Summary
이 프로토콜의 전반적인 목표는 Plasmodium falciparum 감염에 자연적으로 드러나는 개인의 혈장 또는 혈장에 존재하는 항체의 용량을 측정하는 방법에 대한 지침을 제공하여 기생충에 감염된 적혈구 (IEs)의 phagocytosis를 opsonize 및 유도하는 것입니다.
Abstract
이 프로토콜은 VAR2CSA에 특이적으로 획득한 IgG 항체에 의해 불투명화된 플라스모듐 팔시파룸-감염된적혈구(IEs)의 유동 세포측정 기반 phagocytosis 분석법을 설정하고 실행하는 방법을 설명합니다. VAR2CSA는 태반 말라리아 (PM)라고 불리는 임산부에서 심각한 형태의 말라리아를 일으킬 수있는 태반에서 IEs의 선택적 격리를 매개하는 기생충 항원입니다. PM으로부터의 보호는 태반 격리를 억제하고/또는 phagocytosis에 대한 IEs를 오손화하여 기능하는 것으로 여겨지는 VAR2CSA 특이적 항체에 의해 매개됩니다. 분석은 VAR2CSA, 자연스럽게 획득된 PM 특이적 면역을 가진 여성의 플라즈마/혈청 항체, 그리고 식세포주 THP-1을 발현하기 위해 시험관에서 선택된 후기 단계 동기화 IE를 채용한다. 그러나, 프로토콜은 자연 노출에 의해 유도되거나 예방 접종에 의해 유도되든 IE 표면에 존재하는 모든 기생충 항원에게 항체의 기능을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 분석은 말라리아에서 항체 매개 면역의 중요한 기능적 측면의 좋은 재현성을 가진 간단하고 높은 처리량 평가를 제공합니다. 따라서, P. falciparum 말라리아에 임상 면역을 평가할 때 유용, 열대에서 이환율과 사망의 주요 원인, 특히 사하라 사막 이남의 아프리카에서.
Introduction
말라리아는 플라스모듐속의 5개의 다른 종을 가진 감염시 인간에서 생기는 벡터 매개 질병입니다. 가장 널리 퍼진 종은 P. falciparum,또한 가장 이환율과 사망률에 대 한 책임은1. 말라리아 임상 프리젠 테이션은 무증상 또는 양성 감염에서 복잡 / 심한 질병에 이르기까지 다양하며, 후자는 5 세 미만의 어린이에서 주로 발생합니다. P. falciparum에 노출은 멸균 면역을 유도하지 않습니다, 그러나 풍토성 지역에 사는 개별은 천천히 임상 질병에 대하여 면역을 개발합니다. 보호는 나이/노출에 따라 다르며 면역은 일반적으로 생활의 첫번째 5-10 년 도중취득됩니다 2. 성인 여성은 태반 말라리아 (PM)로 알려진 임상 프리젠 테이션에서 임신 중에 심각한 말라리아가 발생할 수 있기 때문에 중요한 예외입니다. PM은 낙태, 사산, 조산, 저출산, 태아 사망 및 모계 빈혈의 중요한 원인입니다. PM에 대한 저항은 연속 임신3을통해 개발됩니다. PM으로부터의 보호는 VAR2CSA 형 PfEMP14,5,5콘드로이틴 황산염 A(CSA)에 결합하는 감염된 적혈구(IE) 표면 항원에 대한 항체의 획득과 관련이 있어 태반에서 IE 격리를 가능하게 한다. 항체 중재 보호는 phagocytosis를 유도하기 위하여 IEs의 편화를 포함하여 각종 기능적 활동(6,,7에서검토)를 능력을 발휘합니다. 초기 시험관내 연구는 항체가 phagocytosis 를 통해 단핵구의 존재에 있는 P. falciparum 성장을 제한할 수 있다는 것을 보여주었다8,,9. 최근 연구에 따르면 식세포증유도 항체의 높은 수준은 더 나은 임신 결과(HIV 공동 감염의 맥락에서)10,,11로자연적으로 획득된 면역 반응에서 이 이펙터 기능의 관련성을 나타내는 것으로 나타났습니다.
여기서 우리는 단핵선 THP-1과 함께 VAR2CSA를 발현하는 체외 배양 IE를 사용하여 인간 플라즈마/혈청에 존재하는 항체의 이 기능을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 분석법은,이전에11, 12,,1214,13,15,,15,16,17,,18을 사용했으며, 항체의 작은 볼륨을 사용하여 한 번의 실행에서 더 많은 수의 항체 시료를 테스트하고 지루하고 편향된 현미경 검사세계산을 피할 수 있기 때문에 이전 현미경 기반 프로토콜8에비해 개선되고 쉬운 접근법으로 간주됩니다. 분석이 여러 실험실에서 사용되었으며 실행은 충분히 간단하지만 신중한 계획과 준비가 필요하므로 상세한 프로토콜은 이전 경험이 부족한 실험실 및 연구자들에 의한 응용 프로그램을 허용합니다. 우리는, 예를 들어, VAR2CSA를 발현하는 말기 동기화 IEs를 사용하여 자연스럽게 PM 특이적 면역을 획득한 여성으로부터 수집된 혈청에 존재하는 항체로 오손화됩니다. 그러나, 프로토콜은 자연 노출에 의해 유도되거나 예방 접종에 의해 유도되든 IE 표면에 존재하는 모든 기생충 항원에게 항체의 기능을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다.
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Protocol
여기에 제시된 결과에 사용되는 인간 혈청 샘플은 별도의연구(19)에서수집되었다. 수집은 가나 대학 의학 연구를위한 노구치 기념 연구소의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다 (연구 038/10-11), 지역 연구 윤리위원회에 의해, 덴마크의 수도 지역 (프로토콜 H-4-2013-083).
1. 기생충 문화
참고: 인간 병원균 취급에 대한 현지 규정을 따릅니다.
- 기생충 배양 배지에서20 이전에 설명된 표준 프로토콜에 따라 P. falciparum 기생충을 유지(재료표참조).
- 이전에 설명된21과같이 소르비톨 치료를 사용하여 기생충을 단단히 동기화하십시오.
- IE 의 표면에 VAR2CSA 발현을 보장하기 위해, 단백질 G-자기비드(G-magneticbeads 23)에 결합된 항VAR2CSA 항체(예를 들어, PAM1.4 항체, 교차 반응성 인간 단일클론 VAR2CSA-특이적 IgG22)를사용하여 반복된 면역 자기 선택을 수행한다.
- 간단히 말해서, 항 VAR2CSA 항체에 결합된 자기 구슬로 후기 단계 트로포조이트-IEs를 배양하고 자석을 사용하여 긍정적으로 선택하십시오.
- 기생충증이 적어도 5%가 될 때까지 몇 주기 동안 문화에서 선택된 기생충을 확장하십시오.
- 대안적으로, 이전에 설명된 바와 같이 플라스틱 고정 CSA(VAR2CSA수용체)에 결합하는 기생충을선택한다.
- 선택된 기생충에서 VAR2CSA 발현을 확인하려면 이전에 설명된25와같이 흐름 세포측정을 수행한다.
- 간단히 말해서, 자기 선택(Step 1.3)에 사용되는 동일한 항체를 가진 후기 단계 트로포조이트-IEs를 라벨로 지정한 다음 형광으로 표지된 이차 항체를 한다.
- 유동 세포측정에 의한 IE 표면 반응성 측정. 성공적인 항체 선택은 일반적으로 기생충의 대부분에 있는 VAR2CSA를 표현하는 기생충 인구 귀착됩니다 (≈80%).
- phagocytosis 분석의 경우, 정제 된 중간- 후반 단계 trophozoite-IEs를 사용. 앞서 설명한26과같이 자기 분리를 사용하여 정화를 수행한다.
참고: 기생충의 단계를 정확하게 결정하려면, 가벼운 현미경 관찰 뒤에 혈액 얼룩에 Giemsa 염색을 수행하십시오. 27이전에 설명된 표준 절차 및 형태학적 지침을 따르십시오. 후기 단계 정화는 밀도 그라데이션 매체를 사용하여 수행될 수도 있다. 그러나 IE 수율은 우리의 경험에서 낮기 때문에 자기 정화가 바람직합니다.- 자기 분리를 위해, 기생충 배양 (5-10% 기생충혈증)을 실온에서 10 분 동안 500 x g에서 회전시하십시오. 상체를 제거하고 기생충 배양 배지의 10mL에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
- 기생충 현탁액을 자석에 결합된 CS 열에 추가하고(재료 표참조) 열을 천천히 통과하게 합니다. Trophozoite-IE는 파라자성 (헤모조인의 존재로 인해)이며 컬럼 메쉬에 유지됩니다.
- 기생충 배양 배지의 50mL로 컬럼을 세척하고 기생충 배양 배지의 50mL를 사용하여 자기 컬럼으로부터 IEs를 엘로우.
- 실온에서 10 분 동안 500 x g에서 1.5.3에서 용액을 회전시하십시오. 조심스럽게 상체를 버리고 기생충 배양 배지의 1 mL에서 다시 중단하십시오.
- 혈종계를 사용하여, IEs의 수를 계산합니다 (어두운 혈진 색소를 가진 적혈구로 빛 현미경검사법에 의해 쉽게 확인) 및 최종 기생충을 계산하는 총 세포 수 (IEs의 백분율).
참고: 80% 이상의 순도(80% IEs)를 가진 기생충만 사용하십시오. - 테스트를 위해 계획된 혈청/항체 샘플의 수에 기초하여 필요한 총 양의 IEs를 추정하고 그에 따라 기생충 배양을 확장합니다. 75cm2 배양 플라스크는 25mL의 문화권이 5% 헤마토크릿과 5-10%의 기생충혈을 통해 96개의 웰 플레이트를 충분히 가동할 수 있도록 충분한 IEs를 산출해야 한다. 풀 플레이트(42개의 샘플+ 6개의 컨트롤을 복제)의 경우 최소 1.5mL 기생충 서스펜션이 3.3 x 107 IEs/mL에서 필요합니다.
2. THP-1 세포
참고: THP-1 세포주가 이 분석에서 사용됩니다. 이 단세포 세포주단일세포혈(28)을 가진 환자로부터28 유래되고 ATCC로부터 구입할 수 있다. THP-1 배양 배지에서 공급자의 지시에 따라 셀라인을 유지합니다(재료표참조).
- 정기적인 유지 보수를 위해, 세포 농도가 8 x 105 세포/mL에 도달할 때 2-4 x 105 세포/mL 및 서브 배양에서 THP-1 세포 배양을 시작합니다.
참고: 세포 농도가 1 x 106 셀/mL을 초과하고 통로 수를 추적하는 것을 허용하지 마십시오. 25항을 초과하는 세포의 사용을 피하십시오. THP-1 세포주 평균 두 배 시간은 19-50 h 사이다. phagocytosis 실험을 시작하기 전에 세포 배치의 두 배 시간을 결정합니다. 이것은 대략 시험될 혈청 견본의 결정된 수에 필요한 문화의 필요한 양을 추정하는 것을 도울 것입니다 (예를 들면, 전체 96 웰 플레이트에 대한, 5 x 105 세포/mL에 배양의 10 mL가 필요합니다). - 이전에 설명된바와같이 FCγ 수용체 I(CD64), II(CD32) 및 III(CD16)의 표면 발현을 위해 THP-1 세포를 주기적으로 확인한다.
- 간단히 말해서, THP-1 세포를 (별도로) 안티 CD64, 안티 CD32 및 반대로 CD16 형광 표시 항체(재료의 표)를실온에서 30 분 동안 (PBS에서 2 % FBS에서 제조).
- PBS에서 2% FBS로 세 번 세척하고 혈류 세포측정에 의한 표면 염색을 측정합니다.
참고: THP-1 세포는 CD16에 대해 음수이고 CD32 및 CD64에 대해 이전에 보고된29,,30(그림 1)에대해 양수이다.
- 식세포 분석의 경우, 실험 전날 2.5 x 105 세포/mL로 THP-1 세포 배양 플라스크를 설정하여 분석 당일 약 5 x 105 세포/mL을 산출합니다.
참고: 4-6 x 105 셀/mL이 분석 당일에 있는지 확인합니다.
3. 식세포 분석 (그림 S1)
- 분석서를 시작하기 전에, 블록 (>1 h) 두 라운드 하단 96 웰 플레이트 (공진화에 대한 하나 및 phagocytosis에 대한 다른) PBS에서 멸균 2 % FBS의 웰 당 150 μL을 사용하여.
참고: 라벨 플레이트 1을 공손화 플레이트로 사용하였으며 에티듐 브로마이드(EtBr) 염색 및 편화에 모두 사용하십시오. 라벨 플레이트 2는 식세포 판으로서 THP-1 세포 도금및 식세포 증스 플러니즈 에 모두 사용하십시오. - 기생충 염색 및 공화
- 1.6에서 제조된 IE 서스펜션을 복용하고 기생충 배양 배지 및 EtBr을 추가하여 세포 수를 3.3 x 107 IEs/mL로 조정하여 최종 농도를 2.5 μg/mL(0.1 mg/mL 스톡에서 1:40 희석)한다.
참고: EtBr은 기생충 DNA를 얼룩지게 하여 혈류 세포측정에 의한 검출을 허용합니다.
주의: EtBr은 돌연변이원및 피부, 눈 및 호흡기 자극제입니다. 적절한 보호를 사용하고 현지 규정에 따라 폐기물을 폐기하십시오. - 96개의 웰 플레이트(opsonization 플레이트) 중 하나에서 차단 용액을 제거하고 판을 깜박이고 타월 용지 위에 액체 과잉을 제거합니다.
- 플레이트의 상부에 위에서 준비된 IE 서스펜션의 웰당 30 μL을 추가합니다. 잘 비어 있고 기생충 배양 배지의 30 μL을 추가하십시오(THP-1 단독 제어를 위한 IEs 제외). (그림S2A). 실온에서 10분 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
- 기생충 배양 배지의 우물 당 170 μL을 추가합니다. 실온에서 3 분 동안 500 x g에서 접시를 회전하고 적절한 폐기물 용기에 접시를 가볍게하여 상퍼를 제거합니다.
- IEs를 2회 더 세척하여 실온에서 3분 동안 500 x g로 플레이트를 회전하는 기생충 배양 배지당 200 μL을 사용하여 세척합니다. 첫 번째 세척에서 상체는 접시를 가볍게 하여 제거 할 수 있습니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 제2 세척에서 상체를 조심스럽게 제거하여 전체 세척 매체를 제거합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 기생충 배양 배지에서 원하는 농도로 제조된 항체/플라즈마/혈청 용액의 30 μL에서 EtBr 표지 IEs를 다시 중단한다.
- 항상 다음컨트롤(도 S2B):IEs/THP-1 세포 제어(기생충 배양 배지) 없이 제어; 항체 또는 플라즈마/혈청이 없는 제어(조작되지 않은 제어); 1:100 희석에서 상업적으로 이용 가능한 토끼 항인간 적혈구 항체를 이용한 양성 대조군(재료표참조); 1:5 희석에서 두 개의 부정적인 플라즈마 / 혈청 제어 (말라리아 순진한 수영장과 말라리아 노출 남성에서 수영장); 그리고 1:5 희석에서 양성 혈청 대조군 (말라리아 노출 된 여성의 풀, 이전에 임신한 사람 (바람직하게는 멀티 그레이비대).
참고: 양성 제어를 위한 1:100 희석은 구입한 항체의 다른 배치에서 일관되게 작동하는 것처럼 보입니다(표시되지 않은 데이터). 그러나, 항체의 새로운 배치가 사용될 때마다 여러 희석을 테스트하여 배치 사이의 변이를 배제하는 것이 좋습니다. - 37 °C에서 어둠 속에서 45 분 동안 배양하십시오.
- 1.6에서 제조된 IE 서스펜션을 복용하고 기생충 배양 배지 및 EtBr을 추가하여 세포 수를 3.3 x 107 IEs/mL로 조정하여 최종 농도를 2.5 μg/mL(0.1 mg/mL 스톡에서 1:40 희석)한다.
- THP-1 세포 제제 및 식세포증
- IEs가 공손화되는 동안 (3.2.8), THP-1 세포를 준비하기 시작합니다.
- 배양 플라스크에서 THP-1 세포를 제거하고, 아래로 회전 (실온에서 5 분 동안 500 x g), 슈퍼 나탄을 데수및 THP-1 세포 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단.
- 다시 회전 (실온에서 5 분 동안 500 x g), 상체를 데수및 THP-1 세포 배양 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단.
- 위에서 준비한 용액에서 세포 수를 결정하고 5 x 105 세포/mL의 최종 농도를 얻기 위해 더 많은 배지를 추가합니다.
- 플레이트를 가볍게 하고 타월 종이 위에 액체 과잉을 제거하여 나머지 96 웰 플레이트(phagocytosis plate)에서 차단 용액을 제거합니다.
- 3.3.4로 제조된 THP-1 셀 서스펜션의 웰당 100 μL을 추가하고 세포 배양 인큐베이터(도S2C)에다시 넣습니다.
- 항체/플라즈마/혈청 배양 시간이 끝나면 기생충 배양 배지의 웰당 170 μL을 추가하십시오. 실온에서 3 분 동안 500 x g에서 접시를 회전하고 적절한 폐기물 용기에 접시를 가볍게하여 상퍼를 제거합니다.
- 기생충 배양 배지의 웰당 200 μL을 사용하여 2회 더 조리하고, 실온에서 3분 동안 500 x g로 플레이트를 회전시다. 첫 번째 세척에서 상체는 접시를 가볍게 하여 제거 할 수 있습니다. 두 번째 세척에서 상체를 조심스럽게 제거하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 전체 세척 매체를 제거합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 마지막으로 미리 따뜻워진 THP-1 세포 배양 배지의 100 μL에서 opsonized IEs를 다시 중단한다. 공손화된 IE 서스펜션 50 μL을 각 웰에 전달하여 식증 판에 놓습니다. 총 100μL의 IE가 있기 때문에 각 항체/혈청 희석은 식세포증플레이트(도 S2D)에서중복으로 실행할 수 있습니다.
참고: 분석에서 사용되는 IEs 및 THP-1 셀의 양은 10:1 비율에 해당합니다. - 37 °C, 5 % CO2에서어둠 속에서 40 분 동안 배양하십시오.
참고: 식세포증이 40분 이상 진행되는 것을 허용하지 마십시오. - 4°C(500 x g,5분)에서 원심분리로 식지세포증을 멈추고 판을 가볍게 하여 상류판을 폐기하십시오. 실온 암모늄 염화물 용액(재료 표)의150 μL을 추가하고 정확히 3 분 동안 배양, 배양하여 혼합합니다.
참고: 이 단계는 THP-1 세포에 의해 phagocytosed 되지 않은 적혈구를 lyse 것입니다. - PBS에 얼음 차가운 2 % FBS의 100 μL을 추가하여 용액을 중지하십시오. 4 °C (3 분 동안 500 x g)에서 플레이트를 회전시키고 적절한 폐기물 용기 위로 플레이트를 가볍게 하여 상체를 제거하십시오.
- 4°C(500 x g 3분)로 플레이트를 회전하는 PBS에서 얼음-차가운 2% FBS당 200 μL을 사용하여 세 번 세척합니다. 최종 세척 후 PBS에서 얼음 냉기 2 % FBS의 200 μL에서 다시 중단하고 흐름 세포측정에 의해 즉시 분석하십시오.
참고: 이전 간행물은 혈류세포측정31이전에 2% 파라포름알데히드에서 세포 고정을 사용했지만, 여기에 제시된 결과는 분석 완료 직후 에 획득되었다. EtBr+ THP-1 세포의 비율이 급속히 감소하기 때문에 플레이트를 4°C로 저장하여 흐름 세포 측정 데이터 수집을 연기하는 것은 권장되지 않습니다(그림 S3).
- 유동 세포측정 취득 및 분석
참고: 96개의 웰 플레이트 형식을 지원하고 EtBr 형광을 측정하기 위한 적절한 레이저/필터를 갖는 모든 유동 사이토미터를 사용할 수 있습니다.- 인수를 위해, THP-1 셀의 게이트는 선형 전방 분산(FSC) 대 선형 측 산란(SSC) 플롯을 사용하여 IEs가 첨가되지않았으며(그림 2A)가첨가되지 않았으며, 이 게이트에서 10,000개의 이벤트를 획득하였다.
- 히스토그램 플롯을 사용하여 THP-1 게이트에서 EtBr(FL3-Log)에 대한 형광 강도를 측정합니다.
- 게이팅의 경우, FSC 대 SSC 밀도 플롯에서 THP-1 세포에 대한 첫 번째 게이트는, 우물을 이용하여 IEs가 첨가되지않았다(도 2A). 그런 다음 THP-1 세포(IEs 첨가 없음)와 비-공손제어(도2B)를사용하여 FL3(EtBr) 히스토그램에 양수 게이트를 설정하였다.
- 동일한 플레이트에서 테스트된 다른 모든 샘플에서 이러한 게이트를 복사하고 EtBr 양성 THP-1 세포의 백분율을 결정합니다(적어도 하나의 IE를 phagocytized한 THP-1 세포). 테스트된 각 샘플에 대해, phagocytosis는 절대값(EtBr+ THP-1 세포의 백분율) 또는 양극대조군을 최대로 사용하여 백분율로 계산된 상대식세포증으로 보고될 수 있다.
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Representative Results
여기서 는 이전에 기재된 프로토콜(31)을 상세히 제시하고,31 11,12,,,13,14,,15, 16,,16,17,,18을 사용하여 THP-1 세포에 의한 opsonization 및 phagocytosis를 유도하기 위해 P. falciparum IEs의 표면을 표적으로 하는 항체의 용량을 측정한다.
분석은 특히 항체 매개 식세포증을 측정하고, 따라서 THP-1 세포의 표면에 적합한 Fc 수용체와의 상호 작용이 요구된다. 이러한 이유로, 프로토콜에 언급된 바와 같이, THP-1 세포의 표면에 Fcγ-수용체의 발현을 주기적으로 확인하는 것이 좋습니다. 세포는 CD16(도1A)에대해 음수이어야 하며 CD32 및 CD64(도1B,C)에대해 양수되어야 한다.
분석의 경우, 정제 된 후기 단계 IEs는 EtBr으로 표시 된 다음 말라리아 순진하거나 말라리아에 노출된 개인의 혈장 / 혈청에 존재하는 항체로 오손화되었습니다. 식세포증은 유동 세포측정에 의해 측정되었고, EtBr 라벨 및 항체 opsonized IEs와 40 분 공동 배양 후 EtBr+ THP-1 세포의 비율을 정량화하였다. 처음에 THP-1 세포는 FSC 대 SSC 밀도플롯(도 2A)을사용하여 문이 되었습니다. 이어서, THP-1 세포및 비편화 IEs(도2B)에FL3 히스토그램을 사용하여EtBr+ 마커가 생성되었다. 그런 다음 이러한 게이트를 사용하여 다른 모든 컨트롤과 테스트 샘플을 분석했습니다.
네거티브 컨트롤(THP-1 세포만 포함하되, 비압화된 IE 대조군, 말라리아-순진한 및 말라리아 노출 수컷을 가진 대조군)은 모두 ETBr+ 마커에서 단 몇 가지 이벤트만으로 FL3 채널(그림3A)에서단일 음수 피크를 생성해야 한다. 따라서, 평균 식세포값은 절대 EtBr+ THP-1 세포로, 상대식세포 백분율이 매우 낮아야 한다(그림3B, C,일반적으로 모든 경우에 대해 2% 미만). 대조적으로, 양성 대조군(토끼 항인간 적혈구 항체 및 말라리아 노출 된 여성 풀 포함)은 두 개의 봉우리 (그림 3A)로 흔적을 생성해야합니다(그림 3A):부정적인 하나 (모든 음의 대조에 의해 생성 된 것과 크게 겹쳐) EtBr+ 마커 내부에 있는 명확하게 긍정적이고 잘 분리된 하나. 양양성 샘플은 제시된 예(말라리아 에 노출된 다중 gravid woman/NF20의 샘플)로서 양성 대조군과 유사한 프로파일을 생성해야 합니다. 절대 EtBr+ THP-1 세포로 측정되고 상대적인 phagocytosis로 측정된 평균 phagocytosis 값은 일반적으로 긍정적인 대조군(58%/100%)에 대해 가장 높았으며, 말라리아에 노출된 여성 풀(29%/53%)이 그 뒤를 이었고, 그 다음으로 말라리아에 노출된 단일 여성(23%/40%)이 뒤를 이었다. 3개의독립적인 실험이 제시되는 그림 3B,C에서관찰된 바와 같이, 실험과 우리 사이에 상당한 가변성이 있었기 때문에, 따라서, 동일한 실험에서 비교를 위한 견본을 실행하는 것이 좋습니다. 우리의 손에, 적어도 4 전체 96 웰 플레이트는 하나의 경험이 풍부한 연구원에 의해 처리 될 수있다. 말라리아 에 노출된 여성에게서 여러 혈청 견본을 시험하는 2개의 동일 실험이 동시에 능력을 발휘할 때 분석은 또한 명확하게 관찰되었습니다. 동일한 기생충 제제 (후기 단계 IEs의 자기 정화 후) 및 혈청 희석이 사용되었습니다. THP-1 세포는 두 개의 별도 플라스크에 보관되었지만 동일한 초기 플라스크에서 시드되었으며 실험은 두 개의 다른 연구원에 의해 수행되었다. 분석이 별도로 수행될 때 일관된 결과를 생성하는 것처럼 보이지만, 두 실험에서 측정된 phagocytosis 값 간의 엄격한 선형 상관관계(r>0.9 모두 절대 및 상대식세포값 모두)를 통해 조정된 선의 경사 계수는 하나에서 벗어나 다른 실험에서 생성된 값을 나타내는 동일하지 않았다. 이러한 편차는 상대값(경사계수 신뢰구간 0.68-1)에 비해 절대값(경사계수 신뢰구간 0.55-0.72)에 대해 더 분명하게드러났다(도 4). 따라서 당사는 상대값을 사용하는 것이 좋습니다, 특히 어떤 이유로 (예를 들어, 정제 된 IE, 4 개 이상의 전체 플레이트 등) 단일 실험에서 모든 샘플을 실행할 수 없습니다. 또한 PfEMP1 발현(다른 항원)에서의 표류로 인한 추가 변이를 도입하지 않도록 배양 시 THP-1 세포의 미묘한 차이로 인해 최단 시간 내에 비교 분석을 위한 실험을 실행하는 것이 좋습니다.
도 1: THP-1 세포 표면에 발현된 Fc 수용체.
(A)Fcγ 수용체 III/CD16(빨간색). (B)Fcγ 수용체 II/CD32(녹색). C. Fcγ 수용체 I/CD64(주황색). 레이블이 지정되지 않은 셀은 파란색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유동 세포측정제 게이팅 전략.
(A)FL3 히스토그램에서 FSC/SSC에 게이트된 THP-1세포.(B) 에티듐 브로마이드 양성(EtBr+)THP-1 세포.B THP-1 세포 단독/IEs 첨가(파란색), 비협화IEs(녹색)로 배양된 THP-1 세포 및 양성 제어(red)로 배양된 IEs로 배양된 THP-1 세포가 나타난다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: THP-1 세포에 의한 IT4VAR04-IEs의 식증.
(A)B(더 큰 심볼로 식별)에 제시된 실험 중 하나의 대표적인 유동 세포측정 히스토그램. (B)EtBr+ THP-1 세포의 백분율 (3개의 독립적인 실험의 수단 및 표준 편차). (C)B와 동일한 데이터, 해당 양수 제어에 대한 정규화 후. 색상 코딩은 모든 패널에서 동일합니다: THP 단독으로 (블랙), un-opsonized / 없음 항체 제어 (파란색), 말라리아 순진한 제어 (시안), 말라리아 노출 남성 풀 (녹색), 말라리아 노출 여성 수영장 (오렌지), 말라리아 노출 여성 기증자 (분홍색), 긍정적 인 제어 / 토끼 항 인간 적혈구 (빨간색). 평균 및 표준 편차가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 10 말라리아 노출 여자에서 혈청으로 화소화시 THP-1 세포에 의한 IT4VAR04 IEs의 phagocytosis.
플롯은 같은 날에 수행된 두 개의 동일한 실험에 대한 선형 회귀 분석을 제시하지만 다른 연구자에 의해 제시됩니다. (A)절대값으로 제시된데이터(B)의상대식세포증 값. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S1: 식세포 분석 흐름 차트. 분석의 주요 단계를 묘사하는 플로우 차트입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S2 : 96 잘 플레이트 실험 레이아웃. (A)IEs EtBr 라벨링에 대한 레이아웃. (B)편화를 위한 레이아웃; 6 개의 우물은 항상 컨트롤을 위해 예약되어 있습니다. (C)THP 세포 도금에 대한 레이아웃. (D) phagocytosis에 대 한 레이아웃. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S3: 그림 3과 같이 색상 코딩. (A)1개의 실험의 흐름 세포형 히스토그램 오버레이는 즉시 획득하고(B)저장 후 4°C에서 12h.(C)EtBr+ THP-1 세포의 저장 전후측정비율. NF ## 다른 말라리아 노출 여성 기증자를 나타냅니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 제시된 프로토콜은 이전에 기술및 THP-1 세포에 의한 편화 및 식세포증을 유도하기 위해 P. falciparum IEs의 표면을 표적으로 하는 항체의 용량을 측정하기 위하여12,,15,,17,,31을 이용하였다. 여기에 제시 된 결과는 P. falciparum 풍토성 지역에 사는 여성의 플라즈마 / 혈청에서 VAR2CSA 특정 항체를 자연적으로 획득에 초점을 맞춥니다. VAR2CSA는 IEs의 태반 격리에 관여하는 PfEMP1의 유형이며 PM의 병인에 핵심 결정자입니다.
분석체는 다른 PfEMP1 이체 또는 IE 표면에 존재하는 다른 기생충 항원및 표적화에 의해 유도된 항체에 사용될 수 있으며, 항체 테스트가 THP-1 세포(CD32 및 CD64)에 의해 발현된 인간 Fcγ-수용체와 상호 작용한다. 분석은 간단하고 높은 처리량 (큰 샘플 세트의 분석을 허용) 하루에 수행 할 수 있습니다. 식세포증은 유동 세포측정에 의해 측정되며, EtBr 표지 및 항체 opsonized IEs와 40 분 공동 배양 후 EtBr+ THP-1 세포의 비율을 정량화합니다.
분석이 실험 복제에 비해 일관된 결과를 제공하지만 측정된 절대 값 간에 는 변동성이 있으므로 항상 포함되어야 하는 양수 제어를 사용하여 상대값을 계산하는 것이 좋습니다. 또한 위에서 설명한 것과 같이 분석 간 변형을 피하기 위해 단일 실험에서 테스트할 모든 샘플을 실행하는 것이 좋습니다. P. falciparum 감염에 노출된 개인에게서 수집된 혈청 견본을 시험할 때, 우리는 항상 대조군으로 이용될 순진한 개별에게서 견본의 세트를 포함하는 것이 좋습니다. 이 대조군을 사용하여 임계값을 설정하여 테스트 샘플 중 어느 것이 긍정적으로 간주될지 확인할 수 있습니다.
우리는 이전에 다른 말라리아 임상 프리젠 테이션 (심한 대 온화한)17을가진 아이들에게서 집합된 혈청 세포증 유도 용량을 비교하기 위하여 이 접근을 이용했습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
마이켄 비스티는 우수한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 덴마크 외교부로부터 보조금(MAVARECA II; 17-02-KU)에 의해 지원되었으며 다니다 펠로우십 센터가 관리했습니다. 펀더는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
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