Summary
L’objectif global de ce protocole est de fournir des instructions sur la façon de mesurer la capacité des anticorps présents dans les sérums ou le plasma des individus, naturellement exposés à l’infection de Plasmodium falciparum, d’opsoniser et d’induire la phagocytose des érythrocytes infectés par le parasite (EI).
Abstract
Le protocole décrit comment mettre en place et exécuter un test de phagocytose à base de cytométrie de flux de Plasmodium falciparum-infectés érythrocytes (IE) opsonized par des anticorps IgG naturellement acquis spécifiques pour VAR2CSA. VAR2CSA est l’antigène parasite qui joue un médiateur dans la séquestration sélective des EI dans le placenta qui peut causer une forme grave de paludisme chez les femmes enceintes, appelée paludisme placentaire (PM). La protection contre les PARTICULES est médiée par des anticorps spécifiques à VAR2CSA qui sont censés fonctionner en inhibant la séquestration placentaire et/ou en opsonisant les EI pour la phagocytose. L’essai emploie des IE synchronisés à un stade avancé qui ont été sélectionnés in vitro pour exprimer VAR2CSA, plasma/sérique-anticorps de femmes avec l’immunité naturellement acquise pm-spécifique, et la ligne de cellules phagocytiques THP-1. Cependant, le protocole peut facilement être modifié pour évaluer la fonctionnalité des anticorps à tout antigène parasite présent sur la surface de l’IE, qu’il soit induit par une exposition naturelle ou par la vaccination. L’essai offre une évaluation simple et à haut débit, avec une bonne reproductibilité, d’un aspect fonctionnel important de l’immunité sous médiation des anticorps dans le paludisme. Il est donc utile lors de l’évaluation de l’immunité clinique contre le paludisme à P. falciparum, une cause majeure de morbidité et de mortalité sous les tropiques, en particulier en Afrique subsaharienne.
Introduction
Le paludisme est une maladie à transmission vectorielle causée chez l’homme lors de l’infection par cinq espèces différentes du genre Plasmodium. L’espèce la plus répandue est P. falciparum, qui est également responsable de la plus grande morbidité et mortalité1. La présentation clinique du paludisme varie des infections asymptomatiques ou bénignes aux maladies compliquées/graves, ces dernières se produisant principalement chez les enfants de moins de cinq ans. L’exposition à P. falciparum n’induit pas l’immunité stérile, mais les individus vivant dans les zones endémiques développent lentement l’immunité contre la maladie clinique. La protection dépend de l’âge et de l’exposition et l’immunité est normalement acquise au cours des 5 à 10 premières années de vie2. Les femmes adultes sont une exception importante, car le paludisme sévère peut se produire pendant la grossesse dans une présentation clinique connue sous le nom de paludisme placentaire (PM). Le PM est une cause importante d’avortement, de mortinaissance, d’accouchement prématuré, de faible poids à la naissance, de mort fœtale et d’anémie maternelle. La résistance au PM se développe au cours des grossesses successives3. La protection contre les PARTICULES est associée à l’acquisition d’anticorps contre le type VAR2CSA PfEMP14,5, un antigène de surface infecté par l’érythrocyte (EI) qui se lie au sulfate de chondroïne A (ASC) permettant la séquestration de l’IE dans le placenta. Anticorps mediatise protection effectuant diverses activités fonctionnelles (examinés dans6,7) y compris l’opsonisation des IE pour induire la phagocytose. Des études in vitro précoces ont montré que les anticorps peuvent limiter la croissance de P. falciparum en présence de monocytes par phagocytose8,9. Des études plus récentes ont montré que des niveaux plus élevés d’anticorps induisant la phagocytose sont associés à de meilleurs résultats de la grossesse (dans le contexte de la co-infection par le VIH)10,11, indiquant la pertinence de cette fonction effecteur dans la réponse immunitaire acquise naturellement.
Ici, nous présentons un protocole pour mesurer cette fonction des anticorps présents dans le plasma humain / sérum, en utilisant in vitro cultivés IEs exprimant VAR2CSA avec la ligne de monocytes THP-1. L’essai a été précédemment utilisé11,12,13,14 ,15,16,17,,18 et est considéré comme une approche améliorée et plus facile par rapport aux protocoles antérieurs à base de microscope8, car il permet l’essai d’un plus grand nombre d’échantillons d’anticorps en une seule course en utilisant de plus petits volumes d’anticorps et en évitant le comptage fastidieux et biaisé de la microscopie.17 Même si l’essai a été utilisé par plusieurs laboratoires et que son exécution est assez simple, il nécessite une planification et une préparation minutieuses, par conséquent, un protocole détaillé permettrait son application par des laboratoires et des chercheurs dépourvus d’expérience antérieure. Nous utilisons, à titre d’exemple, des IE synchronisés à un stade avancé exprimant l’opsonized VAR2CSA avec des anticorps présents dans le sérum recueilli auprès des femmes atteintes d’une immunité spécifique aux PARTICULES naturellement acquise. Cependant, le protocole peut facilement être modifié pour évaluer la fonctionnalité des anticorps à tout antigène parasite présent sur la surface de l’IE, qu’il soit induit par une exposition naturelle ou par la vaccination.
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Protocol
Les échantillons de sérum humain utilisés pour les résultats présentés ici ont été prélevés dans une étude distincte19. La collecte a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel du Noguchi Memorial Institute for Medical Research de l’Université du Ghana (étude 038/10-11) et par les Comités régionaux d’éthique de la recherche de la région de la capitale du Danemark (protocole H-4-2013-083).
1. Culture parasite
REMARQUE : Suivez les règlements locaux pour la manipulation des agents pathogènes humains.
- Maintenir les parasites P. falciparum selon le protocole standard tel que décrit avant20 dans le milieu de culture parasite (voir tableau des matériaux).
- Gardez les parasites étroitement synchronisés à l’aide du traitement sorbitol comme décrit précédemment21.
- Pour assurer l’expression VAR2CSA à la surface de l’IE, effectuer des cycles répétés de sélection immunomagnétienne à l’aide d’un anticorps anti-VAR2CSA (p. ex., anticorps PAM1.4, un igG22monoclonal humain interréactinel spécifique à l’IgG 22 ) couplé à des perles g-magnétiques protéiques23.
- En bref, incuber la trophozoïte-IEs à un stade avancé avec des perles magnétiques couplées à un anticorps anti-VAR2CSA et sélectionner positivement à l’aide d’un aimant.
- Développez les parasites sélectionnés en culture pendant quelques cycles jusqu’à ce que la parasitemie soit d’au moins 5%.
- Sinon, sélectionnez les parasites qui se lient à l’ASC immobilisée en plastique (le récepteur de VAR2CSA) comme décrit précédemment24.
- Pour vérifier l’expression VAR2CSA sur les parasites sélectionnés effectuer la cytométrie de flux comme précédemment décrit25.
- En bref, étiqueter la trophozoïte-IEs à un stade avancé avec le même anticorps utilisé pour la sélection magnétique (étape 1.3) suivie d’un anticorps secondaire fluorescent.
- Mesurer la réactivité de surface de l’IE par cytométrie de flux. La sélection réussie d’anticorps donne normalement lieu à une population de parasites qui exprime VAR2CSA dans la plupart des parasites (≈80 %).
- Pour l’essai de phagocytose, utilisez la trophozoïte-IEs purifiée de milieu à tard-étape. Effectuer la purification à l’aide de la séparation magnétique comme décrit précédemment26.
REMARQUE : Pour déterminer avec précision le stade des parasites, effectuer la coloration de Giemsa sur les frottis sanguins suivis d’une légère observation de la microscopie. Suivre les procédures standard et les lignes directrices morphologiques décrites avantle 27. La purification à un stade avancé peut également être effectuée à l’aide d’un milieu de gradient de densité. Le rendement de l’IE, cependant, dans notre expérience est plus faible et, par conséquent, la purification magnétique est préférable.- Pour la séparation magnétique, faites tourner la culture parasite (5-10% parasitemia) à 500 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer le supernatant et re-suspendre le granulé cellulaire dans 10 mL de milieu de culture parasite.
- Ajoutez la suspension parasite dans une colonne CS couplée à un aimant (voir Tableau des matériaux)et laissez-la passer lentement à travers la colonne. Trophozoïte-EI sont paramagnétiques (en raison de la présence d’hémozoïne) et resteront dans le maillage de colonne.
- Laver la colonne avec 50 mL de milieu de culture parasite et elute les IE de la colonne magnétique à l’aide de 50 mL de milieu de culture parasite.
- Faire tourner l’éluate de 1,5,3 à 500 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter soigneusement le supernatant et re-suspendre dans 1 mL de milieu de culture parasite.
- À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre d’EI (facilement identifiés par microscopie légère comme érythrocytes avec pigment d’hémozoïne foncée) et le nombre total de cellules pour calculer la parasitemia final (pourcentage d’IE).
REMARQUE : N’utilisez que des parasites d’au moins 80 % de pureté (80 % d’EIE). - En fonction du nombre d’échantillons de sérum/anticorps prévus pour les tests, estimer la quantité totale d’EI nécessaires et augmenter les cultures de parasites en conséquence. Un flacon de culture de 75 cm2 avec 25 ml de culture à 5% d’hématocrit et de 5 à 10% de parasitemia devrait produire suffisamment d’EE pour exécuter une plaque complète de 96 puits. Pour une plaque complète (42 échantillons plus 6 contrôles en double), un minimum de 1,5 mL de suspension parasite à 3,3 x 107 IE/mL sont nécessaires.
2. Cellules THP-1
REMARQUE : La ligne de cellule THP-1 est utilisée dans ce test. Cette lignée de cellules monocytes est dérivée d’un patient atteint de leucémie monocytique28 et peut être achetée auprès d’ATCC. Maintenir la ligne cellulaire conformément aux instructions du fournisseur dans le support de culture THP-1 (voir tableau des matériaux).
- Pour un entretien régulier, commencez la culture cellulaire THP-1 à 2-4 x 105 cellules/mL et la sous-culture lorsque la concentration cellulaire atteint 8 x 105 cellules/mL.
REMARQUE : Ne laissez pas la concentration cellulaire dépasser 1 x 106 cellules/mL et ne laissez pas suivre le nombre de passages. Évitez l’utilisation de cellules qui sont au-delà du passage 25. Le temps moyen de doublement de la ligne cellulaire THP-1 varie entre 19-50 h. Déterminer le temps de doublement du lot de cellules avant de commencer les expériences de phagocytose. Cela aidera à estimer à peu près la quantité nécessaire de culture nécessaire pour un nombre déterminé d’échantillons de sérum à tester (par exemple, pour une plaque complète de 96 puits, 10 mL de culture à 5 x 105 cellules/mL sont nécessaires). - Vérifiez périodiquement les cellules THP-1 pour l’expression de surface des récepteurs Fcγ I (CD64), II (CD32) et III (CD16) comme décrit précédemment15.
- En bref, tachez les cellules THP-1 (séparément) avec des anticorps anti-CD64, anti-CD32 et anti-CD16 étiquetés fluorescents (Table des matériaux) pendant 30 min à température ambiante (1:100 dilution préparée dans 2% FBS dans PBS).
- Laver trois fois avec 2% FBS dans PBS et mesurer la coloration de surface par cytométrie de flux.
REMARQUE : Les cellules THP-1 sont négatives pour cd16 et positives pour cd32 et CD64 comme indiqué précédemment29,30 ( Figure1).
- Pour l’essai de phagocytose, mettre en place un flacon de culture cellulaire THP-1 avec 2,5 x 105 cellules/mL la veille de l’expérience pour produire environ 5 x 105 cellules/mL le jour de l’essai.
REMARQUE : Assurez-vous que 4-6 x 105 cellules/mL sont présentes le jour de l’essai.
3. Test de phagocytose (figure S1)
- Avant de commencer l’essai, bloquez (>1 h) deux plaques de puits de 96 à fond rond (l’une pour l’opsonisation et l’autre pour la phagocytose) à l’aide de 150 μL par puits de HBS stérile de 2 % dans pbs.
REMARQUE : Étiquette la plaque 1 comme plaque d’opsonisation et l’utiliser à la fois pour la coloration et l’opsonisation du bromure d’éthidium (EtBr). Étiquette plaque 2 comme plaque de phagocytose et utiliser à la fois pour le placage cellulaire THP-1 et pour l’étape de phagocytose. - Coloration et opsonisation des parasites
- Prenez la suspension IE préparée en 1,6 et ajustez le nombre de cellules à 3,3 x10 7 EE/mL en ajoutant un milieu de culture parasite et EtBr pour obtenir une concentration finale de 2,5 μg/mL (dilution de 1:40, à partir d’un stock de 0,1 mg/mL).
REMARQUE : EtBr tache l’ADN du parasite, permettant la détection par cytométrie de flux.
ATTENTION : EtBr est un irritant mutané et de peau, d’oeil et de respiratoire. Utiliser une protection appropriée et éliminer les déchets conformément à la réglementation locale. - Retirez la solution de blocage de l’une des 96 plaques de puits (plaque d’opsonisation), en faisant glisser la plaque et en enlevant l’excès liquide sur un morceau de papier absorbant.
- Ajouter 30 μL par puits de la suspension IE préparée ci-dessus dans la moitié supérieure de la plaque. Laissez un puits vide et ajoutez 30 μL de milieu de culture parasite (sans IE pour le contrôle THP-1 seul). (Figure S2A). Incuber pendant 10 min à température ambiante et à l’abri de la lumière.
- Ajouter 170 μL par puits de milieu de culture parasite. Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante et retirez le supernatant en faisant glisser la plaque sur un contenant de déchets approprié.
- Laver les IE étiquetés EtBr deux fois de plus à l’aide de 200 μL par puits de culture parasite moyenne tournant la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante. Le supernatant du premier lavage peut être enlevé en feuilletant la plaque. Retirez soigneusement le supernatant du deuxième lavage à l’aide d’une pipette multicanal pour vous assurer que tout le volume du milieu de lavage est enlevé. Ne pas déranger le granulé.
- Re-suspendre les IE étiquetés EtBr dans 30 μL de solution anticorps/plasma/sérum préparées aux concentrations souhaitées dans le milieu de culture parasite.
- Incluez toujours les contrôles suivants (Figure S2B) : un contrôle sans contrôle des cellules IE/THP-1 (milieu de culture parasite); un contrôle sans anticorps ni plasma/sérum (contrôle non opsonisé); un contrôle positif à l’aide de l’anticorps anti-humain d’érythrocyte de lapin disponible dans le commerce à 1:100 dilution (voir tableau des matériaux); deux contrôles plasma/sérum négatifs à 1:5 dilution (une piscine naïve au paludisme et une piscine de mâles exposés au paludisme); et un contrôle positif du sérum à 1:5 dilution (un pool de femmes exposées au paludisme, qui ont déjà été enceintes (de préférence multigravidae)).
REMARQUE : Une dilution de 1:100 pour le contrôle positif semble fonctionner uniformément entre différents lots d’anticorps achetés (données non montrées). Cependant, il est recommandé d’exclure les variations entre les lots en testant plusieurs dilutions chaque fois qu’un nouveau lot d’anticorps est utilisé. - Incuber pendant 45 min dans l’obscurité à 37 °C.
- Prenez la suspension IE préparée en 1,6 et ajustez le nombre de cellules à 3,3 x10 7 EE/mL en ajoutant un milieu de culture parasite et EtBr pour obtenir une concentration finale de 2,5 μg/mL (dilution de 1:40, à partir d’un stock de 0,1 mg/mL).
- Préparation et phagocytose des cellules THP-1
- Pendant que les IE sont opsonisées (3.2.8), commencez à préparer les cellules THP-1.
- Retirez les cellules THP-1 de la fiole de culture, faites-les tourner vers le bas (500 x g pendant 5 min à température ambiante), décantez le supernatant et re-suspendez le granulé dans le milieu de culture cellulaire THP-1.
- Tourner à nouveau (500 x g pendant 5 min à température ambiante), décanter le supernatant et re-suspendre le granulé cellulaire dans 1 mL de THP-1 milieu de culture cellulaire.
- Déterminer le nombre de cellules dans la solution préparée ci-dessus et ajouter plus de milieu pour obtenir une concentration finale de 5 x 105 cellules/mL.
- Retirez la solution de blocage de la plaque de puits restante de 96 (plaque de phagocytose) en faisant glisser la plaque et en éliminant l’excès liquide sur un morceau de papier essuie-tout.
- Ajouter 100 μL par puits de la suspension cellulaire THP-1 préparée en 3.3.4 et remettre dans l’incubateur de culture cellulaire (Figure S2C).
- Une fois le temps d’incubation de l’anticorps/plasma/sérique terminé, ajoutez 170 μL par puits de milieu de culture parasite. Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante et retirez le supernatant en faisant glisser la plaque sur un contenant de déchets approprié.
- Laver les IEs opsonisés deux fois de plus à l’aide de 200 μL par puits de culture parasite moyenne, en faisant tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante. Le supernatant du premier lavage peut être enlevé en feuilletant la plaque. Retirez soigneusement le supernatant du deuxième lavage, à l’aide d’une pipette multicanal pour vous assurer que le volume entier du milieu de lavage est enlevé. Ne pas déranger le granulé.
- Enfin re-suspendre les IE opsonized dans 100 μL de pré-réchauffé THP-1 milieu de culture cellulaire. Transférer 50 μL de suspension IE opsonisée dans chaque puits de la plaque de phagocytose. Puisqu’il y a un total de 100 μL d’IE, chaque dilution anticorps/sérum peut être exécuté en doublons dans la plaque de phagocytose (Figure S2D)
REMARQUE : La quantité d’IE et de cellules THP-1 utilisées dans l’essai correspond à un ratio de 10:1. - Incuber pendant 40 min dans l’obscurité à 37 °C, 5% CO2.
REMARQUE : Ne laissez pas la phagocytose se poursuivre pendant plus de 40 min. - Arrêter la phagocytose par centrifugation à 4 °C (500 x g, 5 min) et jeter le supernatant en faisant glisser la plaque. Ajouter 150 μL de solution de lysage de chlorure d’ammonium à température ambiante(Table des matériaux)et mélanger par pipetage, incuber pendant exactement 3 min.
REMARQUE : Cette étape lysera les érythrocytes qui n’ont pas été phagocytoses par les cellules THP-1. - Arrêtez la lyse en ajoutant 100 μL de HBS de 2 % de glace dans pbs. Faites tourner la plaque à 4 °C (500 x g pendant 3 min) et retirez le supernatant en faisant glisser la plaque sur un contenant de déchets approprié.
- Laver trois fois à l’aide de 200 μL par puits de 2 % de FBS glacés dans pbs tournant la plaque à 4 °C (500 x g pendant 3 min). Après le lavage final, re-suspendre dans 200 μL de glace 2% FBS dans PBS et immédiatement analyser par cytométrie de flux.
REMARQUE : Les publications précédentes ont employé la fixation de cellule dans le paraformaldéhyde de 2% avant la cytométrie de flux31, mais les résultats présentés ici ont été acquis immédiatement après l’achèvement d’essai. Il n’est pas recommandé de reporter l’acquisition de données de cytométrie par le stockage de la plaque à 4°C, puisque le pourcentage de cellules EtBr+ THP-1 se désintègre rapidement (Figure S3).
- Acquisition et analyse de la cytométrie des flux
REMARQUE : Tout cytomètre de flux prenant en charge le format de plaque de puits 96 et ayant les lasers/filtres appropriés pour mesurer la fluorescence d’EtBr peut être employé.- Pour l’acquisition, la porte sur les cellules THP-1 utilisant une parcelle linéaire de dispersion avant (FSC) vs parement latéral linéaire (SSC) utilisant les puits n’a été ajoutée (figure 2A)et n’a pas acquis 10 000 événements sur cette porte.
- Mesurer l’intensité de fluorescence pour EtBr (FL3-Log) sur la porte THP-1 à l’aide d’une parcelle d’histogramme.
- Pour la gation, la première porte sur les cellules THP-1 dans une parcelle de densité FSC vs SSC, en utilisant les puits n’étaient pas des IE ont été ajoutés (Figure 2A). Ensuite, installez une porte positive dans un histogramme FL3 (EtBr), à l’aide des cellules THP-1 (pas d’IEs ajouté) et du contrôle non opsonisé (Figure 2B).
- Copiez ces portes dans tous les autres échantillons testés dans la même plaque et déterminez le pourcentage de cellules THP-1 positives d’EtBr (cellules THP-1 qui ont phagocytisé au moins un IE). Pour chacun des échantillons testés, la phagocytose peut être signalée comme les valeurs absolues (pourcentage de cellules EtBr+ THP-1) ou comme phagocytose relative calculée en pourcentage en utilisant le contrôle positif comme maximum.
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Representative Results
Ici, nous présentons en détail un protocole qui a déjà été décrit31 et utilisé11,12,13,14,15,16,17,18 pour mesurer la capacité des anticorps ciblant la surface de P. falciparum IEs pour induire l’opsonisation et la phagocytose par les cellules THP-1.
L’essai mesure spécifiquement la phagocytose à médiation anticorps et, par conséquent, l’interaction avec les récepteurs Fc appropriés à la surface des cellules THP-1 est nécessaire. Pour cette raison, et comme mentionné dans le protocole, nous recommandons de vérifier périodiquement l’expression des récepteurs Fcγ à la surface des cellules THP-1 par cytométrie de flux. Les cellules doivent être négatives pour cd16 (figure 1A) et positives pour cd32 et CD64 (figure 1B,C).
Pour l’essai, les IE purifiés à un stade avancé ont été étiquetés avec etBr, puis opsonisés avec des anticorps présents dans le plasma/sérum des individus naïfs du paludisme ou exposés au paludisme. La phagocytose a été mesurée par cytométrie de flux, quantifiant le pourcentage de cellules EtBr+ THP-1 après 40 min co-incubation avec EtBr-étiqueté et anticorps-opsonized IEs. Au départ, les cellules THP-1 étaient fermées à l’aide d’une parcelle de densité FSC vs SSC (Figure 2A). Ensuite, un marqueur EtBr+ a été créé, à l’aide d’un histogramme FL3 sur les cellules THP-1 et les IE non opsonisés (Figure 2B). Ces portes ont ensuite été utilisées pour analyser tous les autres contrôles et tester des échantillons.
Les contrôles négatifs (y compris les cellules THP-1 seules, le contrôle non opsonisé de l’IE et les contrôles avec les mâles naïfs du paludisme et exposés au paludisme) devraient tous générer un pic négatif unique dans le canal FL3 (Figure 3A) avec seulement peu d’événements dans le marqueur EtBr+ . En conséquence, les valeurs moyennes de phagocytose à la fois comme cellules absolues EtBr+ THP-1 et en tant que pourcentages relatifs de phagocytose devraient être très faibles(figure 3B,C, normalement inférieure à 2% pour tous les cas). En revanche, les contrôles positifs (y compris l’anticorps anti-humain d’érythrocyte de lapin et le pool femelle exposé au paludisme) devraient générer des traces avec deux pics(figure 3A) : un négatif (largement se chevauchant avec celui généré par tous les contrôles négatifs) et un clairement positif et bien séparé situé à l’intérieur de l’EtBr+ marqueur. Un échantillon positif, comme l’exemple présenté (échantillon d’une femme multigravide exposée au paludisme/NF20) devrait générer un profil similaire aux contrôles positifs. Les valeurs moyennes de phagocytose, mesurées sous forme de cellules etbr- THP-1 absolues et de phagocytose relative, étaient normalement les plus élevées pour le contrôle positif (58 %/100 %), suivies par le bassin féminin exposé au paludisme (29 %/53 %), puis par la femme exposée au paludisme unique (23 %/40 %). Comme l’a observé la figure 3B,C, où trois expériences indépendantes sont présentées, il y avait une variabilité considérable entre les expériences et nous recommandons donc de faire exécuter des échantillons destinés à la comparaison dans la même expérience. Dans nos mains, au moins quatre plaques complètes de 96 puits peuvent être manipulées par un seul chercheur expérimenté. La variabilité entre les tests a également été clairement observée lorsque deux expériences identiques testant plusieurs échantillons de sérum de femmes exposées au paludisme ont été effectuées simultanément. La même préparation de parasite (après purification magnétique des IE de stade avancé) et les dilutions de sérum ont été employées. Les cellules THP-1 ont été conservées dans deux flacons distincts, mais ensemencées à partir du même flacon initial et les expériences ont été réalisées par deux chercheurs différents. Même si l’essai semble générer des résultats cohérents lorsqu’il est effectué séparément, avec des corrélations linéaires serrées (r>0.9 pour les valeurs absolues et relatives de phagocytose) entre les valeurs de phagocytose mesurées dans les deux expériences, le coefficient de pente des lignes ajustées s’écarte d’une, indiquant que les valeurs générées dans différentes expériences n’étaient pas identiques. Cet écart était plus évident pour les valeurs absolues (intervalle de confiance du coefficient de pente 0,55-0,72) par rapport aux valeurs relatives (intervalle de confiance du coefficient de pente 0,68-1) (figure 4). Nous recommandons donc d’utiliser des valeurs relatives, surtout si, pour une raison quelconque (p. ex., pas assez d’EIE purifiées, plus de 4 plaques complètes, etc.), il n’est pas possible d’exécuter tous les échantillons dans une seule expérience. Nous recommandons également d’exécuter des expériences destinées à l’analyse comparative dans les plus brefs délais, afin d’éviter d’introduire des variations supplémentaires dues à la dérive dans l’expression PfEMP1 (ainsi que d’autres antigènes) et en raison de différences subtiles sur les cellules THP-1 à temps prolongé dans la culture.
Figure 1 : Récepteurs fc exprimés sur la surface cellulaire THP-1.
(A) Fcγ-récepteur III/CD16 (rouge). (B) Fcγ-récepteur II/CD32 (vert). C. C. Récepteur fcγ I/CD64 (orange). Les cellules non étiquetées sont indiquées en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stratégie de gating de cytométrie de flux.
(A) Cellules THP-1 fermées sur FSC/SSC. (B) Bromure d’ethidium positive (EtBr+) cellules THP-1 dans un histogramme FL3. Les cellules THP-1 seules/pas d’IEs ajoutées (bleues), les cellules THP-1 incubées avec des IEs non opsonisées (verts) et les cellules THP-1 incubées avec iEs opsonized avec un contrôle positif (rouge) sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Phagocytose des cellules IT4VAR04-IE par les cellules THP-1.
(A) Histogrammes de cytométrie de flux représentatifs de l’une des expériences présentées en B (identifiés par des symboles plus grands). (B) Pourcentage de cellules EtBr+ THP-1 (moyens et écarts types de trois expériences indépendantes). (C) Mêmes données que dans b, après normalisation par rapport au contrôle positif correspondant. Le codage des couleurs est le même dans tous les panneaux : THP-alone (noir), non-opsonized/pas de contrôle d’anticorps (bleu), lutte antipaludique (cyan), piscine mâle exposée au paludisme (vert), piscine femelle exposée au paludisme (orange), un donneur féminin exposé au paludisme (rose), et contrôle positif/érythrocytes anti-humains de lapin (rouge). Les écarts moyens et standards sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Phagocytose des IE IT4VAR04 par les cellules THP-1 lors de l’opsonisation avec le sérum de 10 femmes exposées au paludisme.
Les parcelles présentent une analyse de régression linéaire pour deux expériences identiques réalisées le même jour, mais par différents chercheurs. (A) Données présentées comme des valeurs absolues et comme (B) valeurs relatives à la phagocytose. Analyse effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure S1 : Diagramme de débit d’essai de phagocytose. Diagramme de flux représentant les étapes principales de l’essai. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
Figure S2 : disposition d’expérience de plaque de puits 96. (A) Mise en page pour l’étiquetage IEs EtBr. (B) Disposition pour l’opsonisation; 6 puits sont toujours réservés aux commandes. (C) Disposition pour le placage des cellules THP. (D) Disposition pour la phagocytose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
Figure S3 : Codage de couleur comme à la figure 3. (A) Superposition d’histogramme de cytométrie de flux d’une expérience acquise immédiatement et (B) après stockage à 4 °C pendant 12 h. (C) Pourcentage de cellules EtBr+ THP-1 mesurées avant et après le stockage. NF## représente différentes donatrices exposées au paludisme. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté ici a été précédemment décrit et utilisé12,15,17,31 pour mesurer la capacité des anticorps ciblant la surface des IEs de P. falciparum pour induire l’opsonisation et la phagocytose par les cellules de THP-1. Les résultats présentés ici se concentrent sur les anticorps naturellement acquis var2CSA-spécifiques dans le plasma / sérum des femmes vivant dans une région endémique P. falciparum. VAR2CSA est un type de PfEMP1 impliqué dans la séquestration placentaire des EI, et un déterminant clé dans la pathogénie des PM.
L’essai peut être utilisé pour les anticorps induits par la vaccination et/ou ciblant d’autres variantes de PfEMP1 ou tout autre antigène parasite présent sur la surface de l’IE, à condition que l’anticorps testé interagisse avec les récepteurs humains fcγ exprimés par les cellules THP-1 (CD32 et CD64). L’essai est simple, à haut débit (permettant l’analyse de grands ensembles d’échantillons) et peut être effectué en une journée. La phagocytose est mesurée par cytométrie de flux, quantifiant le pourcentage de cellules EtBr+ THP-1 après 40 min co-incubation avec etBr-étiqueté et anticorps-opsonized IEs.
Même si l’essai donne des résultats cohérents sur les répliques expérimentales, il y a une variabilité entre les valeurs absolues mesurées et, par conséquent, nous recommandons de calculer les valeurs relatives à l’aide d’un contrôle positif qui doit toujours être inclus. Nous recommandons également d’exécuter tous les échantillons à tester dans une seule expérience, afin d’éviter la variation inter-essais comme discuté ci-dessus. Lors de l’essai d’échantillons de sérum prélevés sur des personnes exposées à l’infection à P. falciparum, nous recommandons toujours d’inclure un ensemble d’échantillons provenant d’individus naïfs à utiliser comme groupe témoin. Ce groupe de contrôle peut être utilisé pour établir un seuil pour déterminer lequel de vos échantillons de test doit être considéré comme positif.
Nous avons déjà utilisé cette approche pour comparer la capacité de phagocytose induisant des sérums prélevés auprès d’enfants ayant des présentations cliniques différentes sur le paludisme (graves vs légères)17.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Maiken Visti est remercié pour son excellente assistance technique. Ces travaux ont été financés en partie par une subvention (MAVARECA II; 17-02-KU) du Ministère des affaires étrangères du Danemark et administrée par le Danida Fellowship Centre. Le bailleur de fonds n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
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