Summary
줄기 세포는 심근 손상을 가진 개별을 위한 잠재적인 처리로 지속적으로 조사됩니다, 그러나, 부상당한 조직 내의 그들의 감소된 생존및 보존은 그들의 장기 효험에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 허혈 재관전 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포 전달을위한 대체 방법을 설명합니다.
Abstract
심근 손상을 입은 개인의 심장 기능 회복을 위한 줄기 세포(SC)의 사용에 상당한 관심이 있습니다. 가장 일반적으로, 심장 줄기 세포 치료는 심근 상해의 유도와 동시에 SC를 전달하여 공부됩니다. 그러나, 이 접근은 2개의 중요한 한계를 제시합니다: 초기 적대적인 선동적인 허혈성 환경은 이식한 SC의 생존에 영향을 미칠 수 있고, SC가 사용될 가능성이 있는 아급성 경색 시나리오를 나타내지 않습니다. 여기에서 우리는 허혈 재관성 상해의 유도 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 납품을 위한 외과 절차의 2 부분으로 시리즈를 기술합니다. 줄기 세포 투여의 이 방법은 초기 면역 반응을 우회하여 손상된 조직 주위의 더 긴 생존력과 보존을 허용할 수 있다. 허혈성 재관류 손상의 모델은 중간엽 줄기 세포 (3.0 x 105)의전달을 동반한 마우스에서 유도되었으며, 균등하게 발현 된 CMV 프로모터, intramyocardily 7 일 후 기자 유전자 반딧불 루시포라제를 표현하였다. 동물은 각각 세포의 상해 그리고 주입의 확인을 위한 초음파 및 생물 발광 화상 진찰을 통해 심상화되었습니다. 중요한 것은 SC 납품을 위한 이 2절차 접근방식을 수행할 때 추가합병증 비율이 없었습니다. 이러한 줄기세포 투여 방법은, 일체적으로 최첨단 리포터 유전자의 활용과 함께, 임상적으로 일반적으로 본 만성 허혈의 상황에서 이식된 SC의 생존력 및 유지에 대한 생체 내 연구를 허용하면서도 초기 프로 염증 반응을 우회할 수 있다. 요약하자면, 우리는 손상된 조직의 재생을 촉진하는 잠재적인 새로운 접근법으로 사용될 수 있는 심근으로 줄기 세포의 지연된 전달을 위한 프로토콜을 설치했습니다.
Introduction
심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 사망률의 가장 흔한 원인으로 남아 있습니다. 심장 허혈성 사건은 심근 및 주변 세포1의전반적인 기능에 해로운 것으로 밝혀졌다. 심근세포의 ̴0.45-1.0%만이 심근 손상이 발생한 후 매년 재생됩니다2. 증가하는 수요와 치료 개발에 내재된 초점에도 불구하고, 부상당한 조직의 재생을 돕는 치료는 확립하기 어려웠으며 여전히추가최적화3,44,5를필요로합니다. 줄기 세포 치료는 허혈성 사건 후 손상된 조직을 젊어지게하는 대체 경로로 도입되었습니다. 그러나, 이들 치료법의 발전은 세포의 제한된 생존 및 유지에 의해66.
허혈성 사건 후 심장의 미세 환경은 저산소, 프로 산화제 및 프로 염증으로 특징 지어질 수 있으며, 생존에 적응하기 위해 치료 줄기 세포에 대한 적대적인 조건을제시7,,8. 면역 반응이 부상 후, 순진한 림프구, 대식세포, 호중구 및 유방 세포가 죽어가는 세포를 제거하고 조직 리모델링 을 위한 과정을 조절하여9손상을 복구하려고 시도함에 따라9,10,,11. 처음 3 일 이내에 허혈 후, 염증은 지역에서 호중구와 단핵구의 높은 숫자와 프로 염증 사이토 카인의 방출과 함께 절정에10,,12. 7일 후, 염증의 상당 부분은 가라앉고 회복세포로의 전환이 시작되어 리모델링 캐스케이드가 완료될 때까지 계속,마우스(13)에서는약 14일이 된다. 우리의 외과 방법은 허혈 재관류 손상 후 피크 타고난 면역 반응을 우회하기 위해 심근에 생물학적 제제를 도입하는 잠재적 인 대체 접근법입니다. 동시에 급성 심근 경색에 비해 고려해야 할 다른 변수가있을 수 있는 아급성 /만성 허혈 의 조건에서 모든 치료법의 연구를 허용할 것입니다.
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Protocol
실험은 여성 C57BL/6 마우스, 나이 10-12 주 및 20-25 g 체중에 수행되었다. 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 명시된 기준을 준수 (실험실 동물 자원 연구소, 국립 과학 아카데미, 베데스다, MD, 미국) 및 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 메이요 클리닉 대학 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 준비 및 삽관
- 수술 전에 모든 수술 기구를 자동 클로브하십시오. 한 세션에서 여러 번의 수술을 수행하려면 각 동물 후 악기를 청소하고 뜨거운 비드 멸균기를 사용하여 다시 멸균하십시오.
- 유도 챔버에서 1 L/min O2에서 3.5-4%의 이소플루란으로 마우스를 마취시합니다.
- Buprenorphine SR 1 mg/kg (진통제)를 피하, 동물의 무게, 인공 호흡기에 무게를 입력.
- 흉골에서 어깨 수준으로 가슴의 왼쪽을 면도하고 여분의 모피를 제거하기 위해 탈모 크림을 바르습니다.
- 허혈 재관류 절차의 경우 2cmH2O에서 인공호흡기에 양성 말기만기 압력(PEEP)을 유지한다. 세포 시술의 지연된 주입을 위해 폐 붕괴를 방지하기 위해 PEEP를 3cmH2O로 변경한다.
- 20G 내트라큐리 튜브를 사용하여 동물을 삽관하고, 35-37°C의 체온을 유지하기 위해 제어된 가열 패드로 이송한다.
- 마우스를 왼쪽에 두개골 끝이 있고 오른쪽에 는 카우달 끝이 있는 측면 의 실로 인공호흡기에 놓습니다.
- 마취를 2-2.5% 이소플루란에서 1 L/min O2에서 나머지 시술시술을 유지합니다.
- Scrub the surgical area alternating between povidone-iodine and alcohol swabs three times and apply ophthalmic ointment to both eyes.
2. 이혈혈 재관류 부상
- #10 블레이드 메스를 사용하면 시야에서 왼쪽 젖꼭지의 오른쪽까지 수직 절개 2.5mm를 만듭니다.
- 가위를 사용하여 늑간 근육과 갈비뼈가 보일 때까지 피상근육 층을 잘라냅니다.
- 갈비뼈와 주변 조직을 들어 올리는 동안, 4갈비뼈와 5갈비뼈 사이의 늑간 공간을 잘라낸 다음 눈꺼풀 리트랙터를 열린 공간에 삽입합니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 회심을 철회하고 폐를 위쪽으로 움직이고 시야에서 벗어나게 합니다.
- LAD 동맥을 시각화하고, 9-0 나일론 봉합사를 사용하여, 동맥 아래 심근을 통과 2.5 mm 왼쪽 auricle에 실살하고 느슨한 사각형 매듭을 묶는다.
- 폴리에틸렌 튜브 1cm를 자르고 느슨한 매듭 안에 놓습니다.
- 튜브 주변의 봉합사를 고정하고 허혈을 확인한 다음 35 분 후에 놓습니다.
참고: 창구와 심실 부정맥에 의한 허혈을 확인합니다. - 결찰을 해제하고 튜브를 제거 한 후, 심근의 재관류를 확인하기 위해 5 분 기다립니다.
- 24 G I.V. 카테터 튜브를 흉부 구멍에 넣고 개구부 오른쪽에 늑간 공간 하나를 배치합니다.
- 간단한 중단 패턴에 6-0 흡수 봉합사로 늑간 절개를 닫습니다.
- 연속 봉합사 패턴으로 6-0 흡수 가능한 봉합사로 근육 층을 닫습니다.
- 피상적 근육 층을 닫은 후 흉부 튜브를 제거하고 1 mL 결핵 주사기를 사용하여 흉부 구멍에서 공기를 철회하십시오.
- 연속 수평 매트리스 패턴에 6-0 흡수 봉합사로 피부 절개를 닫습니다
참고: 나일론 봉합사 및 불연속 봉합추 패턴은 피부 층에도 사용될 수 있다. - 1.5mL의 따뜻한 식염수를 피하하고 감염을 예방하기 위해 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 적용한다.
- 이소플루란을 끄고 동물이 100% O2의 인공호흡기를 통해 숨을 쉴 수 있도록 하여 도움 없이 지속적으로 호흡할 수 있습니다.
- 완전히 복구 될 때까지 35-37 °C의 온도와 따뜻한 패드에 덮여 침구 (종이 타월 또는 드레이프)와 침대가없는 케이지 또는 케이지로 마우스를 전송합니다.
3. 마우스 중간엽 줄기 세포 전달
참고: 절차에 사용되는 마우스의 균주는 근친선이며 유전적으로 동일한 것으로 간주됩니다. 중간엽 줄기 세포는 동일한 균주의 동물로부터 수득되었고, 프로토콜 설계에 의하면 면역 억제는 유도되지 않았다1.
- 첫 번째 절차에 대해 이전에 수행한 대로 준비 및 삽관 단계를 완료합니다.
- 가위와 집게를 사용하여 피부 층에서 봉합사를 제거합니다.
- #10 메스로 이전 수술과 동일한 위치에 절개를하십시오.
- 메스를 계속 사용하여 흉터 조직을 절단하여 근육 층 봉합사가 보일 때까지 계속
- 가위를 사용하여 봉합사를 제거하고 근육 층을 열어 잘라.
- 갈비뼈를 함께 들고 있는 봉합사를 시각화하고 제거하고 이전 절개에서 늑간 근육을 계속 절단합니다.
참고 : 폐가 가슴 벽에 부착 되었을 수 있습니다., 이 발생 하는 경우, 무딘 또는 곡선 된 집게를 사용 하 여 신중 하 게 분리 하 고 그들을 해제. - 눈꺼풀 리트랙터를 늑간 공간에 넣고 이전 리그레이션 영역을 찾습니다.
- 중간엽 줄기 세포(3.0 x105)를적재하고, 20 μL PBS에서 중단되어 30G 인슐린 주사기에 넣고, 적절한 각도를 주입하기 위해 필요에 따라 바늘을 약간 구부린다.
참고: 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 4-6 주 된 C56BL/6 마우스의 지방 조직으로부터 분리되었다. 초기 통로 세포(p3)는 CMV 프로모터 의 산반딧불 루시파제 유전자를 발현하는 벡터로 변환되어 생체 내 세포 생존 가능성 모니터링을 허용하였다. Adipose 유래 마우스 MSC는 유동 세포측정을 특징으로 하고 세포는 CD44, CD29, CD90 및 CD105에 대해 양성이었지만 조혈 마커 CD4514에대해 부정적이었다. 주사 전에, MSC는 해동 과정에서 세포의 손실을 피하기 위해 적어도 하나의 통로를 위해 배양되었다. - 심장의 밑쪽으로 정점방향으로 이동하는 것은 바늘 개구부가 완전히 심근 안쪽에 들어갈 때까지 주사기를 peri-infarct 부위로 삽입한다.
- 일단 안쪽에 천천히 심근에 세포를 주입하고, 3 s를 기다린 다음 바늘을 제거하십시오.
- 심실 세동과 같은 세포에 대한 비정상적인 반응이 없는지 확인하기 위해 3 분 동안 심장을 면밀히 관찰하십시오.
- 24 G IV 카테터 튜브를 흉부 구멍에 넣고 개구부 오른쪽에 늑간 공간 1개를 넣습니다.
- 늑간, 근육 및 피부 층을 닫고 첫 번째 절차와 동일한 방법으로 흉관을 제거하십시오.
- 1.5mL의 따뜻한 식염수를 피하하고 감염을 예방하기 위해 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 적용한다.
- 이소플루란을 끄고 동물이 100% O2에서 인공호흡기를 통해 숨을 쉴 수 있도록 하여 도움 없이 지속적으로 호흡할 수 있습니다.
- 완전히 복구 될 때까지 35-37 °C의 온도와 따뜻한 패드에 덮여 침구 (종이 타월 또는 드레이프)와 침대가없는 케이지 또는 케이지로 마우스를 전송합니다.
4. 두 절차에 따라 수술 후 치료
- 자발적인 호흡, 흉골 회항 및 정상적인 움직임이 확립 될 때까지 동물을 지속적으로 관찰하십시오.
- 수술 당일 최소 3시간 동안 15-30분마다 관찰을 계속합니다.
- 5일 동안 매일 한 번, 매주 2-3회 상처 착증 또는 비정상적인 통증을 위해 마우스를 확인하십시오.
- 동물이 72 h op 후 통증의 징후 (즉, 아치형 등, 최소한의 움직임, 찡그린 눈가리개 또는 거친 모피)를 표시하는 경우, Buprenorphine SR 진통제의 추가 복용량을 제공합니다.
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Representative Results
허혈 재관전 부상은 0일째에 마우스에서 유도되었고, 그 다음에는 줄기세포 이식 전날 수술 후 심전도 및 심전도가 뒤따랐다. 초음파 및 심전도 분석은 경색및 감소된 심실 수축 기능을 확인하였다(도1A-D). 데이터의 추가 검사는 허혈성 손상을 받은 마우스에서 배출 분획 및 분수 단축이 감소된 반면, 최종 확장기 및 수축부 부피가 증가하였다(표1). 일반 마우스심장(도 2A)에비해, 마손 트리크롬 염색심 조직 7일 후 상해(도2B)는좌심실 벽의 콜라겐 증착 및 숱이 증가한 것으로 나타났다. 두 번째 절차는 부상 후 7 일 수행되었다; 마우스는 중간엽 줄기 세포(3.0 x 105 in 20 μL PBS)의 내트라미카르탈 주사를 주었으며, 이는 구성적으로 발현된 CMV 프로모터 하에서 기자 유전자 반딧불 루시파라제를 안정적으로 발현하였다. 이들 마우스의 생체발광화상(BLI)은 줄기세포 이식 후 성공적인 주사확인을 위해 하루를 마쳤다. MSC의 성공적인 전달은 허혈 재관전 손상을 유도했지만 MSC(그림 3A, B)를받지 못한 마우스에 비해 BLI 신호에 의해 예시된다. 이 이중 중재 절차는 급성 시나리오에서 MSC를 받은 동물에서 관찰된 것과 유사한 22%의 감소율을 보였습니다.
그림 1: 마우스 심장 기능의 이미징. 기준선(A)에서A마우스의 초음파 분석은 허혈 성 재관류 손상(B)후 마우스에 비해 좌심실 심근 심근의 균일한 수축을 나타내며 심실 이동이 감소함을 나타낸다. 일반마우스(C)의기준선 심전도와 비교했을 때, 허혈 재관류손상(D)을가진 마우스의 ST 세그먼트에 상당한 변화가 있어 심실 기능의 감소를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| EF% | FS% | EDV (μl) | ESV (μl) | SV (μl) | |
| 기준선 | 74.19±1.2 | 44.67±2 | 23.8±3.6 | 6.14±0.98 | 17.68±2.7 |
| IR 이후 | 43.9±3.8 | 30.65±3.8 | 33.88±4.4 | 18.11±1.4 | 15.74±3.2 |
표 1: 에코카디그래피 분석. 변수는 평균 ±표준 오류로 표현됩니다. EF: 배출 분수, FS: 분수 단축, EDV: 끝 확장체 볼륨, ESV: 끝 수축기 볼륨, SV: 스트로크 볼륨.
그림 2: 심장 조직의 조직학적 염색. 일반마우스(A)에서심근의 마손의 트리크롬 염색은 심장 조직에 부상을 나타내지 않는 반면, 허혈내 재관류 손상을 입은마우스(B)는좌심실의 심근에서 콜라겐 증착 및 숱이 증가하여 성공적인 경색의 판정을 지지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생체 내 생물 발광 화상 진찰. 줄기 세포의 자궁 내 사혈 주사를 받지 못한 허혈 재관류 손상을 가진 마우스는 생물 발광 신호(A)를나타내지 않았다. 중간엽 줄기세포(CMV-FLUC)의 지연된 주입을 받은 허혈 재관류 손상을 가진 마우스는 상당한 양의신호(B)를나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전 세계적으로 8,500만 명 이상이 심혈관 질환3의영향을 받습니다. 이러한 허혈성 이벤트의 높은 보급은 손상된 조직의 재생을 촉진하기위한 대체 치료의 추가 개발 및 확장을 보증합니다. 전통적인 방법은 치료 1의 후속 투여와 급성 설정에서 허혈 재관류 절차를활용한다. 염증 반응은 호중구, 대식세포 및 증가 된 사이토카인 신호10,12의침투와 함께 심장 허혈성 사건을 후유하는 3-4 일 사이에 절정에있습니다. 죽은 세포 집적의이 기간 후, 1 차적인 면역 반응은 가라앉기 시작하고 리모델링단계(13)로전환하기 시작한다. 더욱이, 임상 설정에 제시 된 것과 동일한 시나리오 내에서 치료 조사 하는 것이 중요 하다. 이 원고에서는, 우리는 MSC의 지연 주입으로 이중 외과 수술의 타당성 및 안전을 입증하기 위하여 허혈성 마우스에서 얻은 대표적인 결과를 보여주고 있습니다. 우리는 이 접근법이 심근 허혈 동물 모형을 위해뿐만 아니라 염증이 중요한 역할을 할 수 있는 질병의 동물 모형을 위해, 세포 또는 약 치료와 같은 생물학을 관련시키는 치료 전략의 성공을 바꾸는 것을 이용할 수 있다고 믿습니다.
따라서, 이 원고에서는 쥐에서 허혈 재관류 손상을 유도한 후 7-10일 후, 줄기 세포를 아급성 경색으로 전달하는 수술 방법을 설명한다. 이 기술은 면역 반응의 다른 단계와 허혈성 질환 과정의 아급성 /만성 단계와 관련하여 줄기 세포 생존력 및 생물학을 연구하는 데 유용할 것입니다. Murine 모델은 재현성과 편의성 면에서 이 연구 방법에 이상적인 과목이지만, 몇 가지 단점을 견딜 수 있습니다. 동물의 크기는 어느 정도의 외과 적 기술을 보증하지만, 연습으로, 이러한 절차를 성공적으로 완료 할 수 있습니다.
이 원고에 제시 된 절차를 수행하려면 이러한 수술의 성공적인 완료에 필수적인 몇 가지 주요 단계와 관찰을 주의하는 것이 중요합니다. 첫 번째 절차의 중요한 단계는 왼쪽 전방 관상 동맥 (LAD)의 결찰과 심근의 일시적인 허혈을 달성하기 위해 폴리에틸렌 튜브의 배치입니다. 멸균 테이퍼 팁 면봉을 사용하여 심혈 조직에 압력을 가하여 심강으로 변하는 것은 LAD의 향상된 묘사를 가능하게 합니다. 튜브가 제자리에 있고 봉합사가 단단히 고정되면 조직의 부정맥과 완화기의 관찰은 허혈의 성공적인 유도를 결정하는 데 필수적입니다. 허혈의 기간과 후속 재관전, 봉합사가 출시되면, 여러 동물에 걸쳐 부상의 일관성에 중요하다. 추가적으로, 두 번째 기술 된 절차 동안, 중간 엽 줄기 세포의 주입은 근위 방향으로 단상에서 수평 운동으로 수행되어야한다. 첫 번째 절차에서 결과 섬유증으로 인해, 중요하지만 꾸준한 압력은 충격을 방지하기 위해 세포의 느린 일관된 주입 뒤에 바늘을 삽입하는 데 필요합니다. 마지막으로, 마취에서 마우스를 깨우기 전에 지속적인 열과 추가 피하 유체를 제공하면 열 손실을 방지하고 시술 중에 잃어버린 혈액의 교체뿐만 아니라 동물의 전반적인 회복을 돕습니다.
본 원고에서는 만성 허혈 재관류 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포를 치료 치료로 투여하는 방법으로 여러 절차를 완료하기위한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 외과 적 절차의 활용은 시간이 지남에 따라 자신의 생존력을 향상시키기 위해 부상 후 적대적인 허혈성 환경으로 줄기 세포의 전달에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 줄기 세포 치료의 연구에 대 한이 접근의 사용은 크게 급성 설정에 있는 SC의 사용에 초점을 맞춘 다른 연구를 보완 할 것 이다. 결론적으로, 기술된 프로토콜은 전임상 연구에서 모델로 사용하기 위해 허혈성 손상과 줄기 세포의 연속 지연 이식을 유도하는 데 성공적이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
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