Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

גישה לציטוטוקסיות ולתגובת התא לביו-חומרים

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/61512
Automatic Translation
*1,2,3,4, *2,3,4,5, 1,2,3,4, 2,3,4,5, 2,3,4,6, 2,3,4,6, 2,3,4,7, 2,3,4,5, 1,2,3,4,8, 1,2,3,4
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal
* These authors contributed equally

Summary

מתודולוגיה זו שואפת להעריך ציטוטוקסיות של חומרים ביולוגיים באמצעות הכנת תמציות מסיסות, תוך שימוש במבחני כדאיות וניתוח פנוטיפי, כולל ציטומטריית זרימה, RT-PCR, אימונוציטוכימיה וטכניקות ביולוגיה תאית ומולקולרית אחרות.

Abstract

ביו-חומרים באים במגע ישיר או עקיף עם רקמות האדם, ולכן חשוב להעריך את ציטוטוקסיותו. הערכה זו יכולה להתבצע במספר שיטות, אך קיים פער גבוה בין הגישות בהן נעשה שימוש, מה שפוגע ביכולת השחזור וההשוואה בין התוצאות המתקבלות. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול להערכת ציטוטוקסיות של ביו-חומרים באמצעות תמציות מסיסות, שבהן אנו משתמשים עבור ביו-חומרים דנטליים. הכנת התמציות מפורטת, החל מייצור הכדוריות ועד מיצוין במדיום תרבית. הערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרים מבוססת על פעילות מטבולית באמצעות בדיקת MTT, כדאיות התא באמצעות בדיקת Sulphorhodamine B (SBR), פרופיל מוות תאי באמצעות ציטומטריית זרימה, ומורפולוגיה של התא באמצעות May-Grünwald Giemsa. בנוסף להערכת ציטוטוקסיות, פרוטוקול להערכת תפקוד התא מתואר בהתבסס על ביטוי של סמנים ספציפיים המוערכים על ידי אימונוציטוכימיה ו- PCR. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לציטוטוקסיות של ביו-חומרים ולהערכת השפעות תאיות, תוך שימוש במתודולוגיית התמציות, באופן ניתן לשחזור וחזק.

Introduction

תאימות ביולוגית יכולה להיות מוגדרת כיכולת של חומר לשלב רקמות ולגרום לתגובה טיפולית חיובית, ללא נזקים מקומיים וסיסטמיים 1,2,3. הערכת תאימות ביולוגית חיונית לפיתוח כל חומר המיועד לשימוש רפואי. לכן, פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית ומקיפה לכל חוקר השואף לפתח ביו-חומרים חדשים או לחקור יישומים חדשים לביו-חומרים קיימים.

בדיקות ציטוטוקסיות במבחנה נמצאות בשימוש נרחב כשלב הראשון להערכת תאימות ביולוגית, באמצעות תרביות תאים ראשוניות או קווי תאים. התוצאות מהוות אינדיקטור ראשון ליישום קליני פוטנציאלי. מלבד היותה חיונית לפיתוח ביו-חומרים, בדיקה זו היא חובה כדי לעמוד בתקנות הנוכחיות להחדרת שוק, מהרגולטורים של EUA והאיחוד האירופי (אישור FDA ו- CE) 4,5,6,7,8. יתר על כן, בדיקות סטנדרטיות במחקר ביו-רפואי מספקות יתרון משמעותי במונחים של שחזור והשוואת תוצאות ממחקרים שונים על ביו-חומרים או מכשירים דומים9.

הנחיות ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) נמצאות בשימוש נרחב על ידי מעבדות מסחריות, רגולטוריות ואקדמיות עצמאיות רבות לבדיקת חומרים באופן מדויק וניתן לשחזור. ISO 10993-5 מתייחס להערכת ציטוטוקסיות חוץ גופית ודוחות ISO 10993-12 להכנת דגימה10,11. לבדיקות ביו-חומרים ניתנות שלוש קטגוריות, שייבחרו בהתאם לסוג החומר, רקמות המגע ומטרת הטיפול: תמציות, מגע ישיר ומגע עקיף 8,11,12,13. תמציות מתקבלות על ידי העשרת מדיום תרבית תאים עם החומר הביולוגי. עבור בדיקות מגע ישיר, החומר הביולוגי ממוקם ישירות על תרביות התא, ובמגע עקיף, הדגירה עם התאים מתבצעת מופרדת על ידי מחסום, כגון ג'ל אגרוז11. בקרות מתאימות הן חובה, ויש לבצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים 5,8,10,11,14.

זה קריטי לדמות או להגזים בתנאים קליניים כדי לקבוע את הפוטנציאל ציטוטוקסי. במקרה של בדיקת תמציות, שטח הפנים של החומר;  הנפח הבינוני; המדיום וה- pH החומרי; מסיסות החומר, האוסמולריות ויחס הדיפוזיה; ותנאי המיצוי כגון תסיסה, טמפרטורה וזמן משפיעים על מעשרת המדיה5.

המתודולוגיה מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של ציטוטוקסיות של מספר פורמולציות פרמצבטיות, הן מוצקות והן נוזליות. ניתן לבצע מספר בדיקות, כגון בדיקת ספיגה אדומה ניטרלית, בדיקת היווצרות מושבה, בדיקת MTT ובדיקת XTT 5,10,14.

רוב מחקרי הערכת ציטוטוקסיות שפורסמו משתמשים בבדיקות פשוטות יותר, כלומר MTT ו- XTT, המספקות מידע מוגבל. הערכת תאימות ביולוגית צריכה לכלול לא רק הערכה של ציטוטוקסיות אלא גם פעילות ביולוגית של חומר בדיקה נתון2, כפי שפרוטוקול זה מאשר. יש להשתמש בקריטריונים נוספים להערכה כאשר הם מוצדקים ומתועדים. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לספק מדריך מקיף, המפרט סדרה של שיטות להערכת ציטוטוקסיות ביו-חומרית. חוץ מזה, הערכה של תהליכים תאיים שונים, כלומר סוג של מוות התא, מורפולוגיה של התא, תפקוד התא בסינתזה של חלבונים ספציפיים, וייצור רקמות ספציפיות, מתוארים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת כדורים

  1. הכינו את תבניות הפוליוויניל כלוריד (PVC) על ידי ביצוע חורים בצורת עיגול בממדים ידועים בלוחות PVC.
    הערה: ניתן לייצר יציקות PVC בגדלים שונים. חשב את משטח המגע של תבניות PVC, באמצעות הנוסחה A = h (2πr) + 2πr2 (r: רדיוס הצילינדר; h: גובה הצילינדר).
  2. הכינו את החומר הביולוגי לבדיקה על פי הוראות היצרן וקרוב ככל האפשר לתחילת הניסוי.
    הערה: להכנת ביו-חומרים של נוסחת הדבק/הדבקה, כמות מספקת של משחת בסיס וזרז מעורבבים ידנית עם מרית ערבוב. עבור חומרים אחרים המבוססים על פורמולציות נוזל ואבקה, יש לבצע מרייה ידנית או ערבוב מכני עם רטט, בהתאם להוראות היצרן או בהתאם לחומרים חדשים. עבור חומרים נוזליים, שלב זה אינו הכרחי. הפעל את הפרוטוקול בשלב 2.
  3. מניחים את החומר הביולוגי על התבניות עם מרית ונותנים להם להגדיר את הזמן המתאים.
    הערה: זמן ההגדרה ותנאי ההגדרה של החומרים הביולוגיים חייבים להתאים להוראות היצרן או המתאימים לחומרים חדשים.
  4. לאחר ההגדרה, מוציאים את כדורי החומר הביולוגי מתבניות ה-PVC ומניחים אותם במיכל (ניתן להשתמש בצלחת 6 בארות או צלחת פטרי).
  5. יש לעקר את הכדוריות על ידי הנחתן תחת מנורת אור אולטרה סגול (UV) למשך 20 דקות לכל צד.

2. השגת תמציות הביו-חומרים

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים קפדניים.

  1. קבע את המספר הדרוש של כדורים על ידי חישוב שטח הפנים של הגלולה בהתבסס על הנוסחה המתוארת ב -1.1.
    הערה: כערך ייחוס, שטח הפנים של המגע של 250 מ"מ2/מ"ל11,15 מושג על ידי הוספת 9 כדורים (ח 3 מ"מ x גובה 1.5 מ"מ) לכל מ"ל של המדיום.
  2. הכינו את התמציות המסיסות (תמצית מועשרת בחומר הביולוגי).
    1. מניחים את הכדוריות בצינור 50 מ"ל ומוסיפים את המקביל של מדיום תרבית התא. מניחים את הצינורות למשך 24 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37°, בסיבוב קבוע.
      הערה: השתמש במדיום תרבית התאים המתאים לתרביות תאים.
    2. לאחר 24 שעות, להסיר את הצינורות מן האינקובטור. בשלב זה, התמציות מתאימות לריכוז של 1/1 או 100%.
    3. בצע דילול של התמצית על ידי הוספה רציפה של נפחים שווים של מדיום מותנה למדיום תרבית התא.
      הערה: אין לבצע התאמת pH למדיה.
      1. הוסף 1 מ"ל של מדיה תרבית 1 מ"ל של 100% תמצית כדי לקבל 50% תמצית. הוסף 1 מ"ל של אמצעי תרבית ל-1 מ"ל של 50% תמצית כדי לקבל תמצית של 25%, וכן הלאה (איור 1).
        הערה: השתמש בריכוזים שנמצאו רלוונטיים לכל תרכובת.

Figure 1
איור 1: סכימת ההכנה והדילול של תמציות מסיסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. דגירה של תאים עם תמציות הביו-חומרים

  1. הכינו תרחיף תאי וצלחו אותו במיכל תאים מתאים, כגון צלחת מרובת בארות, בהתאם למספר התאים הדרושים לניסויים.
    1. התחל עם בקבוק של התאים הרצויים עם 80% עד 90% מפגש.
    2. יש להשליך את מצעי תרבית התא, לשטוף בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ולנתק את התאים עם טריפסין-EDTA (1 עד 2 מ"ל עבור בקבוק תרבית תאיםבגודל 75 ס"מ).
    3. מוסיפים את מצע תרבית התאים (2 עד 4 מ"ל לצלוחית תרביתתאים בגודל 75 ס"מ), מעבירים את תרחיף התא לצינור וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. להשעות את הגלולה בנפח ידוע של מדיה תרבית תאים.
      הערה: פרוטוקול זה מיועד לשימוש בתרביות תאים דבקים; עם זאת, ניתן לבצע התאמות פשוטות לעבודה עם תרביות תאי תרחיף.
    5. לספור את התאים בהמוציטומטר ולחשב את ריכוז התא של השעיית התא.
    6. להשעות את הסכום שנקבע של השעיית התא במדיום תרבית ולהעביר מנות multiwell. כערך ייחוס לצפיפות הזריעה, שקול 5 – 20 x 105 תאים/ס"מ2.
      הערה: יש לחשב את מספר התאים המתאים בהתאם לסוג התא ולמאפייני התא, כלומר זמן הכפלת התא.
  2. לדגור על התאים במשך 24 שעות כדי לאפשר הידבקות תאים.
  3. לאחר תקופה זו, יש להעביר את התמציות המסיסות לצלחות התרבית.
    1. שאפו למדיום תרבית התא.
    2. מוסיפים את תמציות הביו-חומרים לכל באר, בהתאם לרצף הריכוזים, כפי שתואר קודם לכן. הוסף מדיום תרבית תאים טרי לבארות הבקרה.
    3. לדגור על הצלחות במשך 24 שעות או יותר.
      הערה: יש לבצע בקרות שליליות בכל בדיקה, המתאימות לתאים לא מטופלים, הנשמרות במדיום התרבית. ניתן לבחור את זמני הדגירה בהתאם למטרות המחקר.

4. הערכת הפעילות המטבולית

  1. לאחר הדגירה התאית עם תמציות הביו-חומרים, שואפים את התווך מהצלחות ושוטפים כל באר PBS.
  2. מקם, בכל באר, את נפח נאות של 0.5 מ"ג / מ"ל 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazole bromide (MTT) מוכן PBS, pH 7.4.
  3. לדגור את הצלחות במשך 4 שעות או לילה בחושך ב 37 ° C.
  4. כדי להמיס את גבישי הפורמזן המתקבלים, מוסיפים את הנפח המתאים של תמיסת 0.04 מ 'של חומצה הידרוכלורית באיזופרופנול לכל באר ומערבבים צלחות במשך 30 דקות.
    הערה: התאם את כמות MTT ואיזופרופנול בהתאם לגודל הבארות.
  5. מערבבים ויוצרים הומוגניות של תכולת כל באר, במידת הצורך, על ידי צנרת מעלה ומטה עד שלא רואים גבישים.
  6. כמת את הבליעה באורך גל של 570 ננומטר באמצעות מסנן ייחוס של 620 ננומטר, בספקטרופוטומטר.
  7. כדי לחשב את הפעילות המטבולית, לחלק את ספיגת התאים המטופלים על ידי ספיגת תרביות הביקורת. כדי לקבל ערכי אחוזים, הכפל ב- 100.

5. הערכת מוות תאי

הערה: כדי לבצע הערכה זו, יש להשתמש במינימום של 106 תאים לכל תנאי.

  1. השתמש בצינורות צנטריפוגות שזוהו כראוי, בהתאם לתנאים המוערכים.
  2. לאחר הדגירה התאית עם תמציות הביו-חומרים, אספו את מצע התרבית לצינור המתאים.
  3. נתק את התאים והוסף את תרחיף התא לצינורות המתאימים.
  4. רכז את מתלי התא על ידי צנטריפוגה ב 120 x גרם במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את הכדורים עם PBS. הסר את PBS על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות.
  6. הוסף 1 מ"ל של PBS והעבר את כדורי התא לצינורות ציטומטריה מזוהים.
  7. הסר את PBS על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות.
  8. יש לדגור עם 100 מיקרוליטר של חיץ קושר (0.01 M HEPES, 0.14 mM NaCl ו-0.25 mM CaCl2)16, ולאפשר לתאים לנוח כ-15 דקות להתאוששות קרום התא.
  9. הוסף 2.5 μL של פלורסנט שכותרתו Annexin-V ו 1 μL של יודיד פרופידיום במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  10. לאחר הדגירה, להוסיף 400 μL של PBS ולנתח על ציטומטר. לצורך ניתוח וכימות המידע יש להשתמש בתוכנה מתאימה.
  11. הצג תוצאות כאחוז של תאים חיים, אפופטוזיס, אפופטוזיס מאוחר/נמק ונמק.

6. הערכת מורפולוגיה

  1. בחר את הגודל המתאים של כיסויי זכוכית מעוקרים המתאימים לצלחת multiwell.
  2. הניחו כל שקופית בבאר בעזרת פינצטה סטרילית.
  3. הפיצו תרחיף תאי בריכוז מתאים לתוך הבארות והניחו לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 95% אוויר ו-5% CO2.
  4. לחשוף את תרביות התאים לתמציות, כפי שתואר קודם לכן.
  5. לשאוף את התקשורת ולשטוף עם PBS.
  6. הניחו לכיסויים להתייבש בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו נפח מספיק של תמיסת מאי-גרינוולד כדי לכסות את הכיסויים; דוגרים במשך 3 דקות.
  7. מוציאים את הצבע ושוטפים במים מזוקקים למשך דקה.
  8. מוציאים את המים ומוסיפים נפח מספיק של תמיסת Giemsa כדי לכסות את הכיסויים; דוגרים במשך 15 דקות.
  9. יש לשטוף את הכיסויים במים זורמים.
  10. העבר את הכיסויים לשקופית.
  11. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ. צלם את התמונות עם ההגדלה שנבחרה.

7. הערכת תפקוד התא באמצעות תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור (RT-PCR)

הערה: כדי לבצע הערכה זו, יש להשתמש במינימום של 2x106 תאים לכל תנאי. לדוגמה, phosphatase אלקליין מוצג כגן של עניין עבור הערכת פעילות odontoblasts. גנים מעניינים אחרים ניתן לראות בטבלה 1.

  1. לוחית את התאים כמתואר לעיל.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז התאים המצופים, בהתאם לסוג התא ולציטוטוקסיות של הביו-חומרים הנחקרים.
  2. לדגור עם תמציות מסיסות, כמתואר לעיל.
  3. נתק את התאים כדי לקבל תרחיף כפי שתואר קודם.
  4. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS; עבור צנטריפוגה זו ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. למרוח את התאים על ידי השעיית הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת טיהור RNA (למשל, NZYol), ערבוב אינטנסיבי ופיפטינג עוקב.
  6. לדגור על הדגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. הוסף 200 μL של כלורופורם ונער את הצינורות ביד במשך 15 שניות.
  8. דוגרים במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. צנטריפוגה lysates ב 4 ° C במשך 15 דקות ב 12,000 x גרם. במהלך צנטריפוגה זו, שני שלבים מקורם בדגימה, ומשאירים את הרנ"א בשלב המימי (העליון).
  10. הסר את הפאזה המימית לצינור חדש והוסף 500 μL של איזופרופנול קר כדי לזרז RNA.
  11. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות וצנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  12. הסר את supernatant ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של אתנול 75% על ידי צנטריפוגה ב 7,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  13. יבשו את הגלולה בטמפרטורת החדר עד להתאדות האתנול.
  14. מרחפים במים נטולי RNase.
  15. לכמת ולקבוע את דרגת הטוהר של הדגימות באמצעות ספקטרופוטומטריית בליעה, באורכי גל 260 ננומטר ו 280 ננומטר. קבע את טוהר הרנ"א והשתמש בדגימות עם יחס טוהר (A260/280) סביב 2.0.
  16. חנות דוגמאות ב -80 ° C.
  17. המשך לבצע RT-PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן17.
    הערה: בהתאם למטרת המחקר, בחר את הסמנים הספציפיים להערכה.

8. הערכת תפקוד התא באמצעות זיהוי חלבונים

הערה: בהתאם למטרת המחקר, בחר את החלבונים הספציפיים שיש להעריך. לדוגמה, דנטין סיאלופרוטאין (DSP) מוצג כחלבון בעל עניין להערכת פעילות אודונטובלסטים. חלבונים מעניינים אחרים ניתן לראות בטבלה 1.

  1. תרבית תאים בכיסויים וחשופה לתמציות, כפי שתואר קודם.
  2. שטפו את תרביות התאים עם PBS.
  3. יש לתקן עם 3.7% פרפורמאלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
  5. חדיר עם 0.5% טריטון ב- PBS למשך 15 דקות.
  6. חסום את הפרוקסידז עם 0.3% מי חמצן ב- PBS למשך 5 דקות.
  7. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
  8. יש לשטוף פעמיים עם אלבומין 0.5% בסרום בקר (BSA).
  9. חסום תרביות תאים עם 2% BSA למשך 45 דקות.
  10. יש לשטוף עם 0.5% BSA ב-PBS.
  11. לדגור על תרביות עם הנוגדן הראשוני על פי החלבון שנבחר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בנוגדן הראשי DSP (M20) (1:100) ובנוגדן המשני Polyclonal Rabbit Anti-Goat immunoglobulins/HRP (1:100).
  12. יש לשטוף חמש פעמים עם 0.5% BSA ב-PBS.
  13. לדגור עם נוגדן משני במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בצע את דילול הנוגדנים באמצעות 0.5% BSA ב- PBS.
  14. יש לכבס חמש פעמים עם 0.5% BSA ב-PBS למשך דקה אחת בכל כביסה.
  15. לדגור על תרביות עם מצע ותערובת כרומוגנים בריכוז של 20 μL כרומוגן/מ"ל מצע במשך 25 דקות.
  16. יש לשטוף פעמיים עם 0.5% BSA ב-PBS.
  17. כתם נגדי עם Hematoxylin במשך 15 דקות.
  18. יש לשטוף ברצף של 0.037 מול/ליטר אמוניה ומים מזוקקים למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי צבע.
  19. הרכיבו את הכיסויים על המגלשות. השתמש בגליצרול כאמצעי הרכבה.
  20. יש לאפשר ייבוש למשך הלילה.
  21. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ. צלם את התמונות עם ההגדלה שנבחרה.

9. הערכת מינרליזציה באמצעות בדיקת Alizarin Red S

  1. הכינו תמיסת Alizarin Red S בריכוז של 40 mM18. מערבבים את הפתרון להומוגניזציה במשך 12 שעות בחושך.
    הערה: להכנת 100 מ"ל של תמיסת Alizarin Red S, יש להמיס 1.44 גרם אבקת אליזרין (משקל מולקולרי: 360 גרם/מול) במים טהורים במיוחד, מוגנים מפני אור. עבור פתרון זה, ערך ה- pH הוא קריטי וצריך להיות בין 4.1 ל -4.3.
  2. לדגור על תרבית תאים עם תמציות מסיסות, כמתואר לעיל.
  3. לשטוף תרביות תאים שלוש פעמים עם PBS.
  4. יש לתקן עם 4% פרפורמאלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  6. יש להכתים בתמיסת צביעה אדומה אליזרין למשך 20 דקות ב-37°C בחושך.
  7. לאחר הצביעה, שטפו את הצלחות עם PBS כדי להסיר את עודפי הצבע.
  8. הסתכלו מתחת למיקרוסקופ. צלם את התמונות עם ההגדלה שנבחרה.
  9. הוסיפו תמיסת מיצוי, המורכבת מ-10% חומצה אצטית ו-20% מתנול, לכל באר, ותנו לערבוב במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. מדוד את הבליעה באורך גל של 490 ננומטר בספקטרופוטומטר19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המייצגות כאן מתייחסות לחקר ביו-חומרים דנטליים. מתודולוגיית התמצית מאפשרת לקבל פרופיל ציטוטוקסיות ותפקוד תאים לאחר חשיפה לחומרים דנטליים, לגבי השפעות על פעילות מטבולית (איור 2), כדאיות התא, פרופיל מוות תאי ומורפולוגיה של התא (איור 3), וביטוי חלבונים ספציפיים (איור 4).

בדיקת MTT משמשת לקבלת סקירה מהירה של ציטוטוקסיות של החומרים בצורה פשוטה. ניתן לערוך השוואה בין שני חומרים או יותר (איור 2); ירידה חמורה בפעילות המטבולית, גם בריכוזים נמוכים (6.25%) ובינוניים (50%), מצביעה על רעילות גבוהה יותר (איור 2א). באותו הזמן, חומרים ציטוטוקסיים פחות מציגים רק הפחתה קלה יותר או ללא הפחתה כלל (איור 2b). השוואות בין נקודות זמן שונות מאפשרות לקבוע השפעות ציטוטוקסיות מיידיות יותר או בשלבים מאוחרים יותר.

השפעות על כדאיות התא מספקות מידע חשוב על הפחתת תאים בת קיימא, אשר עלולה לסכן את יכולת הרקמות להתאושש לאחר השפעה מזיקה. קביעת אחוז התאים בני קיימא מאפשרת להשוות ציטוטוקסיות חומרית; יותר חומרים ציטוטוקסיים גורמים למוות תאי גבוה יותר עבור אותו ריכוז (איור 3, a ו-3b). הפחתות גבוהות מ-30% הן קריטיות ומגדירות חומרים בסיכון לתאימות ביולוגית נמוכה (איור 3a). המידע הזה מושלם עם פרופיל מוות תאי (איור 3, a ו-3b). בתוצאות המייצגות, יותר חומרים ציטוטוקסיים מאופיינים בירידה מודגשת בכדאיות התא ובפרופיל של אפופטוזיס מאוחר ומוות תאי נמק (איור 3a), בעוד שפחות חומרים ציטוטוקסיים מציגים פחות מוות תאי ויותר פרופיל אפופטוטי ואפופטוטי מאוחר (איור 3b).

המידע המתקבל מהערכת המורפולוגיה התאית (איור 3c) משלים את הערכת כדאיות התא. שינויים מהמורפולוגיה האופיינית של התא יכולים להצביע על פרופיל אפופטוטי או נמק16. כמו כן, ניתן לקבל מידע נוסף מהפרוטוקול הזה, כמו תצפית על חלקיקי חומר (חיצים אדומים, איור 3C).

סמנים ספציפיים, בסיסיים לתפקוד התא, המושפעים מחשיפה לתמצית ניתנים להערכה במספר טכניקות, כמו אימונוהיסטוכימיה, PCR, ציטומטריית זרימה, כתמים או בדיקות קולורימטריות (טבלה 1). תוצאות מייצגות של ביטוי DSP לאחר חשיפה לתמציות מוצגות באיור 4a, וניתן לראות שחומרים מסוימים (טריקלציום סיליקט צמנט) מעוררים את התאים להגביר את ביטוי החלבון. לעומת זאת, אחרים (צמנטי סידן הידרוקסיד) מקדמים ירידה משמעותית בביטוי החלבון, ללא תלות באובדן הכדאיות. בשני המקרים, ריכוז התמציות משפיע ישירות על ביטוי החלבון.

בקו התאים MDPC-23 של פנוטיפ odontoblast, היווצרות של פיקדונות מינרליזציה אופייני. הפרוטוקול לזיהוי וכימות פיקדונות מינרליים מאפשר להעריך את הפונקציה הספציפית של סוג זה של תאים מיוחדים. במקרה המוצג, נצפה כי מלבד היותו פחות ציטוטוקסי, צמנט טריקלציום סיליקטים מגרה את תפקוד התא, לאחר שנצפתה עלייה במרבצי מינרלים (איור 4b). להיפך, צמנט סידן הידרוקסידי ציטוטוקסי יותר הוביל לשקיעת מינרלים מופחתת עקב פגיעה בתאים ומוות (איור 4b). בנוסף להערכה איכותנית, ניתן לבצע קביעה כמותית (איור 4ג).

Figure 2
איור 2: פעילות מטבולית. פעילות מטבולית של תאי MDPC-23 שטופלו במלט סידן הידרוקסידי [a)] ובמלט סיליקט טריקלציום [b)] תמציות מסיסות במשך 24, 72 ו-120 שעות. התוצאות מנורמלות לתרביות תאי הביקורת, עם ערך של 100%. הבדלים משמעותיים מיוצגים על ידי *, כאשר * פירושו p<0.05, ** פירושו p<0.01, ו- *** פירושו p<0.001. חלק מאיור זה שונה מפרסום קודם באישור המו"ל20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כדאיות התא, פרופיל המוות ומורפולוגיה של התא. כדאיות התא, פרופיל מוות תאי ומורפולוגיה של התא בתאי MDPC-23 הנתונים לטיפול בביו-חומרים של סידן הידרוקסיד וטריקלציום סיליקט בריכוז של 6.25% ו-50%, לאחר 120 שעות של חשיפה. א) ו-ב) התוצאות מסומנות כאחוז התאים החיים באפופטוזיס, אפופטוזיס מאוחר או נמק, ונמק. הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה או בין תנאים מיוצגים עם *, כאשר * פירושו p <0.05, ** פירושו p <0.01, ו- *** פירושו p <0.001. ג) תאים מוכתמים ב- May-Grünwald Giemsa לאחר טיפול בריכוז של 50% תמציות מסיסות ביו-חומרים. קבוצת הביקורת מייצגת תאים בתרבית DMEM עם 10% FBS. התמונות בעמודה השמאלית התקבלו בהגדלה של פי 100, והתמונות בטור מימין התקבלו בהגדלה של פי 500. פסי איור מייצגים 100 מיקרומטר. חלק מאיור זה שונה מפרסום קודם באישור המו"ל20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ביטוי DSP והיווצרות גושים מינרליים. א) תאי MDPC-23 שסומנו על ידי אימונוציטוכימיה לזיהוי ביטוי DSP כאשר הם נתונים לטיפול בסידן הידרוקסידי וטריקלציום סיליקט בריכוזים של 50% ו-6.25% לאחר 96 שעות דגירה. ב) תמונות מתאי MDPC-23 בתרבית המוכתמים בכתם Alizarin Red S כאשר טופלו בביו-חומרים של סידן הידרוקסיד וטריקלציום סיליקט בריכוזים של 50% ו-6.25% לאחר 120 שעות דגירה. כל הצילומים התקבלו בהגדלה של פי 100. שני פסי האיור מייצגים 150 מיקרומטר. ג) היווצרות משקעי סידן מתאי MDPC-23 שטופלו בסידן הידרוקסידי וטריקלציום סיליקט לאחר 120 שעות של חשיפה. התוצאות הן היחס בין ספיגת הדגימות לבין הבקרה. הבדלים משמעותיים מיוצגים על ידי *, כאשר * פירושו p<0.05, ** פירושו p<0.01, ו- *** פירושו p<0.001. חלק מאיור זה שונה מפרסום קודם באישור המו"ל20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת סמני בידול/פונקציה אודונטובלסטיים47-79. טבלה זו מספקת רשימה של סמנים אודונטובלסטיים ושיטות זיהוי; חלק מסמנים אלה באים לידי ביטוי גם על ידי רקמות אחרות.

גן או חלבון שיטת הפניות
אלקליין פוספטאז (ALP) קולורימטריה 47 48
אימונוציטוכימיה 20 49
כתם צפוני 50
RT-PCR 51 52
דקורין (DCN) קולורימטרי אליסה 53
אימונוציטוכימיה 54 55
RT-PCR 53 56
חלבון מטריצת דנטין 1 (DMP-1) ציטומטריית זרימה 57
אימונוציטוכימיה 58 59
כתם צפוני 50 60
RT-PCR 47 49
כתם מערבי 50 60
חלבון מטריצת דנטין 2 (DMP-2) אימונוציטוכימיה 60 61
RT-PCR 50 62
כתם צפוני 60
כתם מערבי 62
דנטין פוספופרוטאין (DPP) אימונוציטוכימיה 63
כתם צפוני 63
דנטין סיאלופרוטאין (DSP)* אימונוציטוכימיה 20 60
כתם צפוני 60 63
RT-PCR 50
כתם מערבי 64 65
דנטין סיאלופוספופרוטאין (DSPP) ציטומטריית זרימה 57
אימונוציטוכימיה 66 54
RT-PCR 47 49
כתם צפוני 67 68
כתם מערבי 64 62
Enamelysin/מטריקס Metalloproteinase-20 (MMP-20) כתם צפוני 68
RT-PCR 49 68
נסטין אימונוציטוכימיה 54 69
RT-PCR 70 71
כתם מערבי 72
אוסטאואדהרין (OSAD) אימונוציטוכימיה 73 74
כתם צפוני 73
RT-PCR 75
כתם מערבי 73 74
אוסטאופונטין (OPN) אימונוציטוכימיה 76
כתם צפוני 50
RT-PCR 66 51
כתם מערבי 77
אוסטיאוקלצין (OCN) אימונוציטוכימיה 52
כתם צפוני 50
RT-PCR 51 52
כתם מערבי 77 78
Osterix (OSX) / גורם תמלול Sp7 (Sp7) אימונוציטוכימיה 54 58
RT-PCR 78
כתם מערבי 78 79
גן מווסת פוספט עם הומולוגיות לאנדופפטידאזות על כרומוזום X (Phex) כתם צפוני 68
RT-PCR 49 68
כתם מערבי 79
גורם שעתוק הקשור ל- Runt 2 (Runx2) אימונוציטוכימיה 66 52
RT-PCR 66 70
כתם מערבי 62 77
*DPP ו-DSP הם מוצרי המחשוף של DSPP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה תוכנן תוך התחשבות ב- ISO 10993-5, המתייחס להערכת ציטוטוקסיות במבחנה של ביו-חומרים הבאים במגע עם הרקמות, כדי להעריך את התאימות הביולוגית ולתרום לשכפול מחקרים21. זהו חשש גובר במדע, ומחברים רבים כבר עוקבים אחר המלצות אלה בתכנון הניסוי של מחקריהם במבחנה 15,22,23,24,25,26,27,28.

המתודולוגיה המוצעת נבחרה כדי לסנן את ההיבטים הרלוונטיים ביותר של ביולוגיה של התא. לפיכך, פרוטוקול זה חורג מההמלצות, ברגע שהוא מספק גישה מלאה להערכת ציטוטוקסיות באמצעות בדיקות נפוצות והערכה משלימה, כולל מספר פרמטרים של התא מפנוטיפ לתפקוד. הערכה משלימה זו חשובה כדי להעריך באמת את אפקט הביו-חומרים, כאשר הכדאיות עשויה שלא לתרגם שינויים ברמת ביטוי גנים וחלבונים, מחזור התא או הפרשה.

לתמציות יש יתרון, במיוחד בקווי תאים דבוקים, מכיוון שאין הפרעה להיצמדות התא למצע ולתנאי תרבית אופטימליים, בניגוד לחלק מגישות המגע הישיר שבהן חומרים מונחים על פני לוח התרבית22,28.

יתר על כן, תמציות מאפשרות חשיפה של תאים לריכוזים שונים29, ומחקה דיפוזיה של חומרים ברקמות, המדמה את הפינוי שהם עוברים in vivo, במיוחד כאשר הם מיושמים במגע עם רקמות מושקות מאוד. בדיקות מגע ישיר עשויות שלא להעריך במדויק ריכוזים שונים, ובדיקות מגע עקיף הדגימו קשיים פוטנציאליים עם אי-דיפוזיה, דיפוזיה חלקית דרך ממברנות, או תגובה עם אגר.

בדיקות המספקות הערכה כמותית מועדפות, כאשר הפחתת כדאיות התא ביותר מ -30% נחשבת ציטוטוקסית11,30. בפיתוח ביו-חומרים חדשים, אם מתרחשת הפחתה כזו, היא קובעת את הצורך בניסוח מחדש או נטישה. אם מושגות תוצאות מעודדות, יש לבצע מחקרים נוספים החוזים הערכה in vivo29,31.

בדיקות חוץ גופיות צריכות לדמות או להגזים בתנאים הקליניים. לפיכך, קביעת יחסי נפח פני השטח המתאימים להכנת התמצית היא קריטית. הוצעו יחסי שטח לנפח של 1.25–6 ס"מ2/מ"ל. במקרה של חומרים עם חריגות פני השטח כמו קצף, 0.1-0.2 גרם/מ"ל או 6 ס"מ 2/מ"ל הם נקודת התחלה: 15,20,2. היחס של 250 מ"מ2למ"ל של מדיום שימש בתוצאות מייצגות ששימשו בפרוטוקול זה ובמחקרים אחרים15,20.

גם אם לא נעשה שימוש בדרך זו במרפאות, הדגימות חייבות להיות מעוקרות בשיטות שאינן משנות את תכונותיהן. הקרנת UV היא לעתים קרובות בחירה טובה. זה בעל חשיבות עליונה למניעת זיהום מיקרוביאלי של תרביות תאים 11,24,32.

אמצעי המיצוי כוללים מדיום תרבית תאים עם או בלי סרום, תמיסת מלח פיזיולוגית, דימתיל-סולפוקסיד או מים מטוהרים, שנבחרו על פי המאפיינים הכימיים של ביו-חומרים11,33. במכוון למחקרי תרביות תאים, השימוש במדיום תרבית התאים מועדף מכיוון שהוא נמנע משלבי עיבוד נוספים. יש להתאים את תנאי החילוץ למודל הניסויי. בתוצאות המייצגות המוצגות בפרוטוקול זה, נעשה שימוש במדיום תרבית DMEM בתוספת FBS במשך 24 ± שעתיים ב 37 ± 1 °C (75 °F).

ביו-חומרים מסוימים עשויים להשאיר שאריות באמצעי המיצוי, אשר עשויים להשפיע לרעה על תרביות התא. בעוד סינון וצנטריפוגות יש להימנע, אפשרות היא לאפשר לחלקיקים לשקוע לפני השימוש. בעיה נוספת היא ה- pH שעלול לסבול משינוי לאחר החילוץ. מכיוון שלא מומלץ לבצע התאמות נוספות11, יש למדוד, לרשום את ה- pH של התמציות ולכלול בקרות נוספות לבידוד אפקט ה- pH בתכנון הניסוי במידת הצורך.

בעוד פרוטוקול זה תואר עבור תרביות תאים דבקים, ניתן לבצע שינויים פשוטים כדי להשתמש בתרביות תרחיף. באופן דומה, מלבד שימוש בביו-חומרים מוצקים, ניתן להתאים את ההליך, למעשה את שלבי המיצוי, לחקר נוזלים, ג'לים או קצפים34,35,36,37.

הכנת תרביות תאים בצפיפות מתאימה היא קריטית, במיוחד בתרביות תאים עם שיעור שכפול גבוה31. על פי טווח צפיפות הזריעה המומלץ של התאים המשמשים, אם מתוכננות דגירות ארוכות, יש לבצע את הפחתת צפיפות הזריעה הראשונית כדי למנוע את הבעיות הקשורות למפגש יתר. בנוסף, חומרים ציטוטוקסיים מאוד עשויים לדרוש צפיפות זריעה ראשונית גבוהה יותר.

מלבד היתרונות של מתודולוגיית החילוץ, היא אינה הבחירה הטובה ביותר עבור חומרים שבהם הערכת היצמדות התא רלוונטית. במקרה זה, יש לבצע את מחקרי הקשר הישיר 38,39,40,41. למרות שמדובר בגישה מקיפה, חשוב לזכור שמדובר בהערכה חוץ גופית, שאינה משקפת לחלוטין את תנאי in vivo42.

חומר ביולוגי צריך לא רק לגרום נזק לרקמה, אלא לעורר חלק מהתהליכים האנטי דלקתיים והאימונומודולנטיים43,44,45,46. לפיכך, פרוטוקול זה הולך רחוק יותר, עם הערכה של מנגנונים תאיים, כולל כדאיות התא פרופיל מוות תאי, כמו גם מנגנונים אחרים של סינתזת חלבונים. ההערכה המבוצעת צריכה לאפשר מסקנה על הפעילות הביולוגית של החומר הביולוגי ברקמות חיות, מלבד ציטוטוקסיות.

עם התפוצצות של חומרים חדשים עבור יישומים רפואיים, לא רק עבור רפואת שיניים אלא גם עבור אורתופדיה, כירורגיה, עיניים, קרדיולוגיה, וכו ', הבדיקות הראשוניות צריך להיעשות באופן שיטתי. פרוטוקול זה עשוי להיות כלי חשוב עבור חוקרים השואפים לפתח ולאפיין ביו-חומרים חדשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לגורמים הבאים על התמיכה: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB ממומן על ידי קרנות לאומיות באמצעות FCT (הקרן למדע וטכנולוגיה) באמצעות הפרויקט האסטרטגי UIDB/04539/2020 ו- UIDP/04539/2020 (CIBB). אנו מודים לז'אק נור, בית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת מישיגן, על אספקת קו התאים MDPC-23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234 (2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255 (2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425 (2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854 (2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884 (2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113 (2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184 (2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17 (2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153 (2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382 (2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

Tags

Retraction גיליון 173 תאימות ביולוגית ביו-חומרים תרבית תאים ציטוטוקסיות מדיום מותנה תמציות
גישה לציטוטוקסיות ולתגובת התא לביו-חומרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho,… More

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho, A. S., Abrantes, A. M., Gonçalves, A. C., Sarmento-Ribeiro, A. B., Ferreira, M. M., Botelho, M. F., Marto, C. M., Carrilho, E. Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials. J. Vis. Exp. (173), e61512, doi:10.3791/61512 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter