Summary
Le cellule staminali sono continuamente studiate come potenziali trattamenti per gli individui con danni miocardiali, tuttavia, la loro diminuzione della vitalità e della ritenzione all'interno del tessuto ferito può influenzare la loro efficacia a lungo termine. In questo manoscritto descriviamo un metodo alternativo per la consegna di cellule staminali in un modello murino di lesione da reperfusione di ischemia.
Abstract
C'è un interesse significativo nell'uso di cellule staminali (SC) per il recupero della funzione cardiaca in individui con lesioni miocardici. Più comunemente, la terapia con cellule staminali cardiache viene studiata fornendo SC in concomitanza con l'induzione della lesione miocardica. Tuttavia, questo approccio presenta due limitazioni significative: il primo ambiente ischemico pro-infiammatorio ostile può influenzare la sopravvivenza delle SC trapiantate e non rappresenta lo scenario di infarto subacuto in cui probabilmente verranno utilizzate le SC. Qui descriviamo una serie in due parti di procedure chirurgiche per l'induzione della lesione ischemia-reperfusione e la consegna di cellule staminali mesenchymal (MSC). Questo metodo di somministrazione delle cellule staminali può consentire la maggiore vitalità e ritenzione intorno al tessuto danneggiato aggirando la risposta immunitaria iniziale. Un modello di lesione da reperfusione di ischemia è stato indotto nei topi accompagnato dalla consegna di cellule staminali mesenchimali (3,0 x10 5),esprimendo stabilmente il gene reporter luccilice luciferasi sotto il promotore CMV espresso costitutivamente, intramiocardially 7 giorni dopo. Gli animali sono stati immaginati tramite ultrasuoni e imaging bioluminescente per la conferma della lesione e l'iniezione di cellule, rispettivamente. È importante sottolineare che non vi era alcun tasso di complicazione aggiunto quando si esegue questo approccio a due procedure per la consegna SC. Questo metodo di somministrazione delle cellule staminali, collettivamente con l'utilizzo di geni reporter all'avanguardia, può consentire lo studio in vivo della vitalità e della ritenzione delle SC trapiantate in una situazione di ischemia cronica comunemente osservata clinicamente, aggirando anche la risposta pro-infiammatoria iniziale. In sintesi, abbiamo stabilito un protocollo per la consegna ritardata di cellule staminali nel miocardio, che può essere utilizzato come potenziale nuovo approccio nel promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato.
Introduction
La malattia cardiovascolare rimane la causa più comune di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Gli eventi ischemici cardiaci sono risultati dannosi per la funzione complessiva del miocardio e delle cellule circostanti1. Solo ̴0,45-1,0% dei cardiomiociti si rigenera ogni anno dopo che si verifica un danno miocardiale2. Nonostante la crescente domanda e l'attenzione intrinseca allo sviluppo di trattamenti, le terapie che aiutano nella rigenerazione del tessuto ferito sono state difficili da stabilire e richiedono ancoraun'ulteriore ottimizzazione 3,4,5. Le terapie con cellule staminali sono state introdotte come percorso alternativo per ringiovanire il tessuto danneggiato dopo un evento ischemico; tuttavia, l'avanzamento di queste terapie è stato messo in discussione dalla limitata sopravvivenza e ritenzione delle cellule in un'area ferita6.
Il microambiente del cuore dopo un evento ischemico può essere caratterizzato come ipossico, pro-ossidante e pro-infiammatorio, presentando condizioni ostili per le cellule staminali terapeutiche ad adattarsi per lasopravvivenza 7,8. Come una risposta immunitaria viene attivata a seguito di lesioni, linfociti ingenui, macrofagi, neutrofili e mastociti tentano di riparare il danno rimuovendo le cellule morenti e modulando il processo per il rimodellamento deitessuti 9,10,11. Entro i primi 3 giorni post-ischemia, l'infiammazione è al suo apice con il rilascio di citochine pro-infiammatorie con un alto numero di neutrofili e monociti nella zona10,12. Dopo 7 giorni, gran parte dell'infiammazione si è placata e inizia la transizione alle cellule riparative, continuando fino al completamento della cascata di ristrutturazione, circa 14 giorni nei topi13. Il nostro metodo chirurgico è un potenziale approccio alternativo all'introduzione di farmaci biologici nel miocardio per bypassare la risposta immunitaria innata di picco dopo la lesione da reperfusione ischemia. Allo stesso tempo, permetterà lo studio di eventuali trattamenti in una condizione di ischemia subaute/cronica dove ci possono essere diverse variabili da considerare rispetto all'infarto miocardico acuto.
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Protocol
Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi femmina C57BL/6, di età 10-12 settimane e 20-25 g di peso corporeo. Tutte le procedure sugli animali rispettavano gli standard indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Istituto di risorse animali di laboratorio, Accademia nazionale delle scienze, Bethesda, MD, USA) e sono state approvate dal Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione e intubazione
- Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico. Se più interventi chirurgici devono essere eseguiti in una sessione, pulire gli strumenti dopo ogni animale e ri-sterilizzare utilizzando uno sterilizzatore di perline caldo.
- Anestesizzare i topi con 3,5-4% isoflurane a 1 L/min O2 in una camera di induzione.
- Somministrare Buprenorphine SR 1 mg/kg (analgesico) sottocutaneamente, pesare l'animale e inserire il peso nel ventilatore.
- Rasare il lato sinistro del torace dallo sterno al livello della spalla e applicare la crema depilatoria per rimuovere la pelliccia in eccesso.
- Per la procedura di reperfusione dell'ischemia mantenere la pressione end-eriratory positiva (PEEP) sul ventilatore a 2 cm H2O. Per l'iniezione ritardata di cellule procedura cambiare il PEEP a 3 cmH2O per prevenire il collasso polmonare.
- Intubare l'animale utilizzando un tubo endotracheale 20 G, trasferire in un tampone di riscaldamento controllato per mantenere una temperatura corporea di 35-37 gradi centigradi.
- Posizionare il mouse su un ventilatore in recumbency laterale con estremità craniale sulla sinistra e estremità caudal a destra.
- Mantenere l'anestesia al 2-2,5% isoflurane a 1 L/min O2 per il resto della procedura.
- Scrub l'area chirurgica alternando tra povidone-iodio e tamponi di alcol tre volte e applicare unguento oftalmico a entrambi gli occhi.
2. Lesione da reperfusione ischemia
- Utilizzando un #10 bisturi a lama di taglio fare un'incisione verticale 2,5 mm a destra del capezzolo più a sinistra nel campo di vista.
- Utilizzando forbici tagliare attraverso gli strati muscolari superficiali fino a quando i muscoli intercostali e costole sono visibili.
- Durante il sollevamento delle costole e del tessuto circostante, tagliare lo spazio intercostale tra la 4a e la 5a costola, quindi inserire il retrattore della palpebra nello spazio aperto.
- Ritrarre il pericardio utilizzando le force curve, spostando il polmone verso l'alto e fuori dalla vista.
- Visualizza l'arteria LAD e, utilizzando una sutura di nylon 9-0, passa attraverso il miocardio sotto l'arteria 2,5 mm distale aluricolo sinistro e lega un nodo quadrato sciolto.
- Tagliare 1 cm di tubi in polietilene e posizionarlo all'interno del nodo sciolto.
- Fissare la sutura intorno al tubo, confermare ischemia, quindi rilasciare dopo 35 min.
NOTA: Confermare l'ischemia da palloro e aritmia ventricolare. - Dopo aver rilasciato la legatura e rimosso il tubo, attendere 5 min per confermare la reperfusione del miocardio.
- Inserire un tubo di catetere I.V. 24 G nella cavità toracica uno spazio intercostale a destra dell'apertura.
- Chiudere l'incisione intercostale con una sutura assorbibile 6-0 in un semplice motivo interrotto.
- Chiudere lo strato muscolare con una sutura assorbente 6-0 in un modello di sutura continua.
- Dopo aver chiuso lo strato muscolare superficiale, rimuovere il tubo toracico ritirando l'aria dalla cavità toracica utilizzando una siringa tubercorina da 1 mL.
- Chiudere l'incisione cutanea con una sutura assorbente 6-0 in un modello di materasso orizzontale continuo
NOTA: Per lo strato della pelle possono essere utilizzate suture di nylon e un modello di sutura discontinuo. - Somministrare 1,5 mL di sottocutanea salina calda e applicare unguento triplo antibiotico al sito di incisione per prevenire l'infezione.
- Spegnere l'isoflurane e permettere all'animale di respirare attraverso il ventilatore al 100% O2 fino a quando non può respirare continuamente senza aiuto.
- Trasferire il topo in una gabbia senza biancheria da letto o in una gabbia con biancheria da letto coperta (asciugamano di carta o drappo) su un pad caldo con una temperatura di 35-37 gradi centigradi fino a completa recupero.
3. Consegna di cellule staminali mesenchimali del topo
NOTA: Il ceppo di topi utilizzato per la procedura è una linea inbred e sono considerati geneticamente identici. Le cellule staminali mesenchimali sono state ottenute da animali dello stesso ceppo e, per la progettazione del protocollo, l'immunosoppressione non è stataindotta 1.
- Completare i passaggi di preparazione e intubazione come fatto in precedenza per la prima procedura.
- Rimuovere la sutura dallo strato cutaneo utilizzando forbici e forbici.
- Con un #10 bisturi, fare un'incisione nella stessa posizione dell'intervento chirurgico precedente.
- Continuare a usare il bisturi per tagliare il tessuto cicatriziale fino a quando la sutura dello strato muscolare non è visibile
- Utilizzando le forbici e le forcepi rimuovere la sutura e tagliare lo strato muscolare aperto.
- Visualizzare e rimuovere le suture tenendo insieme le costole e continuare a tagliare attraverso il muscolo intercostale dall'incisione precedente.
NOTA: I polmoni possono aver aderito alla parete toracica, se ciò si verifica, utilizzare le force curve o smussate per separarle e rilasciarle con attenzione. - Posizionare il retrattile della palpebra nello spazio intercostale e individuare l'area della legatura precedente.
- Caricare le cellule staminali mesenchymal (3.0 x 105), sospese in 20 PBS, in una siringa insulina da 30 G, piegare leggermente l'ago secondo necessità per l'angolo corretto da iniettare.
NOTA: Le cellule staminali mesenchymal (MSC) sono state isolate dal tessuto adiposo di topi C56BL/6 di 4-6 settimane. Le cellule di passaggio precoce (p3) sono state trasdottate con un vettore che esprime il gene della luccilice luciferasi sotto il promotore CMV per consentire il monitoraggio della vitalità cellulare in vivo. Il mouse MSC derivato da adipose è stato caratterizzato dalla citometria di flusso e le cellule sono state positive per CD44, CD29, CD90 e CD105 ma negative per il marcatore ematopoietico CD4514. Prima dell'iniezione, gli MSC sono stati colturati per almeno un passaggio per evitare la perdita di cellule dal processo di scongelamento. - Spostandosi nella direzione dall'apice verso la base del cuore inserire la siringa nella regione peri-infarta fino a quando l'apertura dell'ago è completamente all'interno del miocardio.
- Una volta all'interno iniettare lentamente le cellule nel miocardio, attendere 3 s, quindi rimuovere l'ago.
- Osservare il cuore da vicino per 3 minuti per essere sicuri di nessuna reazione anormale alle cellule come la fibrillazione ventricolare.
- Inserire un tubo catetere da 24 G IV nella cavità toracica di uno spazio intercostale a destra dell'apertura.
- Chiudere gli strati intercostale, muscolare e cutanea e rimuovere il tubo toracico nello stesso metodo della prima procedura.
- Somministrare 1,5 mL di sottocutanea salina calda e applicare unguento triplo antibiotico al sito di incisione per prevenire l'infezione.
- Spegnere l'isoflurane e lasciare che l'animale respiri attraverso il ventilatore al 100% O2 fino a quando non è in grado di respirare continuamente senza aiuto.
- Trasferire il topo in una gabbia senza biancheria da letto o in una gabbia con biancheria da letto coperta (asciugamano di carta o drappo) su un pad caldo con una temperatura di 35-37 gradi centigradi fino a completa recupero.
4. Assistenza post-operatoria secondo entrambe le procedure
- Osservare l'animale continuamente fino a quando non viene stabilita la respirazione spontanea, la recumbency sternale e il movimento normale.
- Continuare l'osservazione ogni 15-30 min per almeno 3 h il giorno dell'intervento chirurgico.
- Controllare i topi per la dehiscenza della ferita o dolore anormale una volta al giorno per 5 giorni, quindi 2-3 volte alla settimana.
- Se l'animale mostra segni di dolore (cioè schiena arcuata, movimento minimo, smorfie o pelliccia trasandata) dopo 72 h post-op, fornire una dose aggiuntiva dell'analgesico Buprenorphine SR.
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Representative Results
La lesione da reperfusione di ischemia è stata indotta nei topi il giorno 0, seguita da un ecocardiogramma post-operatorio ed elettrocardiogramma il giorno precedente l'impianto di cellule staminali. L'analisi degli ultrasuoni e degli elettrocardiogrammi ha confermato l'infarto e la diminuzione della funzione contrattile ventricolare(Figura 1A-D). Un ulteriore esame dei dati ha mostrato che la frazione di espulsione e l'accorciamento frazionario sono diminuiti nei topi che hanno ricevuto lesioni ischemiche, mentre i volumi diastolici e sistolici sono aumentati(tabella 1). Rispetto a un normale cuore di topo (Figura 2A), la colorazione di Masson Trichrome del tessuto miocardico 7 giorni dopo la lesione (Figura 2B) ha mostrato una maggiore deposizione di collagene e assottigliamento della parete ventricolare sinistra. La seconda procedura è stata eseguita 7 giorni dopo l'infortunio; ai topi è stata somministrata un'iniezione intramiocardica di cellule staminali mesenchimali (3,0 x10 5 in 20 PBS) esprimendo stabilmente il gene reporter luccilice luciferasi sotto il promotore CMV espresso costitutivamente. L'imaging bioluminescente in vivo (BLI) di questi topi è stato completato il giorno dopo l'impianto di cellule staminali per la conferma di un'iniezione riuscita. La consegna di MSC è esemplificata dal segnale BLI, rispetto ai topi che avevano indotto lesioni da reperfusione di ischemia ma non hanno ricevuto MSC (Figura 3A,B). Questa doppia procedura interventiva aveva un tasso di logoramento del 22%, simile a quello osservato negli animali che ricevevano MSC nello scenario acuto.
Figura 1: Imaging della funzione cardiaca dei topi. L'analisi ecografica del topo albasale( A ) mostra una contrazione uniforme del miocardio ventricolo sinistro rispetto a un topo dopo la lesione da reperfusione ischemia (B), che mostra una diminuzione del movimento ventricolare. Rispetto all'elettrocardiogramma di base di un topo normale (C), ci sono cambiamenti significativi nel segmento ST di un topo con lesione di ricorsiva ischemia (D), che indicano una diminuzione della funzione ventricolare. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| EF% | FS% | EDV (l) | ESV (l) | SV (l) | |
| Linea | 74,19-1,2 | 44,67/2 | 23,8-3,6 | 6,14-0,98 | 17,68-2,7 |
| Post-IR | 43,9-3,8 | 30,65-3,8 | 33,88-4,4 | 18,11/1,4 | 15,74-3,2 |
Tabella 1: Analisi ecocardiografia. Le variabili sono espresse come Media - Errore standard della media. EF: Frazione di espulsione, FS: accorciamento frazionario, EDV: Volume End-Diastolic, ESV: Volume End-Systolic, SV: Volume della corsa.
Figura 2: Colorazione ilogica del tessuto cardiaco. La colorazione Trichrome di Masson del miocardio nel topo normale (A) non mostra lesioni al tessuto cardiaco, mentre il topo con lesione da reperfusione di ischemia (B) mostra una maggiore deposizione di collagene e assottigliamento nel miocardio del ventricolo sinistro, sostenendo la determinazione di un infarto di successo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging bioluminescente in vivo. Un topo con lesione di reperfusione ischemia che non ha ricevuto l'iniezione intramiocardiale di cellule staminali non ha mostrato alcun segnale bioluminescente (A). Un topo con lesione da reperfusione ischemia che ha ricevuto un'iniezione ritardata di cellule staminali mesenchymal (CMV-FLUC) ha mostrato una quantità significativa di segnale (B). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Oltre 85 milioni di persone in tutto il mondo sono affore di malattiecardiovascolari 3. L'elevata prevalenza di questi eventi ischemici richiede un ulteriore sviluppo ed espansione di terapie alternative per promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato. I metodi tradizionali utilizzano la procedura di reperfusione dell'ischemia in un ambiente acuto con successiva somministrazione di terapie1. Le reazioni infiammatorie sono al suo apice tra 3-4 giorni dopo un evento ischemico cardiaco, con infiltrazione di neutrofili, macrofagi e segnalazione di citochineaumentata 10,12. Dopo questo periodo di degregazione delle cellule morte, la risposta immunitaria primaria inizia a placarsi e la transizione verso la fase di rimodellamento13. Inoltre, è importante che i trattamenti siano studiati all'interno dello stesso scenario presentato nell'ambiente clinico. In questo manoscritto, stiamo mostrando i risultati rappresentativi ottenuti da topi ischemici per dimostrare la fattibilità e la sicurezza della doppia procedura chirurgica, con iniezione ritardata di MSC. Crediamo che questo approccio possa essere utilizzato non solo per i modelli animali dell'ischemia miocardica, ma anche per modelli animali di malattia in cui l'infiammazione può svolgere un ruolo critico, alterando il successo di strategie terapeutiche che coinvolgono biologici, come terapie cellulari o farmacologiche.
Pertanto, in questo manoscritto descriviamo un metodo chirurgico per la consegna di cellule staminali in un infarto subacuto, 7-10 giorni dopo aver indotto lesioni da reperfusione di ischemia nei topi. Questa tecnica sarà utile nello studio della vitalità e della biologia delle cellule staminali in relazione alle diverse fasi della risposta immunitaria e nella fase subacuta/cronica del processo di malattia ischemica. I modelli Murine sono soggetti ideali per questo metodo di studio in termini di riproducibilità e convenienza, tuttavia, possono sopportare alcuni svantaggi. La dimensione dell'animale garantisce un certo grado di abilità chirurgica anche se, con la pratica, queste procedure possono essere completate con successo.
Per eseguire le procedure presentate in questo manoscritto, è importante notare alcuni passaggi chiave e osservazioni essenziali per il completamento di questi interventi chirurgici. Una fase critica della prima procedura è la legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) e il posizionamento di tubi di polietilene per ottenere ischemia temporanea del miocardio. L'uso di tamponi sterili di cotone a punta di affuso per mettere pressione sul tessuto cardiaco distale all'atrio consente una migliore delineazione del LAD. Una volta che il tubo è in posizione e la sutura strettamente fissata, l'osservazione di aritmia e pallore del tessuto è essenziale per determinare l'induzione di successo di ischemia. Il periodo di ischemia e la successiva reperfusione, una volta rilasciata la sutura, è importante per la consistenza della lesione tra più animali. Inoltre, durante la seconda procedura descritta, l'iniezione di cellule staminali mesenchimiche deve essere eseguita con movimenti orizzontali nella direzione da distatale a prossimale. A causa della fibrosi risultante dalla prima procedura, è necessaria una pressione significativa ma costante per inserire l'ago seguita da una lenta iniezione costante delle cellule per prevenire gli urti. Infine, fornire calore continuo e fluidi sottocutanei supplementari prima di svegliare i topi dall'anestesia, impedirà la perdita di calore e aiuterà nella sostituzione di qualsiasi sangue perso durante le procedure, così come il recupero complessivo dell'animale.
In questo manoscritto, forniamo un protocollo per completare più procedure come metodo di somministrazione delle cellule staminali come trattamento terapeutico in un modello murino di lesione cronica da reperfusione di ischemia. L'utilizzo di queste procedure chirurgiche offre un nuovo approccio per la consegna di cellule staminali nell'ambiente ischemico ostile dopo lesioni per migliorare la loro vitalità nel tempo. L'uso di questo approccio per lo studio della terapia con cellule staminali completerà significativamente altri studi incentrati sull'uso delle SC nell'ambiente acuto. In conclusione, il protocollo descritto è riuscito a indurre lesioni ischemiche e il conseguente impianto ritardato di cellule staminali per l'uso come modello negli studi preclinici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
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