Summary
Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.
Abstract
Protokol, VAR2CSA'ya özgü doğal olarak edinilmiş IgG antikorları tarafından opsonize edilen Plasmodium falciparumenfekte eritrositlerin (IEs) akış sitometri tabanlı fagositoz testinin nasıl kurulup çalıştırılabildiğini açıklamaktadır. VAR2CSA, plasentadaki IE'lerin seçici sekansasyonuna aracılık eden ve plasental sıtma (PM) adı verilen hamile kadınlarda ciddi bir sıtma formuna neden olabilecek parazit antijenidir. PM'den korunma, plasental sekestrasyonu inhibe ederek ve/veya fagositoz için IE'leri opsonize ederek çalıştığına inanılan VAR2CSA spesifik antikorlar aracılık eder. Taht, VAR2CSA'yı ifade etmek için in vitro olarak seçilen geç evre senkronize IE'ler, doğal olarak edinilmiş PM spesifik bağışıklığı olan kadınlardan plazma/serum-antikorları ve fagositik hücre hattı THP-1'i kullanır. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir. Titre, sıtmada antikor aracılı bağışıklığın önemli bir fonksiyonel yönünüiyi tekrarlanabilirlik ile basit ve yüksek iş letimatisi değerlendirme sunar. Bu nedenle, özellikle Sahra-altı Afrika'da, tropik bölgelerde morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni olan P. falciparum sıtmasına karşı klinik bağışıklığı değerlendirirken yararlıdır.
Introduction
Sıtma, Plasmodiumcinsinin beş farklı türüyle enfeksiyon anına bağlı olarak insanlarda meydana gelen vektör kaynaklı bir hastalıktır. En yaygın türler P. falciparum, aynı zamanda en morbidite ve mortalite sorumludur1. Sıtma klinik sunumu asemptomatik veya benign enfeksiyonlardan komplike/ağır hastalıklara kadar değişmekteolup, ikincisi çoğunlukla beş yaşın altındaki çocuklarda görülür. P. falciparum maruz steril bağışıklık neden olmaz, ancak endemik bölgelerde yaşayan bireyler yavaş yavaş klinik hastalığa karşı bağışıklık geliştirmek. Koruma yaşa/maruziyete bağlıdır ve bağışıklık normalde yaşamın ilk 5-10 döneminde elde edilir2. Plasental sıtma (PM) olarak bilinen klinik bir sunumda gebelik sırasında şiddetli sıtma meydana gelebileceğinden yetişkin kadınlar önemli bir istisnadır. PM kürtaj, ölü doğum, erken doğum, düşük doğum ağırlığı, fetal ölüm ve maternal anemi önemli bir nedenidir. PM direnci art arda gebelikler üzerinde gelişir3. PM'den korunma, plasentada IE sekestrasyonu sağlayan4,5kondroitin sülfat A 'ya (CSA) bağlanan enfekte eritrosit (IE) yüzey antijenine karşı antikor ların elde edilmesiyle ilişkilidir. Antikorlar çeşitli fonksiyonel faaliyetler gerçekleştiren koruma aracılık(6,,7)Fagositagozis indüklemek için IEs opsonizasyonu da dahil olmak üzere. Erken in vitro çalışmalar antikorların fagositozyoluylamonosit varlığında P. falciparum büyümesini sınırlayabilir gösterdi 8,9. Daha yeni çalışmalar fagositoz indükleyen antikorların daha yüksek düzeyde daha iyi gebelik sonuçları ile ilişkili olduğunu göstermiştir (HIV co-enfeksiyon bağlamında)10,11, doğal olarak elde edilen bağışıklık yanıtı bu efektör fonksiyonun alaka gösteren.
Burada insan plazmasında/serumunda bulunan antikorların bu işlevini ölçmek için, VAR2CSA'yı teksit hattı THP-1 ile birlikte in vitro kültürlü IE'ler kullanarak bir protokol saklıyız. Titredaha önce kullanılmıştır11,12,13,14,15,16,17,,18 ve daha önceki mikroskop tabanlı protokollere göre geliştirilmiş ve daha kolay bir yaklaşım olarak kabul edilir8, antikor daha küçük hacimlerde kullanarak tek bir çalışmaantikor örneklerinin daha büyük sayıda test sağlar ve sıkıcı ve önyargılı mikroskop sayma kaçınarak beri. Tayın birden fazla laboratuvar tarafından kullanılmasına ve yürütülmesi yeterince basit olmasına rağmen, dikkatli bir planlama ve hazırlık gerektirir, bu nedenle ayrıntılı bir protokol laboratuvarlar ve araştırmacılar tarafından daha önce deneyimi olmayan uygulamalara izin verir. Örnek olarak, doğal olarak elde edilen PM'ye özgü bağışıklığı olan kadınlardan toplanan serumda bulunan antikorlarla opsonize edilmiş VAR2CSA'yı ifade eden geç evre senkronize edilmiş IE'leri kullanıyoruz. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada sunulan sonuçlar için kullanılan insan serumu örnekleri ayrı bir çalışmada toplanmıştır19. Koleksiyon, Gana Üniversitesi Noguchi Memorial Institute for Medical Research Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma 038/10-11) ve Danimarka'nın Başkenti Bölgesel Araştırma Etik Komiteleri (H-4-2013-083 protokolü) tarafından onaylanmıştır.
1. Parazit kültürü
NOT: İnsan patojenlerinin kullanımı yla ilgili yerel yönetmeliklere uyun.
- P. falciparum parazitlerini20'den önce açıklanan standart protokole göre parazit kültür ortamında muhafaza edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Parazitleri daha önce açıklandığı gibi sorbitol tedavisi ile sıkıca senkronize tutun21.
- IE yüzeyinde VAR2CSA ifade sağlamak için, bir anti-VAR2CSA antikor kullanarak bağışıklık-manyetik seçim tekrarlanan tur gerçekleştirmek (örneğin, PAM1.4 antikor, çapraz reaktif insan monoklonal VAR2CSA özgü IgG22) protein G-manyetik boncuklar23birleştiğinde .
- Kısacası, bir anti-VAR2CSA antikor ile birleştiğinde manyetik boncukile son dönem trophozoit-IEs inkübat ve olumlu bir mıknatıs kullanarak seçin.
- Parazitmi en az%5 olana kadar kültürde seçilen parazitleri birkaç döngü boyunca genişletin.
- Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi plastik immobilize CSA (VAR2CSA reseptörü) bağlamak parazitler seçin24.
- Seçili parazitler üzerinde VAR2CSA ifadesini doğrulamak için daha önce açıklandığı gibi akış sitometrisi gerçekleştirmek25.
- Kısacası, manyetik seçim için kullanılan aynı antikor ile geç aşama trophozoit-IEs etiket (adım 1.3) bir floresan ikincil antikor etiketli izledi.
- Akış sitometrisi ile IE yüzey reaktivitesini ölçün. Başarılı antikor seçimi normalde parazitlerin çoğunda VAR2CSA'yı ifade eden bir parazit popülasyonuyla sonuçlanır (%≈ %80).
- Fagositoz teşrifi için, saflaştırılmış orta-geç evre trophozoit-IE kullanın. Daha önce açıklandığı gibi manyetik ayırma kullanarak arıtma gerçekleştirin26.
NOT: Parazitlerin evresini doğru bir şekilde belirlemek için, ışık mikroskobu gözlemini takip eden kan yaymalarında Giemsa boyama yapın. 27'denönce açıklandığı gibi standart prosedürleri ve morfolojik yönergeleri izleyin. Son aşama arıtma da yoğunluk gradyan orta kullanılarak yapılabilir. IE verim, ancak, bizim deneyim olarak daha düşüktür ve bu nedenle, manyetik arıtma tercih edilir.- Manyetik ayırma için parazit kültürünü (5-10% parazitmi) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatant çıkarın ve parazit kültür orta 10 mL hücre pelet yeniden askıya.
- Parazit süspansiyonuna bir mıknatısla birleşen CS sütununa ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve yavaşça sütundan geçmesine izin verin. Trophozoit-IEs paramanyetik (hemozoin varlığı nedeniyle) ve sütun örgü içine kalacaktır.
- 50 mL parazit kültür ortamı kullanarak kolonu 50 mL parazit kültür ortamı ile yıkayın ve MANYETIK KOLONDAN IE'leri uzaklaştırın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'de 1,5,3'ten eluate'yi döndürün. Dikkatle supernatant atın ve parazit kültür ortamı1 mL yeniden askıya.
- Bir hemositometre kullanarak, son parazitmi (IEs yüzdesi) hesaplamak için, IEs sayısını (ışık mikroskobu ile kolayca koyu hemozoin pigmenti ile eritrositler olarak tanımlanır) ve toplam hücre numarası saymak.
NOT: Sadece en az % 80 saflıkta (%80 IEs) parazit kullanın. - Test için planlanan serum/antikor örneklerinin sayısına göre, ihtiyaç duyulan toplam SAY'ı tahmin edin ve parazit kültürlerini buna göre ölçeklendirin. %5 hematokrit ve %5-10 paraziti ile 25 mL kültüre sahip 75 cm2 kültür şişesi, tam 96 kuyu plakasını çalıştıracak kadar IE sağlamalıdır. Tam plaka (42 numune artı 6 kontrol) için en az 3,3 x 107 IEs/mL'de en az 1,5 mL parazit süspansiyonu gereklidir.
2. THP-1 hücreleri
NOT: Bu tsözde THP-1 hücre hattı kullanılır. Bu monosit hücre hattı monositik lösemi28 olan bir hastadan türetilmiştir ve ATCC'den satın alınabilir. HÜCRE satırını THP-1 kültür ortamındaki sağlayıcının talimatlarına göre koruyun (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Düzenli bakım için, hücre konsantrasyonu 8 x 105 hücre/mL'ye ulaştığında THP-1 hücre kültürünü 2-4 x 105 hücre/mL ve alt kültürolarak başlatın.
NOT: Hücre konsantrasyonunun 1 x 106 hücre/mL'yi aşmesine izin vermeyin ve geçiş sayısını takip edin. 25. geçidin ötesindeki hücrelerin kullanımından kaçının. THP-1 hücre hattının ortalama iki katına çıkarma süresi 19-50 saat arasında değişmektedir. Fagositöz deneylere başlamadan önce hücre toplu iki katına zaman belirleyin. Bu, test edilecek kararlı sayıda serum numunesi için gerekli kültür miktarını kabaca tahmin etmeye yardımcı olacaktır (örn. tam 96 kuyu plakası için, 5 x 105 hücre/mL'de 10 mL kültür gereklidir). - Daha önce15olarak açıklandığı gibi Fcγ-reseptörleri I (CD64), II (CD32) ve III (CD16) yüzey ekspresyonu için THP-1 hücrelerini periyodik olarak kontrol edin.
- Kısacası, thp-1 hücrelerini (ayrı ayrı) anti-CD64, anti-CD32 ve anti-CD16 floresan olarak etiketlenmiş antikorlar(Malzeme Tablosu)ile 30 dakika oda sıcaklığında (PBS'de %2 FBS'de hazırlanan 1:100 seyreltme) lekelayın.
- PBS'de %2 FBS ile üç kez yıkayın ve akış sitometrisi ile yüzey boyamasını ölçün.
NOT: THP-1 hücreleri CD16 için negatif, CD32 ve CD64 için daha önce bildirilen29,30 (Şekil 1)pozitiftir.
- Fagositoz analizi için, denemeden bir gün önce 2,5 x 105 hücre/mL içeren bir THP-1 hücre kültürü şişesi kurarak deneme gününde 5 x 105 hücre/mL civarında verim elde edin.
NOT: 4-6 x 105 hücre/mL'nin titrek gününde bulunduğundan emin olun.
3. Fagositositöz isme (Şekil S1)
- Teşbeye başlamadan önce, PBS'de steril %2 FBS kuyubaşına 150 μL kullanarak iki yuvarlak alt 96 kuyu plakasını (biri optimizasyon için, diğeri fagositoz için) bloke edin.
NOT: Etiket plaka sıcanda opsonizasyon plakası olarak ve ethidium bromür (EtBr) boyama ve opsonizasyon için hem kullanın. Etiket plakası 2 fagositoz plakası olarak ve hem THP-1 hücre kaplaması hem de fagositoz adımı için kullanın. - Parazit boyama ve opsonizasyon
- 1.6'da hazırlanan IE süspansiyonu alın ve parazit kültür ortamı nı ve EtBr'yi ekleyerek hücre sayısını 3,3 x 107 IEs/mL'ye ayarlayın ve 0,1 mg/mL'lik bir stoktan 2,5 g/mL (1:40 seyreltme) nihai konsantrasyonu elde edin.
NOT: EtBr parazit DNA'sını lekeler, akış sitometrisi ile tespit edilmesine izin verir.
DİkKAT: EtBr bir mutajen ve deri, göz ve solunum tahriş edici. Uygun korumayı kullanın ve atıkları yerel yönetmeliklere göre bertaraf edin. - 96 kuyu plakasından (opsonizasyon plakası) birinden blokaj çözeltisini çıkarın, plakayı hareket ettirin ve bir havlu kağıdı nın üzerindeki sıvı fazlalığı kaldırın.
- Yukarıda hazırlanan plakanın üst yarısında hazırlanan IE süspansiyonun kuyubaşına 30°L'lik kısmını ekleyin. Bir iyi boş bırakın ve parazit kültür ortamı 30 μL ekleyin (THP-1 tek başına kontrol için IEs olmadan). (Şekil S2A). Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka ve ışıktan korunmaktadır.
- Parazit kültür ortamının kuyu başına 170 μL ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'de döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine vurarak süpernatantı çıkarın.
- EtBr etiketli IE'leri, oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'da dönen parazit kültür ortamının kuyubaşına 200 μL'lik bir kısmını kullanarak iki kez daha yıkayın. İlk yıkamadan gelen supernatant plaka sıcarak çıkarılabilir. Yıkama ortamının tüm hacminin çıkarıldığından emin olmak için çok kanallı pipet kullanarak süpernatantı ikinci yıkamadan dikkatlice çıkarın. Peleti rahatsız etmeyin.
- Parazit kültür ortamında istenilen konsantrasyonlarda hazırlanan 30 μL antikor/plazma/serum çözeltisinde EtBr etiketli IE'leri yeniden askıya alın.
- Her zaman aşağıdaki kontrolleri içerir(Şekil S2B):IEs/THP-1 hücre kontrolü olmayan bir kontrol (parazit kültür ortamı); herhangi bir antikor veya plazma/serum (opsonize olmayan kontrol) olmadan bir kontrol; 1:100 seyreltme de ticari olarak kullanılabilir tavşan anti-insan eritrosit antikor kullanarak olumlu bir kontrol (Malzemeler Tablosubakınız); 1:5 seyreltme de iki negatif plazma / serum kontrolleri (sıtma-naif havuz ve sıtma yalıtkan erkeklerden bir havuz); ve 1:5 seyreltme de pozitif bir serum kontrolü (sıtmaya maruz kalan kadınlardan bir havuz, daha önce hamile olan (tercihen multigravidae)).
NOT: Pozitif kontrol için 1:100 seyreltme satın alınan antikor farklı gruplar arasında tutarlı bir şekilde çalışmak gibi görünüyor (veriler gösterilmez). Ancak, her yeni bir antikor toplu kullanıldığında birkaç seyreltme test ederek toplu gruplar arasındaki varyasyonları ekarte etmek önerilir. - 37 °C karanlıkta 45 dakika kuluçka.
- 1.6'da hazırlanan IE süspansiyonu alın ve parazit kültür ortamı nı ve EtBr'yi ekleyerek hücre sayısını 3,3 x 107 IEs/mL'ye ayarlayın ve 0,1 mg/mL'lik bir stoktan 2,5 g/mL (1:40 seyreltme) nihai konsantrasyonu elde edin.
- THP-1 hücre hazırlama ve fagositoksis
- IEs opsonized (3.2.8) iken, THP-1 hücreleri hazırlamaya başlar.
- THP-1 hücrelerini kültür şişesinden çıkarın, aşağı doğru döndürün (oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g), süpernatant'ı çıkarın ve THP-1 hücre kültürü ortamındaki peleti yeniden askıya alın.
- Tekrar döndürün (oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g), süpernatant'ı dekantlayın ve THP-1 hücre kültürü ortamının 1 mL'sinde hücre peletini yeniden askıya alın.
- Yukarıda hazırlanan çözeltideki hücre sayısını belirleyin ve 5 x 105 hücre/mL'lik son konsantrasyonu elde etmek için daha fazla ortam ekleyin.
- Plakayı hareket ettirerek ve bir havlu kağıdının üzerindeki sıvı fazlalığını çıkararak kalan 96 kuyu plakasından (fagositoz plakası) bloke solüsyonu çıkarın.
- 3.3.4'te hazırlanan THP-1 hücre süspansiyonunun kuyubaşına 100°L ekleyin ve hücre kültürü kuluçka makinesine geri koyun(Şekil S2C).
- Antikor/plazma/serum kuluçka süresi bittikten sonra parazit kültür ortamının kuyubaşına 170°L ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'de döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine vurarak süpernatantı çıkarın.
- Opsonize IE'leri parazit kültür ortamının kuyusu başına 200 μL'lik bir kuyu kullanarak iki kez daha yıkayın ve tabağı oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'da döndürün. İlk yıkamadan gelen supernatant plaka sıcarak çıkarılabilir. Yıkama ortamının tüm hacminin çıkarıldığından emin olmak için çok kanallı pipet kullanarak süpernatantı ikinci yıkamadan dikkatlice çıkarın. Peleti rahatsız etmeyin.
- Son olarak, önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamının 100 μL'lik opsonize iEs'ini yeniden askıya alın. Fagosittoz plakasındaki her kuyuya 50 μL opsonize IE süspansiyon aktarın. Toplam 100 μL'lik IE olduğundan, her antikor/serum seyreltme fagositositöz plakasında ki kopyalarda çalıştırılabilir (Şekil S2D)
NOT: Teşbede kullanılan IE ve THP-1 hücrelerinin miktarı 10:1 oranına karşılık gelir. - 37 °C, %5 CO2karanlıkta 40 dk kuluçka .
NOT: Fagositizin 40 dakikadan fazla devam etmesine izin vermeyin. - 4 °C 'de (500 x g, 5 dk) fagositoyu santrifüj ile durdurun ve plakayı hareket ettirerek süpernatantı atın. 150 μL oda sıcaklığında amonyum klorür lysing çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve tam 3 dakika boyunca tüple karıştırarak karıştırın.
NOT: Bu adım THP-1 hücreleri tarafından fagositoz edilmemiş eritrositleri ayrıştıracaktır. - PBS'ye 100 μL buz gibi %2 FBS ekleyerek lysis'i durdurun. Plakayı 4 °C'de (3 dk için 500 x g) döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine vurarak süpernatantı çıkarın.
- PBS'de 4°C'de (3 dk için 500 x g) dönen PBS'de buz gibi %2 FBS kuyusu başına 200 μL'lik bir kuyu kullanarak üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS'de 200 μL buz gibi %2 FBS'de yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile hemen analiz edin.
NOT: Önceki yayınlarda akış sitometrisi31'denönce %2 paraformaldehitte hücre fiksasyonu kullanılmıştır, ancak burada sunulan sonuçlar tahkikat tamamlandıktan hemen sonra elde edilmiştir. EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi hızla çürüyündiye(Şekil S3)4°C'de plakayı depolayarak akış sitometri veri sitometrisinin aktarılması önerilmez.
- Akış sitometri alımı ve analizi
NOT: 96 iyi plaka biçimini destekleyen ve EtBr floresansını ölçmek için uygun lazerlere/filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir.- Satın alma için, thp-1 hücrelerinde doğrusal ileri dağılım (FSC) ve doğrusal yan dağılım (SSC) çizimini kullanarak kuyuları kullanan kapı,(Şekil 2A)eklenmedi ve bu kapıda 10.000 olay elde edildi.
- ThP-1 kapısında bir histogram çizimi kullanarak EtBr (FL3-Log) için floresan şiddetini ölçün.
- Gating için, bir FSC vs SSC yoğunluk arsa THP-1 hücrelerinin ilk kapı, kuyular kullanılarak hiçbir IEs eklendi(Şekil 2A). Daha sonra THP-1 hücreleri (hiçbir IEs eklendi) ve un-opsonized kontrol(Şekil 2B)kullanarak, bir FL3 (EtBr) histogram pozitif bir kapı kurmak.
- Bu kapıları aynı plaka içinde test edilen diğer örneklerde kopyalayın ve EtBr-pozitif THP-1 hücrelerinin (en az bir IE fagositize edilmiş THP-1 hücreleri) yüzdesini belirleyin. Test edilen örneklerin her biri için fagositoz mutlak değerler (EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi) veya pozitif kontrolü maksimum olarak kullanarak yüzde olarak hesaplanan göreli fagositoz olarak rapor edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada ayrıntılı olarak31 tarif edilmiş ve kullanılan bir protokol sunmak11,12,13,14,15,16,17,18 THP-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagosityolis indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapasitesini ölçmek için.
Titrek özellikle antikor aracılı fagositoz ölçer ve bu nedenle THP-1 hücrelerinin yüzeyinde uygun Fc-reseptörleri ile etkileşim gereklidir. Bu nedenle protokolde belirtildiği gibi THP-1 hücrelerinin yüzeyindeki Fcγ-reseptörlerinin ekspresyonunun akış sitometrisi ile periyodik olarak kontrol edilmesi tavsiye edilir. Hücreler CD16(Şekil 1A)için negatif, CD32 ve CD64(Şekil 1B,C)için pozitif olmalıdır.
Tahsin için, saflaştırılmış geç evre KIE'ler EtBr ile etiketlendi ve sıtmaya maruz kalan bireylerin plazma/serumunda bulunan antikorlarla opsonize edildi. Fagositositaz akış sitometrisi ile ölçüldü, EtBr etiketli ve antikor-opsonize IEs ile 40 dk co-kuluçka sonra EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi ölçüldü. Başlangıçta, THP-1 hücreleri FSC vs SSC yoğunluk çizimi kullanılarak geçitlendi (Şekil 2A). Daha sonra, THP-1 hücrelerinde fl3 histogramı ve opsonize edilmemiş IE'ler kullanılarak bir EtBr+ belirteci oluşturuldu (Şekil 2B). Bu kapılar daha sonra diğer tüm kontrolleri analiz etmek ve örnekleri test etmek için kullanılmıştır.
Negatif kontroller (tek başına THP-1 hücreleri de dahil olmak üzere, un-opsonized IE kontrolü, ve sıtma-naif ve sıtmaya maruz erkek kontrolleri) tüm FL3 kanalında tek bir negatif tepe oluşturmalıdır(Şekil 3A) EtBr sadece birkaç olay ile+ marker. Buna göre, ortalama fagositoz değerleri hem mutlak EtBr+ THP-1 hücreleri olarak hem de göreceli fagositoz yüzdeleri çok düşük olmalıdır(Şekil 3B,C, normalde tüm olgular için %2'den az). Buna karşılık, pozitif kontroller (tavşan anti-insan eritrosit antikor ve sıtmaya maruz kalan kadın havuzu dahil) iki tepeli izler oluşturmalıdır(Şekil 3A): negatif bir (büyük ölçüde tüm negatif kontroller tarafından oluşturulan bir örtüşen) ve etbr+ marker içinde bulunan açıkça olumlu ve iyi ayrılmış bir. Olumlu bir örnek, sunulan örnek olarak (sıtmaya maruz kalan multigravid kadın/NF20 örneği) pozitif kontroller gibi benzer bir profil oluşturmalıdır. Mutlak EtBr+ THP-1 hücreleri ve göreceli fagositoz olarak ölçülen ortalama fagositoz değerleri normalde pozitif kontrol de en yüksekti (%58/100), onu sıtmaya maruz kalan kadın havuzu (%29/%53) ve ardından sıtmaya maruz kalan tek kadın (%23/40). Üç bağımsız deneyin sunulduğu Şekil 3B,C'dede görüldüğü gibi, deneyler arasında önemli bir değişkenlik vardı ve bu nedenle, aynı deneyde karşılaştırma amaçlı numunelerin çalıştırıldığını tavsiye ediyoruz. Elimizde, en az dört tam 96 kuyu plakaları tek bir deneyimli araştırmacı tarafından ele alınabilir. Tahliller arasındaki değişkenlik, sıtmaya maruz kalan kadınlardan alınan birkaç serum örneğini test eden iki özdeş deney aynı anda yapıldığında da açıkça gözlenmiştir. Aynı parazit hazırlığı (geç evre IE'lerin manyetik saflaştırılmasından sonra) ve serum seyreltmeleri kullanıldı. THP-1 hücreleri iki ayrı şişede tutuldu ancak aynı ilk şişeden tohumlandı ve deneyler iki farklı araştırmacı tarafından yapıldı. Tahsin ayrı yapıldığında tutarlı sonuçlar üretiyor gibi görünse de, iki deneyde ölçülen fagositoz değerleri arasındaki sıkı doğrusal korelasyonlar (r>0.9) ile iki deneyde ölçülen fagositoz değerleri birbirinden saparak farklı deneylerde üretilen değerlerin aynı olmadığını gösterir. Bu sapma, göreli değerlere (eğim katsayısı güven aralığı 0.68-1) göre mutlak değerler (eğim katsayısı güven aralığı 0.55-0.72) için daha belirgindi (Şekil 4). Bu nedenle, özellikle bazı nedenlerden dolayı (örn. yeterli saflaştırılmış IE, 4'ten fazla tam plaka, vb.) tüm örnekleri tek bir deneyde çalıştırmak mümkün değilse, göreli değerler kullanmanızı öneririz. Ayrıca, PfEMP1 ekspresyonunda (ve diğer antijenlerin) sürüklenme nedeniyle ekstra varyasyon lar getirilmesini ve kültürde uzun süre boyunca THP-1 hücrelerindeki ince farklılıklar nedeniyle, karşılaştırmalı analize yönelik deneyleri en kısa sürede çalıştırmanızı öneririz.
Şekil 1: THP-1 hücre yüzeyinde ifade edilen fc reseptörleri.
(A) Fcγ-reseptör III/CD16 (kırmızı). (B) Fcγ-reseptör II/CD32 (yeşil). C. Fcγ-reseptör I/CD64 (turuncu). Etiketlenmemiş hücreler mavi renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akış sitometri gating stratejisi.
(A) THP-1 hücreleri FSC/SSC . (B) Ethidium bromür pozitif (EtBr+) THP-1 hücreleri fl3 histogramında. THP-1 hücreleri tek başına/hiçbir IE eklendi (mavi), THP-1 hücreleri un-opsonized IEs (yeşil) ile kuluçkaya yatan ve THP-1 hücreleri pozitif kontrol (kırmızı) ile opsonize iEs ile inkülmüş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: THP-1 hücreleri tarafından IT4VAR04-IEs fagositositisi.
(A) B'de sunulan deneylerden birinin (daha büyük sembollerle tanımlanan) temsili akış sitometri histogramları. (B) EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi (üç bağımsız deneyin anlamı ve standart sapmaları). (C) B'deki verilerle aynı, karşılık gelen pozitif kontrole karşı normalleştirmeden sonra. Renk kodlama tüm panellerde aynıdır: THP-alone (siyah), un-opsonized / no antikor kontrolü (mavi), sıtma-naif kontrol (camgöbeği), sıtma yassı erkek havuzu (yeşil), sıtmaya maruz kadın havuzu (turuncu), sıtmaya maruz kadın donör (pembe), ve pozitif kontrol / tavşan anti-insan eritrositler (kırmızı). Ortalama ve standart sapmalar gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: IT4VAR04 IE'lerin THP-1 hücreleri tarafından 10 sıtmaya maruz kalan kadından serum ile opsonizasyon üzerine fagositositosisi.
Çizimler aynı gün gerçekleştirilen iki özdeş deneyler için doğrusal regresyon analizi mevcut, ancak farklı araştırmacılar tarafından. (A) Mutlak değerler olarak sunulan veriler ve (B)bağıl fagositöz değerleri. İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak yapılan analizler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: Fagositositöz istihit akış şeması. Taşkının ana adımlarını gösteren akış şeması. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S2: 96 iyi plaka deney düzeni. (A) IEs EtBr etiketleme düzeni. (B) Optimizasyon düzeni; 6 kuyu her zaman kontroller için ayrılmıştır. (C) THP hücreleri kaplama için düzen. (D) Fagositöz için düzen. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S3: Şekil 3'teki gibi renk kodlaması. (A) Bir deneyin akış sitometri sitogram kaplaması hemen elde edilir ve (B) 4 °C'de saklanmasından sonra 12 saat. (C) Depodan önce ve sonra ölçülen EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi. NF## sıtmaya maruz kalan farklı kadın bağışçıları temsil ediyor. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol daha önce tanımlanmış ve thp-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagositoz indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapasitesini ölçmek için12,15,17,31 kullanılmıştır. Burada sunulan sonuçlar, P. falciparum endemik bölgede yaşayan kadınların plazma/serumunda doğal olarak edinilmiş VAR2CSA spesifik antikorlara odaklanabedilir. VAR2CSA, IE'lerin plasental sekansasyonunda yer alan bir PfEMP1 türüdür ve PM patogenezinde önemli bir belirleyicidir.
Test, test edilen antikorların THP-1 hücreleri (CD32 ve CD64) tarafından ifade edilen insan Fcγ-reseptörleri ile etkileşime geçmesi koşuluyla, immunizasyon ve/veya diğer PfEMP1 varyantlarını veya IE yüzeyinde bulunan diğer parazit antijenleri hedeflemek tarafından indüklenen antikorlar için kullanılabilir. Tahlil basit, yüksek iş bölümü (büyük örnek lemlerin analizine izin verir) ve bir günde gerçekleştirilebilir. Fagositoz akış sitometrisi ile ölçülür, EtBr etiketli ve antikor-opsonize IEs ile 40 dk co-kuluçka sonra EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi ölçülür.
Tahmon deneysel kopyalar üzerinde tutarlı sonuçlar verse de, ölçülen mutlak değerler arasında değişkenlik vardır ve bu nedenle, her zaman dahil edilmesi gereken pozitif bir denetim kullanarak göreli değerlerin hesaplanmasını öneririz. Ayrıca, yukarıda anlatıldığı gibi ara test varyasyonundan kaçınmak için tüm numuneleri tek bir denemede test edilecek şekilde çalıştırmanızı öneririz. P. falciparum enfeksiyonuna maruz kalan bireylerden alınan serum örnekleri test edilirken, her zaman naif bireylerden alınan bir dizi numunenin kontrol grubu olarak kullanılmasını öneririz. Bu denetim grubu, test örneklerinden hangisinin pozitif olarak kabul edileeceğini belirlemek için bir eşik ayarlamak için kullanılabilir.
Daha önce farklı sıtma klinik sunumları (şiddetli vs hafif)17olan çocuklardan toplanan sera nın fagositoz-indükleme kapasitesini karşılaştırmak için bu yaklaşımı kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Maiken Visti mükemmel teknik yardım için teşekkür edilir. Bu çalışma kısmen Danimarka Dışişleri Bakanlığı'ndan bir hibe (MAVARECA II; 17-02-KU) tarafından finanse edilmiş ve Danida Burs Merkezi tarafından yönetilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
