Summary
幹細胞は、心筋損傷を有する個人の潜在的な治療法として継続的に調査されるが、損傷した組織内での生存率および保持率の低下は、長期的な有効性に影響を与える可能性がある。本稿では虚血再灌流傷害のマウスモデルにおける幹細胞送達の代替方法を述べる。
Abstract
心筋損傷を有する個人における心機能回復のための幹細胞(SC)の使用に大きな関心がある。最も一般的には、心筋幹細胞療法は、心筋損傷の誘発と同時にSCを送達することによって研究される。しかし、このアプローチは2つの大きな制限を提示する:初期の敵対的な炎症促進虚血環境は移植されたSCの生存に影響を与える可能性があり、それはSCが使用される可能性が高い亜急性梗塞シナリオを表すものではありません。ここでは、虚血再灌流傷害の誘導および間葉系幹細胞(MCs)の送達のための2部構成の一連の外科的処置について説明する。幹細胞投与のこの方法は、初期免疫応答を回避することによって損傷した組織の周りに長い生存率および保持を可能にし得る。間葉系幹細胞の送達を伴うマウス(3.0 x105)で虚血再灌流傷害のモデルを誘発し、構成的に発現したCMVプロモーターの下でレポーター遺伝子ホタルルシファーゼを安定的に発現し、7日後に心内に発現した。動物は、それぞれ細胞の傷害および注射の確認のために超音波および生物発光画像を介して画像化した。重要なことに、SC配信に対してこの2つの手順アプローチを実行する場合、合併症率は追加されなかった。この幹細胞投与方法は、最先端のレポーター遺伝子の利用と共に、臨床的に一般的に見られる慢性虚血の状況における移植SCの生存率および保持のインビボ研究を可能にし、同時に初期の炎症反応を回避することができる。要約すると、我々は、損傷した組織の再生を促進する潜在的な新しいアプローチとして使用することができる心筋への幹細胞の遅延送達のためのプロトコルを確立した。
Introduction
心血管疾患は、世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因であり続けています。心臓虚血性事象は心筋および周囲の細胞1の全機能に有害であることが分かった。心筋細胞の̴0.45~1.0%だけが、心筋損傷が起こった後、毎年再生する。治療の開発に対する需要の高まりと本質的な焦点にもかかわらず、負傷した組織の再生を助ける治療法は確立するのが困難であり、さらに最適化33、4、54,5を必要としている。幹細胞療法は、虚血性のイベントの後に損傷した組織を若返らせるための代替パスとして導入されています。しかし、これらの治療法の進歩は、細胞の限られた生存と保持によって、傷ついた領域6に挑戦されてきた。
虚血性イベント後の心臓の微小環境は、低酸素、酸化促進、および炎症促進として特徴付けることができ、生存のために適応する治療幹細胞に対する敵対的な条件を提示する7,8。8免疫応答が傷害に続いて引き起こされると、ナイーブリンパ球、マクロファージ、好中球および肥満細胞は、死にかけている細胞を除去し、組織改修のためのプロセスを調節することによって損傷を修復しようと99,10, 11.,11虚血後の最初の3日以内に、炎症は、領域10、12,12に好中球および単球の数が多い炎症が炎症のピークに達する。7日後、炎症の多くが沈静化し、修復細胞への移行が始まり、再造りカスケードが完了するまで続き、マウス13では約14日である。私たちの外科的方法は、虚血再灌流傷害後のピーク自然免疫応答をバイパスするために、心筋への生物学的製剤の導入に対する潜在的な代替アプローチである。同時に、急性心筋梗塞と比較して考慮すべき異なる変数がある亜急性/慢性虚血の状態での任意の治療法の研究を可能にする。
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Protocol
実験は、雌のC57BL/6マウス、10〜12週齢および20〜25g体重に対して行った。すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドに記載されている基準に準拠しました (実験動物資源研究所, 米国科学アカデミー, ベセスダ, MD, 米国) メイヨークリニック医科大学施設動物ケア使用委員会によって承認されました (IACUC).
1. 準備と挿管
- 手術前に手術器具をすべてオートクレーブ。1回のセッションで複数の手術を行う場合は、各動物の後に器具を清掃し、ホットビーズ滅菌器を使用して再殺菌します。
- 誘導室の1 L/分O2 で3.5-4%のイソフルランでマウスを麻酔します。
- ブプレノルフィンSRを皮下(鎮痛)皮下1mg/kg(鎮痛)に投与し、動物の重量を量り、人工呼吸器に重量を入力する。
- 胸骨から肩のレベルまで胸の左側を剃り、余分な毛皮を取り除くために脱毛クリームを塗ります。
- 虚血再灌流手順については、2cmH2Oで人工呼吸器上の正の終止め圧力(PEEP)を維持2する。細胞の遅延注入の場合、肺崩壊を防ぐためにPEEPを3cmH2Oに変更する。
- 20G気管チューブを使用して動物を挿管し、35〜37°Cの体温を維持するために制御された加熱パッドに移す。
- 左に頭蓋端、右側に尾端を持つ横方向の換気装置にマウスを置きます。
- 残りの手順については、1 L/分O 2で2-2.5%イソフルランで麻酔を維持します。
- ポビドネヨウ素とアルコール綿棒の間で交互に手術領域を3回スクラブし、両眼に眼科軟膏を適用する。
2. 虚血再灌流障害
- #10刃のメスを使用して、視野の左端の乳首の右に2.5mmの垂直切開を行います。
- 肋間筋と肋骨が見えるまで、表面筋層を切り裂くはさみを使用する。
- リブと周囲の組織を持ち上げながら、4番目と5番目の肋骨の間の肋間空間を切り取り、眼瞼レトラクタをオープンスペースに挿入します。
- 湾曲した鉗子を使用して心膜を引き込み、肺を上方に動かして視界から外に出す。
- LAD動脈を視覚化し、9-0ナイロン縫合糸を使用して、左大介管に遠位動脈2.5mm遠位の心筋を通過し、緩い正方形の結び目を結びます。
- ポリエチレンチューブ1cmを切り、ゆるい結び目の中に置きます。
- チューブの周りに縫合を固定し、虚血を確認し、35分後に放出します。
注:パーラーと心室性不整脈によって虚血を確認してください。 - 結紮を解除してチューブを除去した後、5分間待って心筋の再灌流を確認します。
- 24 G I.V. カテーテルチューブを胸腔に入れ、開口部の右側に1つの肋間空間を置きます。
- 単純な中断パターンで6-0吸収可能な縫合糸で肋間切開を閉じます。
- 連続した縫合線パターンで6-0吸収性縫合糸で筋肉層を閉じます。
- 表面筋層を閉じた後、胸管を1mLの結核シリンジを用いて胸腔から空気を抜き取りしながら取り出す。
- 連続的な水平マットレスパターンの6-0の吸収性の縫合糸で皮膚切開を閉じる
注:ナイロン縫合糸と不連続縫合パターンもスキン層に使用することができます。 - 1.5mLの温かい生理食液を皮下に投与し、感染を予防するために切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布する。
- イソフルランをオフにし、動物が助けを借りずに連続して呼吸できるようになるまで、100%O2の人工呼吸器を通して呼吸できるようにします。2
- 完全に回復するまで、35〜37 °Cの温度で暖かいパッド上の寝具のないケージまたは覆われた寝具(ペーパータオルまたはドレープ)付きのケージにマウスを移します。
3. 間葉系幹細胞の分娩
注:処置に使用されるマウスの株は近交系であり、遺伝的に同一とみなされます。間葉系幹細胞は同じ株の動物から得られ、プロトコル設計により、免疫抑制は誘導されなかった1。
- 最初の手順で前に行った手順を完了します。
- はさみと鉗子を使用して、皮膚層から縫合糸を取り除きます。
- メス#10で、前の手術と同じ場所で切開を行います。
- 筋肉層縫合糸が見えるまで、メスを使って瘢痕組織を切断し続ける
- はさみと鉗子を使用して縫合糸を取り除き、筋肉層を切り開きます。
- リブを一緒に保持している縫合糸を視覚化して取り除き、前の切開から肋間筋を切断し続けます。
注:肺が胸壁に付着している可能性があり、これが発生した場合は、鈍いまたは湾曲した鉗子を使用して慎重に分離し、それらを解放します。 - 眼瞼レトラクタを肋間空間に配置し、前の結紮の領域を配置します。
- 間葉系幹細胞(3.0 x 105)をロードし、20μL PBSに懸濁し、30Gインスリン注射器に、適切な角度を注入するために必要に応じて針をわずかに曲げます。
注:間葉系幹細胞(MCS)は、4-6週齢のC56BL/6マウスの脂肪組織から単離した。初期の通路細胞(p3)は、生体内細胞の生存率モニタリングを可能にするCMVプロモーター下でホタルルシファーゼ遺伝子を発現するベクターを用いて導入した。脂肪由来マウスMSCはフローサイトメトリーを特徴とし、細胞はCD44、CD29、CD90およびCD105について陽性であったが、造血マーカーCD4514については陰性であった。注射に先立ち、MSCは解凍プロセスからの細胞の損失を避けるために少なくとも1つの通路のために培養した。 - 心臓の基部に向かって頂点から方向に移動すると、針の開口部が心筋の内側に完全に入るまで、シリンジを梗塞後の領域に挿入します。
- 中にゆっくりと心筋に細胞を注入し、3 s待ってから針を取り除きます。
- 心室細動などの細胞に異常な反応がないことを確認するために、3分間心臓を注意深く観察してください。
- 24 G IV カテーテルチューブを胸腔に入れ、開口部の右側に 1 つの肋間スペースを置きます。
- 肋間、筋肉、および皮膚層を閉じ、最初の手順と同じ方法で胸管を取り除きます。
- 1.5mLの温かい生理食液を皮下に投与し、感染を予防するために切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布する。
- イソフルランをオフにし、動物が100%O2で人工呼吸器を通2して呼吸できるようにし、助けを借りずに連続して呼吸できるようにします。
- 完全に回復するまで、35〜37 °Cの温度で暖かいパッド上の寝具のないケージまたは覆われた寝具(ペーパータオルまたはドレープ)付きのケージにマウスを移します。
4. 両方の手順に従った術後のケア
- 自発的な呼吸、胸骨の不順、正常な動きが確立されるまで、動物を継続的に観察してください。
- 手術当日に少なくとも3時間、15〜30分ごとに観察を続けます。
- マウスの創傷脱ヒスジェンスまたは異常な痛みを1日1回5日間、週2~3回チェックします。
- 動物が痛みの徴候を示す場合(すなわち、アーチ型の背中、最小限の動き、悲しみ、または不器用な毛皮)72時間後に、ブプレノルフィンSR鎮痛薬の追加用量を提供する。
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Representative Results
0日目にマウスで虚血再灌流傷害を誘発し、続いて幹細胞移植の前日に術後心エコー図と心電図を行った。超音波および心電図分析は梗塞を確認し、心室収縮機能を低下させた(図1A-D)。さらにデータを調べると、虚血性損傷を受けたマウスでは駆出率および分数短縮率が減少し、期末拡張期および収縮期の体積が増加した(表1)。正常なマウス心臓(図2A)と比較して、外傷後7日目の心筋組織のマッソントリクローム染色(図2B)は、左心室壁のコラーゲン沈着および薄化の増加を示した。2番目の手順は、傷害の7日後に行われた。マウスは間葉系幹細胞の心筋内注射(3.0 x 105 in 20 μL PBS)を与えられ、構成的に発現したCMVプロモーター下でレポーター遺伝子ホタルルシファーゼを安定的に発現させた。インビボ生物発光画像(BLI)は、幹細胞注入の翌日に完了し、注射に成功したことを確認した。MCの正常な送達は、虚血再灌流損傷を誘発したが、MSCを受け取らなかったマウスと比較して、BLIシグナルによって例示される(図3A、B)。この二重介入処置は、急性シナリオでMSCを受けた動物で観察されたのと同様に、22%の消耗率を持っていた。
図1:マウスの心臓機能のイメージング。 ベースライン(A)におけるマウスの超音波分析は、虚血再灌流傷害(B)の後のマウスと比較して左心室心筋の一様な収縮を示し、心室運動の減少を示す。正常マウス(C)のベースライン心電図と比較すると、虚血再灌流損傷(D)を有するマウスのSTセグメントに有意なシフトがあり、心室機能の低下を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| EF% | FS% | EDV (μl) | ESV (μl) | SV (μl) | |
| ベースライン | 74.19±1.2 | 44.67±2 | 23.8±3.6 | 6.14±0.98 | 17.68±2.7 |
| ポスト IR | 43.9±3.8 | 30.65±3.8 | 33.88±4.4 | 18.11±1.4 | 15.74±3.2 |
表1:心エコー分析 変数は、平均の平均値±標準誤差として表されます。EF: 駆出率, FS: 分数短縮, EDV: 末方座のボリューム, ESV: 終期収縮期容積, SV: ストロークボリューム.
図2:心臓組織の組織染色 通常マウスにおける心筋のトリクローム染色(A)は心臓組織への損傷を示さないのに対し、虚血再灌流損傷を有するマウス(B)は左心室の心筋におけるコラーゲン沈着および間引きの増加を示し、梗塞の成功の決定を支える。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生体内発光イメージング幹細胞の心筋内注射を受けられなかった虚血再灌流傷害を有するマウスは、生物発光シグナル(A)を示さなかった。間葉系幹細胞の遅延注射を受けた虚血再灌流傷害を有するマウス(CMV-FLUC)は、かなりの量のシグナルを示した(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
世界中で8500万人以上の人々が心血管疾患の影響を受けています3.これらの虚血性事象の高い有病率は、損傷した組織の再生を促進するための代替療法のさらなる開発および拡大を保証する。従来の方法は、治療剤1のその後の投与を伴う急性の設定で虚血再灌流手順を利用する。炎症反応は、心臓虚血性イベントを開始してから3〜4日間のピークにあり、好中球、マクロファージ、および増加したサイトカインシグナル10、12,の浸潤を伴う。死細胞分離のこの期間の後、一次免疫応答は、リモデリング相13に向かって沈静化および移行し始める。さらに、臨床現場で提示されたのと同じシナリオで治療を調査することが重要です。本稿では、核血性マウスから得られた代表的な結果を示し、MSCの注射が遅れた二重外科的処置の実現可能性および安全性を実証している。このアプローチは、心筋虚血動物モデルだけでなく、炎症が重要な役割を果たす可能性のある疾患の動物モデルにも使用でき、細胞や薬物療法などの生物学的製剤を含む治療戦略の成功を変えることができると考えています。
そこで、本稿では、マウスで虚血再灌流傷害を誘発してから7~10日後に、亜急性梗塞に幹細胞を送達する外科方法について述べる。この技術は、免疫応答の異なる段階と虚血性疾患プロセスの亜急性/慢性期に関連して幹細胞の生存率と生物学を研究するのに有用であろう。マウスモデルは、再現性と利便性の面でこの研究方法の理想的な被験者であるが、しかし、それらはいくつかの欠点を負う可能性がある。動物の大きさはある程度の外科的スキルを保証するが、実際には、これらの処置は正常に完了することができる。
この原稿に記載されている手順を実行するには、これらの手術の成功に不可欠ないくつかの重要なステップと観察に注意することが重要です。最初の手順の重要なステップは、左前前動脈の下降冠動脈(LAD)の結紮と、心筋の一時的な虚血を達成するためのポリエチレンチューブの配置である。無菌テーパードチップ綿棒を使用して、心房から心房に圧力をかけ、LADの高められた線引きを可能にする。チューブが所定の位置に配置され、縫合糸がしっかりと固定されると、組織の不整脈およびpallorの観察は、虚血の誘導を成功させるのに不可欠である。虚血の期間とその後の再灌流は、縫合糸が解放されると、複数の動物間の傷害の一貫性にとって重要である。さらに、第2の手順の間に、間葉系幹細胞の注入は、遠位から近位方向の水平運動で行われなければならない。最初の手順から得られる線維症のために、ショックを防ぐために針を挿入するために有意だが安定した圧力が必要であり、続いて細胞の一貫した注射が遅い。最後に、麻酔からマウスを目覚める前に連続熱および補足的な皮下液を提供し、熱損失を防ぎ、処置中に失われた血液の交換だけでなく、動物の全体的な回復を助ける。
本稿では、慢性虚血再灌流傷害のマウスモデルにおける治療的治療として幹細胞を投与する方法として、複数の手順を完了するためのプロトコルを提供する。これらの外科的処置の利用は、時間の経過とともに生存率を高めるために傷害後の敵対的虚血環境への幹細胞の送達のための新しいアプローチを提供する。幹細胞療法の研究のためにこのアプローチの使用は、急性期におけるSCの使用に焦点を当てた他の研究を有意に補完する。結論として、記載されたプロトコルは、虚血性傷害を誘発し、その後の前臨床試験のモデルとして使用するための幹細胞の移植の遅延を誘導することに成功する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% NaCl Irrigation, USP | Baxter | 0338-0048-04 | |
| 11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable | SAI Infusion Technologies | PSS-SD | |
| 24G 3/4" IV catheter tube | Jelco | 4053 | |
| 28G x 1/2" 1mL allergy syringe | BD | 305500 | Injection of analgesic |
| 30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe | Ulticare | 08222.0933.56 | Injection of stem cells |
| 6-0 S-29, 12" Vicryl suture | Ethicon | J556G | Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure |
| 9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture | Ethicon | 2829G | Ligation of the LAD artery |
| Absorbent underpad | Thermo Fischer Scientific | 14-206-64 | For underneath the animal |
| Alcohol prep pads, 2 ply, medium | Coviden | 6818 | |
| Anti-fog face mask | Halyard | 49235 | |
| Bonn Strabismus scissors, curved, blunt | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity). | |
| Castroviejo needle holders, curved | Fine Science Tools | 12061-01 | |
| Curity sterile gauze sponges | Coviden | 397310 | |
| Delicate suture tying forceps, 45 angle bent | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Electric Razor | Wahl | Fur removal | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Health | PI23238 | Anesthetic |
| Lab coat | |||
| Monoject 1 mL hypodermic syringe | Coviden | 8881501400 | |
| Moria iris forceps, curved, serrated (x2) | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Moria speculum retractor | Fine Science Tools | 17370-53 | |
| Mouse endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ||
| Nair depilatory cream | Johnson & Johnson | Fur removal | |
| Optixcare eye lube plus | Aventix | Sterile ocular lubricant | |
| Physiosuite ventilator | Kent Scientific | ||
| PolyE Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 72-0191 | Temporary compression of LAD artery |
| Povidone-iodine swabs | PDI | S41125 | |
| Scalpel, 10-blade | Bard-Parker | 371610 | |
| Sterile 3" cotton tipped applicators | Cardinal Health | C15055-003 | |
| Sterile 6" tapered cotton tip applicators | Puritan | 25-826-5WC | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | N8830 | |
| Sterilization pouches | Medline | MPP100525GS | |
| Surgery cap | |||
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Suture tying forceps, straight (x2) | Fine Science Tools | 10825-10 | |
| Transpore surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Triple antibiotic ointment | G&W Laboratories | 11-2683ILNC2 | Topical application to prevent infection |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Vetflo vaporizer | Kent Scientific |
References
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