Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at give instruktion om, hvordan man måler kapaciteten af antistoffer til stede i sera eller plasma af personer, naturligt udsat for Plasmodium falciparum infektion, at opsonisere og fremkalde fagocytose af parasit-inficerede erythrocytter (IEs).
Abstract
Protokollen beskriver, hvordan man opretter og kører en flow cytometri-baseret fagocytose assay af Plasmodium falciparum-inficeredeerythrocytter (IEs) opsonized af naturligt erhvervet IgG antistoffer specifikke for VAR2CSA. VAR2CSA er parasitantigen, der formidler den selektive binding af IEs i moderkagen, der kan forårsage en alvorlig form for malaria hos gravide kvinder, kaldet placenta malaria (PM). Beskyttelse mod PM er medieret af VAR2CSA-specifikke antistoffer, der menes at fungere ved at hæmme placenta binding og / eller ved opsonizing IEs for fagocytose. Analysen beskæftiger sene-fase-synkroniserede IEs, der er blevet udvalgt in vitro til at udtrykke VAR2CSA, plasma / serum-antistoffer fra kvinder med naturligt erhvervet PM-specifik immunitet, og den fagocytiske cellelinje THP-1. Protokollen kan dog let ændres for at analysere antistoffers funktionalitet til parasitantigen, der findes på IE-overfladen, uanset om det er forårsaget af naturlig eksponering eller ved vaccination. Analysen tilbyder enkel og høj-throughput evaluering, med god reproducerbarhed, af et vigtigt funktionelt aspekt af antistof-medieret immunitet i malaria. Det er derfor nyttigt, når man vurderer klinisk immunitet over for P. falciparum malaria, en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i troperne, især i Afrika syd for Sahara.
Introduction
Malaria er en vektorbåren sygdom forårsaget hos mennesker ved infektion med fem forskellige arter af slægten Plasmodium. De mest udbredte arter er P. falciparum, som også er ansvarlig for den mest sygelighed og dødelighed1. Malaria klinisk præsentation varierer fra asymptomatisk eller godartede infektioner til komplicerede / alvorlig sygdom, sidstnævnte forekommer for det meste hos børn under fem år. Eksponering for P. falciparum fremkalder ikke steril immunitet, men personer, der bor i endemiske områder, udvikler langsomt immunitet mod den kliniske sygdom. Beskyttelse er alder/ eksponering afhængig og immunitet er normalt erhvervet i løbet af de første 5-10 år af livet2. Voksne kvinder er en vigtig undtagelse, som svær malaria kan forekomme under graviditet i en klinisk præsentation kendt som placenta malaria (PM). PM er en vigtig årsag til abort, dødfødsel, for tidlig fødsel, lav fødselsvægt, fosterdød, og moder anæmi. Modstand mod PM udvikler sig over successive graviditeter3. Beskyttelse mod PM er forbundet med erhvervelse af antistoffer mod VAR2CSA-type PfEMP14,5, et inficeret erythrocyt (IE) overfladeantigen, der binder sig til chondroitinsulfat A (CSA), så IE-binding i moderkagen. Antistoffer mægle beskyttelse udfører forskellige funktionelle aktiviteter (gennemgået i6,7), herunder opsonization af IEs at fremkalde fagocytose. Tidlige in vitro-undersøgelser viste,at antistoffer kan begrænse P. falciparum vækst i nærvær af monocytter via fagocytose8,9. Nyere undersøgelser har vist, at højere niveauer af fagocytosefremkaldende antistoffer er forbundet med bedre graviditetsresultater (i forbindelse med hiv-co-infektion)10,,11, hvilket indikerer relevansen af denne effektorfunktion i det naturligt erhvervede immunrespons.
Her præsenterer vi en protokol til måling af denne funktion af antistoffer til stede i humant plasma / serum, ved hjælp af in vitro dyrkede IEs udtrykke VAR2CSA sammen med monocyt linje THP-1. Analysen har tidligere været anvendt11,12,13,14,15,16,17,18 ogbetragtes som en forbedret og lettere tilgang i forhold til tidligere mikroskop-baserede protokoller8, da det giver mulighed for test af et større antal antistof prøver i en enkelt køre ved hjælp af mindre mængder af antistof og undgå kedelige og skæv mikroskopi optælling. Selv om analysen er blevet brugt af flere laboratorier og dens udførelse er enkel nok, det kræver omhyggelig planlægning og forberedelse, derfor, en detaljeret protokol ville tillade dens anvendelse af laboratorier og forskere mangler tidligere erfaringer. Vi bruger, som et eksempel, sene-fase-synkroniserede IEs udtrykke VAR2CSA opsonized med antistoffer til stede i serum indsamlet fra kvinder med naturligt erhvervet PM-specifik immunitet. Protokollen kan dog let ændres for at analysere antistoffers funktionalitet til parasitantigen, der findes på IE-overfladen, uanset om det er forårsaget af naturlig eksponering eller ved vaccination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De humane serumprøver, der blev anvendt til de resultater, der præsenteres her, blev indsamlet i en separatundersøgelse 19. Samlingen blev godkendt af Institutional Review Board of Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana (studie 038/10-11) og af de regionale forskningsetiske komitéer, Region Hovedstaden (protokol H-4-2013-083).
1. Parasitkultur
BEMÆRK: Følg de lokale regler for håndtering af humane patogener.
- Vedligehold P. falciparumparasitter i henhold til standardprotokollen som beskrevet før20 i parasitkulturmedium (se Materialetabel).
- Hold parasitterne tæt synkroniseret ved hjælp af sorbitolbehandling som tidligere beskrevet21.
- For at sikre VAR2CSA-ekspression på overfladen af IE udføres gentagne runder af immunmagnetisk markering ved hjælp af et anti-VAR2CSA-antistof (f.eks. PAM1.4-antistof, et krydsreaktivt humant monoklonalt VAR2CSA-specifikt IgG22) koblet til protein G-magnetiskeperler 23.
- Kort sagt, inkubere sene trofozoit-IEs med magnetiske perler koblet til en anti-VAR2CSA antistof og positivt vælge ved hjælp af en magnet.
- Udvid de udvalgte parasitter i kultur for et par cyklusser, indtil parasitæmi er mindst 5%.
- Alternativt kan du vælge parasitter, der binder sig til plast-immobiliseret CSA (receptoren for VAR2CSA) som tidligere beskrevet24.
- For at kontrollere VAR2CSA udtryk på de valgte parasitter udføre flow cytometri som tidligere beskrevet25.
- Kort sagt, mærke de sene fase trofozoit-IEs med samme antistof, der anvendes til den magnetiske udvælgelse (trin 1.3) efterfulgt af en fluorescerende mærket sekundært antistof.
- Mål IE overfladereaktiviteten ved flowcytometri. Vellykket antistof udvælgelse normalt resulterer i en parasit befolkning, der udtrykker VAR2CSA i de fleste af parasitter (≈80%).
- For fagocytose assay, bruge renset midten til sent stadium trophozoite-IEs. Udfør rensning ved hjælp af magnetisk adskillelse som tidligere beskrevet26.
BEMÆRK: For præcist at bestemme stadier af parasitter, udføre Giemsa farvning på blod udstrygninger efterfulgt af lys mikroskopi observation. Følg standardprocedurer og morfologiske retningslinjer som beskrevet før27. Sen-fase rensning kan også udføres ved hjælp af tæthed gradient medium. IE udbyttet, dog i vores erfaring er lavere, og derfor magnetisk rensning er at foretrække.- For magnetisk adskillelse, spin parasitten kultur (5-10% parasitæmi) ved 500 x g i 10 min ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og re-suspendere celle pellet i 10 ml parasit kultur medium.
- Tilføj parasit suspension i en CS-kolonne koblet til en magnet (se Tabel over materialer)og lad det langsomt passere gennem kolonnen. Trophozoite-IEs er paramagnetiske (på grund af tilstedeværelsen af hemozoin) og vil forblive i kolonnen mesh.
- Kolonnen vaskes med 50 ml parasitkulturmedium, og i'erne eluteres fra den magnetiske søjle ved hjælp af 50 ml parasitkulturmedium.
- Drej eluatet fra 1,5,3 ved 500 x g i 10 min ved stuetemperatur. Kassér forsigtigt supernatanten og re-suspendere i 1 ml parasitkulturmedium.
- Ved hjælp af et hæmocytometer tælles antallet af IE'er (let identificeres ved lysmikroskopi som erythrocytter med mørkt hemozoinpigment) og det samlede cellenummer for at beregne den endelige parasitæmi (procentdel af IE'er).
BEMÆRK: Brug kun parasitter med mindst 80% renhed (80% IE). - Baseret på antallet af serum-/antistofprøver, der er planlagt til test, anslås den samlede mængde IE'er, der er behov for, og opskalere parasitkulturerne i overensstemmelse hermed. En 75 cm2 kulturkolbe med 25 ml kultur på 5% hæmatokrit og 5-10% parasitæmi bør give nok IEs til at køre en fuld 96 brøndplade. For en fuld plade (42 prøver plus 6 kontroller i to eksemplarer) er der behov for mindst 1,5 ml parasitaffjedring ved 3,3 x 107 IEs/ml.
2. THP-1 celler
BEMÆRK: THP-1 celle linje bruges i denne analyse. Denne monocytcellelinje er afledt af en patient med monocytisk leukæmi28 og kan købes hos ATCC. Vedligehold cellelinjen i henhold til udbyderens instruktioner i THP-1-kulturmediet (se Materialetabel).
- For regelmæssig vedligeholdelse starte THP-1 cellekultur ved 2-4 x 105 celler/ml og subkultur, når cellekoncentrationen når 8 x 105 celler/ml.
BEMÆRK: Cellerekoncentrationen må ikke overstige 1 x 106 celler/ml, og hold styr på passagenummeret. Undgå brug af celler, der er uden for passage 25. Den gennemsnitlige fordoblingstid for THP-1 cellelinjen varierer mellem 19-50 h. Bestemme fordoblingstiden for cellebatchen, før de påbegyndes fagocytoseforsøgene. Dette vil bidrage til nogenlunde at anslå den nødvendige mængde kultur, der er nødvendig for et bestemt antal serumprøver, der skal testes (f.eks. for en fuld 96 brøndplade, er der behov for 10 ml kultur ved 5 x 105 celler/ml). - Kontroller regelmæssigt THP-1-cellerne for overfladeudtrykket af Fcγ-receptorerne I (CD64), II (CD32) og III (CD16) som tidligere beskrevet15.
- Kort sagt, plette THP-1 celler (separat) med anti-CD64, anti-CD32 og anti-CD16 fluorescerende mærket antistoffer (Tabel af Materialer) i 30 min ved stuetemperatur (1:100 fortynding tilberedt i 2% FBS i PBS).
- Vask tre gange med 2% FBS i PBS og mål overfladefarvning ved flow cytometri.
BEMÆRK: THP-1-cellerne er negative for CD16 og positive for CD32 og CD64 som tidligere rapporteret29,30 ( Figur1).
- Til fagocytoseanalysen skal der oprettes en THP-1-cellekulturkolbe med 2,5 x 105 celler/ml dagen før forsøget for at give omkring 5 x 105 celler/ml på analysedagen.
BEMÆRK: Sørg for, at der er 4-6 x 105 celler/ml til stede på analysedagen.
3. Fagocytoseanalyse (Figur S1)
- Før analysen påbegyndes, skal du blokere (>1 h) to rundbundede 96 brøndplader (en til opsonisering og en anden for fagocytose) med 150 μL pr. brønd med steril 2% FBS i PBS.
BEMÆRK: Etiket plade 1 som opsonisation plade og bruge det både for ethidium bromid (EtBr) farvning og opsonization. Label plade 2 som fagocytose plade og brug både for THP-1 celle plettering og for fagocytose trin. - Parasit farvning og opsonization
- IE-affjedringen, der er fremstillet i 1,6, og juster celletallet til 3,3 x 107 IE/ml ved at tilsætte parasitkulturmedium og EtBr for at opnå en endelig koncentration på 2,5 μg/ml (1:40 fortynding fra en 0,1 mg/ml lager).
BEMÆRK: EtBr pletter parasitten DNA, så det kan detektion ved flow cytometri.
FORSIGTIG: EtBr er et mutagen og hud, øjne og respiratorisk irriterende. Brug passende beskyttelse og bortskaf affald i henhold til lokale bestemmelser. - Fjern blokeringsopløsningen fra en af de 96 brøndplader (opsoniseringsplade), svirpende pladen og fjern overskydende væske over et stykke håndklædepapir.
- Der tilsættes 30 μL pr. brønd af den IE-suspension, der er fremstillet ovenfor i den øverste halvdel af pladen. Lad en godt tom og tilsæt 30 μL parasitkulturmedium (uden IEs til THP-1-kontroln). (Figur S2A). Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur og beskyttet mod lys.
- Tilsæt 170 μL pr. brønd af parasitkulturmedium. Drej pladen ved 500 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, og fjern supernatanten ved at svippe pladen over en passende affaldsbeholder.
- De EtBr-mærkede IEs to gange mere ved hjælp af 200 μL pr. brønd af parasitkulturmedium, der drejer pladen ved 500 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fra den første vask kan fjernes ved at svippe pladen. Fjern forsigtigt supernatanten fra den anden vask ved hjælp af en multikanalpipette for at sikre, at hele vaskemediets volumen fjernes. Forstyr ikke pellet.
- Den EtBr-mærkede IE'er på ny suspenderes i 30 μL antistof-/plasma-/serumopløsning, der er fremstillet ved de ønskede koncentrationer i parasitkulturmedium.
- Medtag altid følgende betjeningsforanstaltninger (Figur S2B):en kontrol uden IE/THP-1-celler kontrol (parasitkultur medium); en kontrol uden antistof eller plasma/serum (ikke-opsoniseret kontrol) en positiv kontrol ved hjælp af det kommercielt tilgængelige kaninanti-humant erythrocytantistof ved 1:100 fortynding (se materialetabel) to negative plasma/serumkontroller ved 1:5 fortynding (en malarianaive pool og en pool fra malaria-eksponerede mænd); og en positiv serumkontrol ved 1:5 fortynding (en pulje fra malaria-eksponerede kvinder, som tidligere har været gravide (helst multigravidae)).
BEMÆRK: En 1:100 fortynding for den positive kontrol synes at fungere konsekvent på tværs af forskellige partier af købt antistof (data ikke vist). Det anbefales dog at udelukke variationer mellem batcherne ved at teste flere fortyndinger, hver gang der anvendes et nyt parti antistof. - Inkuber i 45 minutter i mørke ved 37 °C.
- IE-affjedringen, der er fremstillet i 1,6, og juster celletallet til 3,3 x 107 IE/ml ved at tilsætte parasitkulturmedium og EtBr for at opnå en endelig koncentration på 2,5 μg/ml (1:40 fortynding fra en 0,1 mg/ml lager).
- THP-1 celler forberedelse og fagocytose
- Mens IEs er ved at blive opsonized (3.2.8), begynde at forberede THP-1 celler.
- Fjern THP-1 cellerne fra kulturkolben, drej dem ned (500 x g i 5 min ved stuetemperatur), dekantere supernatanten og re-suspendere pellet i THP-1 cellekultur medium.
- Spin igen (500 x g i 5 min ved stuetemperatur), dekantere supernatant og re-suspendere cell pellet i 1 ml THP-1 celle kultur medium.
- Der bestemmes celletal i den opløsning, der er fremstillet ovenfor, og der tilsættes mere medium for at opnå en endelig koncentration på 5 x 105 celler/ml.
- Fjern blokeringsopløsningen fra den resterende 96 brøndplade (fagocytoseplade) ved at svippe pladen og fjerne væskeoverskdelt over et stykke håndklædepapir.
- Der tilsættes 100 μL pr. brønd af DEN THP-1 celleaffjedring, der er fremstillet i punkt 3.3.4, og sættes tilbage i cellekulturkubvøsen (Figur S2C).
- Når antistof-/plasma/seruminkubationstiden er afsluttet, tilsættes 170 μL pr. brønd af parasitkulturmedium. Drej pladen ved 500 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, og fjern supernatanten ved at svippe pladen over en passende affaldsbeholder.
- Vask de opsoniserede IEs to gange mere ved hjælp af 200 μL pr. brønd af parasitkulturmedium, hvor pladen drejes ved 500 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fra den første vask kan fjernes ved at svippe pladen. Fjern forsigtigt supernatanten fra den anden vask ved hjælp af en multikanalpipette for at sikre, at hele vaskemediets volumen fjernes. Forstyr ikke pellet.
- Endelig re-suspendere opsonized IEs i 100 μL af forvarmet THP-1 celle kultur medium. Overfør 50 μL opsoniseret IE suspension til hver brønd i fagocytose plade. Da der er i alt 100 μL IE'er, kan hver antistof/serumfortynding køres i dubletter i fagocytosepladen (Figur S2D)
BEMÆRK: Mængden af IE'er og THP-1 celler, der anvendes i analysen svarer til en 10:1 forholdet. - Inkuber i 40 minutter i mørke ved 37 °C, 5% CO2.
BEMÆRK: Lad ikke fagocytose fortsætte i mere end 40 min. - Phagocytose ved centrifugering ved 4 °C (500 x g,5 min) og kassér supernatanten ved at svippe pladen. Der tilsættes 150 μL ammoniumchloridlysingopløsning(Materialetabel) ved pipettering, inkubering i nøjagtig 3 min.
BEMÆRK: Dette trin vil lyse erythrocytter, der ikke er blevet fagocytosed af THP-1 celler. - Stop lysisen ved at tilsætte 100 μL iskold 2% FBS i PBS. Pladen drejes ved 4 °C (500 x g i 3 min.), og supernatanten fjernes ved at svippe pladen over en passende affaldsbeholder.
- Vask tre gange med 200 μL pr. brønd iskold 2% FBS i PBS, der drejer pladen ved 4°C (500 x g i 3 min.). Efter den endelige vask, re-suspension i 200 μL iskold 2% FBS i PBS og straks analysere ved flow cytometri.
BEMÆRK: Tidligere publikationer har anvendt cellefiksering i 2% paraformaldehyd før flow cytometri31, men resultaterne præsenteres her blev erhvervet umiddelbart efter analysens afslutning. Det anbefales ikke at udsætte indpkævningen af is not flowcytometridata ved 4°C, da procentdelen af EtBr+ THP-1-celler henfalder hurtigt (Figur S3).
- Flow cytometri erhvervelse og analyse
BEMÆRK: Ethvert flow cytometer understøtter 96 godt plade format og har de relevante lasere / filtre til at måle EtBr fluorescens kan anvendes.- Til erhvervelse blev gate på THP-1-celler ved hjælp af et lineært forward-scatter (FSC) vs. lineær side-scatter (SSC) plot ved hjælp af brøndene ikke tilføjet(Figur 2A)og erhverve 10.000 hændelser på denne port.
- Mål fluorescensintensiteten for EtBr (FL3-Log) på THP-1-porten ved hjælp af et histogramplot.
- For gating, første gate på THP-1 celler i en FSC vs SSC tæthed plot, ved hjælp af brønde var ingen IEs blev tilføjet (Figur 2A). Opret derefter en positiv port i et FL3 (EtBr) histogram ved hjælp af THP-1-cellerne (ingen tilføjede IEs) og det ikke-opsoniserede kontrolelement (Figur 2B).
- Kopier disse porte i alle de andre prøver testet i samme plade og bestemme procentdelen af EtBr-positive THP-1 celler (THP-1 celler, der har fagocytret mindst én IE). For hver af de testede prøver kan fagocytose rapporteres som de absolutte værdier (procentdel af EtBr+ THP-1-celler) eller som relativ fagocytose beregnet som procentdel ved hjælp af den positive kontrol som maksimum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi i detaljer enprotokol,der tidligere er blevetbeskrevet 31 ogbrugt 11,12,13,14,15,16,17,18 til at måle kapaciteten af antistoffer rettet mod overfladen af P. falciparum IEs at fremkalde opsonisation og fagocytose af THP-1 celler.
Analysen måler specifikt antistofmedieret fagocytose, og derfor er interaktion med de relevante Fc-receptorer på overfladen af THP-1-cellerne påkrævet. Af denne grund, og som nævnt i protokollen, anbefaler vi regelmæssigt at kontrollere udtrykket af Fcγ-receptorer på overfladen af THP-1 celler ved flow cytometri. Cellerne skal være negative for CD16 (Figur 1A) og positive for CD32 og CD64 (Figur 1B,C).
For analysen, renset sene fase IEs blev mærket med EtBr og derefter opsonized med antistoffer til stede i plasma / serum af malaria-naive eller malaria-eksponerede personer. Fagocytose blev målt ved flow cytometri, kvantificere procentdelen af EtBr+ THP-1 celler efter 40 min co-inkubation med EtBr-mærket og antistof-opsonized IEs. I første omgang blev THP-1 celler gated ved hjælp af en FSC vs SSC tæthed plot (Figur 2A). Derefter blev der+ oprettet en EtBr +-markør ved hjælp af et FL3-histogram på THP-1-cellerne og ikke-opsoniserede IEs (Figur 2B). Disse porte blev derefter brugt til at analysere alle de andre kontroller og testprøver.
De negative kontroller (herunder THP-1 celler alene, un-opsonized IE kontrol, og kontrol med malaria-naive og malaria-eksponerede mænd) bør alle generere en enkelt negativ top i FL3 kanal (Figur 3A) med kun få begivenheder i EtBr+ markør. Derfor bør de gennemsnitlige fagocytoseværdier både som absolutte EtBr+ THP-1-celler og som relative fagocytoseprocenter være meget lave (figur 3B,C, normalt mindre end 2 % i alle tilfælde). I modsætning hertil bør de positive kontroller (herunder kanin anti-humant erythrocyt antistof og malaria-eksponeret kvindelige pool) generere spor med to toppe(Figur 3A):en negativ (stort set overlappende med den, der genereres af alle de negative kontroller) og en klart positiv og godt adskilt en placeret inde i EtBr+ markør. En positiv prøve, som det præsenterede eksempel (prøve fra en malaria-eksponeret multigravid kvinde/NF20) bør generere en lignende profil som de positive kontroller. De gennemsnitlige fagocytoseværdier, målt som absolutte EtBr+ THP-1-celler og som relativ fagocytose, var normalt højest for den positive kontrol (58%/100%), efterfulgt af den malaria-eksponerede kvindelige pulje (29%/53%), og derefter den ene malaria-eksponerede kvinde (23%/40%). Som det er konstateret i figur 3B,C, hvor der præsenteres tre uafhængige forsøg, var der en betydelig variation mellem forsøgene, og vi anbefaler derfor, at der køres prøver til sammenligning i det samme eksperiment. I vores hænder kan mindst fire fulde 96 brøndplader håndteres af en enkelt erfaren forsker. Variabiliteten mellem analyserne blev også tydeligt observeret, da to identiske forsøg med at teste flere serumprøver fra malariaeksponerede kvinder blev udført samtidigt. Det samme parasitpræparat (efter magnetisk rensning af sene IE'er) og serumfortyndinger blev anvendt. THP-1 celler blev holdt i to separate kolber, men sået fra samme oprindelige kolbe og forsøgene blev udført af to forskellige forskere. Selv om analysen synes at give ensartede resultater, når den udføres separat, med stramme lineære korrelationer (r>0.9 for både absolutte og relative fagocytoseværdier) mellem fagocytoseværdier målt i de to forsøg, afviger hældningskoefficienten for de justerede linjer fra én, hvilket indikerer, at de værdier, der blev genereret i forskellige forsøg, ikke var identiske. Denne afvigelse var mere tydelig for de absolutte værdier (hældningskoefficientens konfidensinterval 0,55-0,72) sammenlignet med de relative værdier (hældningskoefficientens konfidensinterval 0,68-1) (Figur 4). Vi anbefaler derfor at bruge relative værdier, især hvis det af en eller anden grund (f.eks. ikke nok rensede IEs, mere end 4 fulde plader osv.) ikke er muligt at køre alle prøverne i et enkelt eksperiment. Vi anbefaler også at køre eksperimenter beregnet til sammenlignende analyse inden for kortest tid, for at undgå at indføre ekstra variation på grund af drivende i PfEMP1 udtryk (samt andre antigener) og på grund af subtile forskelle på THP-1 celler på længere tid i kultur.
Figur 1: Fc-receptorer udtrykt på THP-1 celleoverfladen.
aA) Fcγ-receptor III/CD16 (rød). (B) Fcγ-receptor II/CD32 (grøn). C. Fcγ-receptor I/CD64 (orange). Celler, der ikke er mærket, vises med blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Flow cytometri gating strategi.
aA) THP-1-celler, der er gated på FSC/SSC. (B) Ethidium bromid positiv (EtBr+) THP-1 celler i et FL3 histogram. THP-1 celler alene/ingen IE'er tilføjet (blå), THP-1 celler inkuberet med ikke-opsonized IEs (grøn), og THP-1 celler inkuberet med IEs opsonized med en positiv kontrol (rød) er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fagocytose af IT4VAR04-IE'er ved THP-1 celler.
aA) Repræsentative flowcytometriektomogrammer for et af de forsøg, der præsenteres i B (identificeret ved større symboler). bB) Procentdel af EtBr+ THP-1-celler (middel- og standardafvigelser for tre uafhængige forsøg). c) Samme data som i B, efter normalisering mod den tilsvarende positive kontrol. Farvekodning er den samme i alle paneler: THP-alene (sort), un-opsonized / ingen antistof kontrol (blå), malaria-naiv kontrol (cyan), malaria-eksponeret mandlig pool (grøn), malaria-eksponeret kvindelig pool (orange), en malaria-eksponeret kvindelig donor (pink), og positiv kontrol / kanin anti-menneskelige erythrocytter (rød). Middel- og standardafvigelser vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fagocytose af IT4VAR04 IEs af THP-1 celler ved opsonization med serum fra 10 malaria-eksponerede kvinder.
Plottene præsenterer lineær regressionsanalyse for to identiske eksperimenter, der udføres samme dag, men af forskellige forskere. (A) Data præsenteret som absolutte værdier og som (B) relative fagocytoseværdier. Analyse udført ved hjælp af statistisk analysesoftware. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Fagocytose assay flow diagram. Flowdiagram, der viser de vigtigste trin i analysen. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S2: 96 godt plade eksperiment layout. (A) Layout for IEs EtBr mærkning. B) Opsoniseringslayout 6 brønde er altid forbeholdt kontrolelementer. (C) Layout for PT-celler plating. (D) Layout for fagocytose. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S3: Farvekodning som i figur 3. a) Flowcytometri histogramoverlejring af et forsøg, der er anskaffet straksogb ) efter oplagring ved 4 °C i 12 timer (C) Procentdel af EtBr+ THP-1-celler målt før og efter opbevaring. NF ## repræsenterer forskellige malaria-eksponerede kvindelige donorer. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her er tidligere blevet beskrevet ogbrugt 12,15,17,31 til at måle kapaciteten af antistoffer rettet mod overfladen af P. falciparum IEs at fremkalde opsonisation og fagocytose af THP-1 celler. Resultaterne her fokuserer på naturligt erhvervede VAR2CSA-specifikke antistoffer i plasma/serum hos kvinder, der bor i en P. falciparum endemisk region. VAR2CSA er en type PfEMP1, der er involveret i placentabinding af IE'er, og en afgørende faktor i PM's patogenese.
Analysen kan anvendes til antistoffer, der induceres ved immunisering og/eller rettet mod andre PfEMP1-varianter eller andre parasitantigen, der findes på IE-overfladen, forudsat at det testede antistof interagerer med de humane Fcγ-receptorer udtrykt af THP-1-cellerne (CD32 og CD64). Analysen er enkel, høj-gennemløb (tillader analyse af store prøvesæt) og kan udføres på én dag. Fagocytose måles ved flowcytometri, der kvantificerer procentdelen af EtBr+ THP-1 celler efter 40 min co-inkubation med EtBr-mærket og antistof-opsonized IEs.
Selvom analysen giver ensartede resultater i forhold til eksperimentelle replikater, er der variabilitet mellem de målte absolutte værdier, og vi anbefaler derfor, at relative værdier beregnes ved hjælp af en positiv kontrol, der altid skal medtages. Vi anbefaler også at køre alle prøver, der skal testes i et enkelt eksperiment, for at undgå inter-assay variation som beskrevet ovenfor. Ved test af serumprøver indsamlet fra personer, der er eksponeret for P. falciparum-infektion, anbefaler vi altid at medtage et sæt prøver fra naive personer, der skal anvendes som kontrolgruppe. Denne kontrolgruppe kan bruges til at oprette en tærskel for at bestemme, hvilke af dine testprøver der skal betragtes som positive.
Vi har tidligere brugt denne tilgang til at sammenligne den fagocytose-inducerende kapacitet sera indsamlet fra børn med forskellige malaria kliniske præsentationer (svær vs mild)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Maiken Visti takkes for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev delvist finansieret af et tilskud (MAVARECA II; 17-02-KU) fra Udenrigsministeriet og administreret af Danida Fellowship Centre. Bidragyderen havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
