浄するためのイメージングキャビテーション気泡、または流動床反応器内のイメージング気泡が含まれます。生物医学の適用は、医療および歯科器具の周りの画像化キャビテーションおよびキャビテーション気泡を使用して硬いおよび柔らかいティッシュからのバイオフィルムデブリドメントをイメージ投射する。本研究では、2つの異なる歯科超音波スケーラー先端の周りにキャビテーションをイメージングすることによって技術を実証した。キャビテーションの量は、この研究でテストされた2つの先端の間で異なり、より多くのキャビテーション雲が先端10Pの自由端の周りに観察される。これは以前に振動振幅20にリンクされています。高速ビデオは、FSI 1000先端の振動が少ないことを示しており、この先端の周りにキャビテーションが少ない理由である可能性が高い。
画像解析方法の 1 つの制限は、スケーラが振動しているため、スケーラの領域を除去するイメージ減算手法が完全に正確ではないため、減算によってスケータの一部の領域が気泡として誤ってセグメント化される可能性があることです。しかし、これは多数のフレーム(n =2000)から面積を平均化することによって説明されています。これは、減算されるオブジェクトが静止しているアプリケーションでは問題ではありません。減算する移動オブジェクトの分散が大きく、正確な結果を得るためには、両方の動画の動きを同期させると、正確な結果を得ることをおすすめします。今回の研究では振動を同期化しませんでしたが、振動が低かったので、この2つの測定では振動が互いにうまく対応していると考えることができます。
明視野照明は良好なコントラストを持つ均一な背景を提供するので、画像のしきい値は正確です。背景が均一で、誤ってセグメント化される可能性のある他のオブジェクトが含まれていないことを確認することが重要です。しきい値の方法は、アプリケーションに合わせて他の自動しきい値を使用して変更できます。手動しきい値 (ユーザーがしきい値を設定する場合) も可能ですが、結果の再現性が低下するため、ユーザーによって異なるしきい値が選択されるため、推奨されません。
画像解析は、他の多くのバブルイメージング研究に使用されています。これらはまた、逆光の同様の方法を使用して、気泡と背景の間の最適なコントラストを得るために、そして、バブル21、22、23、2422,23,をセグメント化するしきい値を得る。21現在の研究で示されている方法は、高速イメージングのみに限定されない多くの異なるバブルイメージングアプリケーションに使用されるように一般化することもできる。高速イメージングは、水中で発生するキャビテーション気泡や、内ドンティックファイルや超音波スケーラー12、25、26、27、28などの機器の周りに使用されています。12,25,26,27,28例えば、Rivas et al. と Macedo et al. は、顕微鏡に取り付けられた高速カメラを用い、キャビテーションによる画像洗浄に冷たい光源によって提供される照明を用いて、および、内洞ファイル17,29,29の周囲の画像キャビテーションに対する。明るいフィールド照明は、背景と気泡の間でよりコントラストを提供し、時間29にわたるキャビテーションの浸食および洗浄をイメージングおよび定量するためにRivasらによって示されるように、閾値のような単純なセグメンテーション技術を使用することを可能にする。暗視野照明はグレーのスケール44、3030の高い変動のために、しきい値をより困難にします。画像解析は、気泡1,,2に関する詳細情報を収集するために他の研究で使用されています。Vyasらは、超音波スケーラー20の周りにキャビテーション気泡をセグメント化する機械学習アプローチを使用した。現在の論文で説明されている方法は、単純なしきい値を使用して計算負荷が少なく、スケーラの上下に発生する気泡を分析できるため、より迅速です。ただし、現在の用紙で使用されているしきい値の方法は、背景が均一である場合にのみ正確です。撮像中に均一な背景を得ることができない場合、転球半径を用いた背景減算を使用して不均一な照明を補正したり、ノイズを除去するために中央値またはガウスフィルタを使用してフィルタリングしたり、機械学習ベースの技術20,31を用いるなど、31他の画像処理技術を用いることができる。
結論として、微視的移動物体の面積を画像化し、計算するための高速イメージングおよび解析プロトコルを提示する。我々は、超音波スケーラーの周りにキャビテーション気泡をイメージングすることによって、この方法を実証しました。それはエンドドンティックファイルのような他の歯科器具のまわりのイメージ投機のために使用することができ、他の非歯科バブルのイメージ投射の適用のために容易に合わせることができる。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、工学物理科学研究評議会EP/P015743/1からの資金提供に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25x attachment | Navitar | 1-50011 | |
| 12x with 12mm fine focus Long distance microscope zoom lens |
Navitar | 1-50486 | |
| 2x adaptor with f mount | Navitar | 1-62922 | |
| Cavitron Plus Ultrasonic Scaler | Dentsply Sirona | 8184003 | |
| Cavitron Ultrasonic Insert FSI 1000FSI 1000 | Dentsply Sirona | UCAFTHD | |
| Fibre light guide. 8mm fibre bundle 1500mm length. Focussing lens assembly for Hayashi light, 1/4"-20 tripod thread for mounting. |
Hayashi | LGC1- 8L1500 |
|
| Geared head | Manfrotto | MN405 | 7.5kg load capacity |
| HDF7010 High-Power LED Endoscope light source. 150W LED provides cold output equivalent to 250W Xenon. |
Hayashi | LA-HDF710 | |
| Heavy weight Tripod | Manfrotto | MN475B | Geared centre column, 12kg load capacity |
| High Speed Camera | Photron | 103526 | FASTCAM Mini AX200 900K M3 (16GB memory) |
| High-Precision Rotation Stage | Thorlabs | PR01/M | |
| Laboratory jacks | Camlab | 1194083 | |
| Micropositioning sliding plate | Manfrotto | SKU 454 | |
| Micropositioning stage 3D | Thorlabs | PT3/M | |
| Micropositioning stage rotation | Thorlabs | OCT-XYR1/M | OCT-XYR1/M - XY Stage with Solid Top Plate |
| NEWTRON P5 XS Ultrasonic Scaler | Acteon | F62118 | |
| Ultrasonic Insert 10P | Acteon | F00253 |
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