Summary
Los planarios de agua dulce exhiben tres marchas (deslizamiento, peristalsis y esquivar) que se distinguen por el análisis cuantitativo del comportamiento. Describimos un método para inducir la ejecución utilizando diversos estímulos nocivos, la cuantificación de los mismos y la distinción de la peristalsis y el deslizamiento. Usando el derribo genético, demostramos la especificidad de la escorrida como una lectura fenotípica cuantitativa.
Abstract
Los planarios de agua dulce normalmente se deslizan suavemente a través de la propulsión ciliar en su lado ventral. Ciertas condiciones ambientales, sin embargo, pueden inducir formas de locomoción impulsadas por la musculatura: peristalsis o scrunching. Mientras que la peristalsis es el resultado de un defecto ciliar, el scrunching es independiente de la función de los cilios y es una respuesta específica a ciertos estímulos, incluyendo la amputación, la temperatura nociva, el pH extremo y el etanol. Por lo tanto, estas dos marchas impulsadas por la musculatura son mecánicamente distintas. Sin embargo, pueden ser difíciles de distinguir cualitativamente. Aquí, proporcionamos un protocolo para inducir scrunching usando diversos estímulos físicos y químicos. Detallamos la caracterización cuantitativa del scrunching, que se puede utilizar para distinguirla de la peristalsis y el deslizamiento, utilizando software de libre disposición. Dado que el scrunching es una marcha planaria universal, aunque con diferencias específicas de especies características, este protocolo se puede aplicar ampliamente a todas las especies de planarios, cuando se utilizan consideraciones apropiadas. Para demostrarlo, comparamos la respuesta de las dos especies planarias más populares utilizadas en la investigación conductual, Dugesia japonica y Schmidtea mediterranea,con el mismo conjunto de estímulos físicos y químicos. Además, la especificidad de la scrunching permite que este protocolo se utilice junto con la interferencia del ARN y/o la exposición farmacológica para diseccionar las dianas moleculares y los circuitos neuronales implicados, proporcionando potencialmente una visión mecanicista de aspectos importantes de la nocisión y la comunicación neuromuscular.
Introduction
Además de su popularidad para la investigación de células madre y regeneración1,2,3, planarios de agua dulce se han utilizado durante mucho tiempo en estudios de comportamiento4,5, aprovechando su tamaño comparativamente grande (unos pocos milímetros de longitud), facilidad y bajo costo de mantenimiento de laboratorio, y amplio espectro de comportamientos observables. La introducción de la visión computarizada y el seguimiento automatizado de los estudios de comportamiento plano6,,7,8,9,10,11 han permitido la diferenciación cuantitativa de los fenotipos conductuales. El comportamiento animal es una lectura directa de la función neuronal. Debido a que el sistema nervioso plano es de tamaño y complejidad medio, pero comparte elementos clave conservados con el cerebro vertebrado12,13,14, el estudio del comportamiento planario puede proporcionar información sobre mecanismos conservados de acción neuronal que pueden ser difíciles de sondear directamente en organismos más complejos. Así, los planarios son un modelo valioso para estudios comparativos de neurobiología8,,12,15,16,17,18,19,20,21. Además, el medio acuático permite una exposición rápida y fácil a los productos químicos para estudiar su efecto sobre la función cerebral en los planarios regeneradores y adultos, convirtiéndolos en un sistema popular para la neurotoxicología22,,23,,24,,25,,26.
Los planarios poseen tres marchas distintas, conocidas como deslizamiento, peristalsis y esquivar. Cada marcha se exhibe en circunstancias específicas: el deslizamiento es la marcha por defecto, la peristalsis se produce cuando la función ciliar se ve comprometida7,27, y el scrunching es una marcha de escape – independiente de la función de los cilios – en respuesta a ciertos estímulos nocivos7. Hemos demostrado que el scrunching es una respuesta específica, provocada por la sensación de ciertas señales químicas o físicas, incluyendo temperaturas extremas o pH, lesiones mecánicas o inductores químicos específicos, y por lo tanto no es una respuesta de estrés general7,,28,,29.
Debido a su especificidad y parámetros estereotípicos, que se pueden cuantificar fácilmente mediante este protocolo, el scrunching es un potente fenotipo conductual que permite a los investigadores realizar estudios mecánicos diseccionando vías sensoriales y control neuronal del comportamiento25,,28. Además, se ha demostrado que el esquivismo es un punto final sensible para el ensayo de efectos químicos adversos en el desarrollo del sistema nervioso y la función en los estudios de neurotoxicología22,24,25,30. Como varias vías sensoriales diferentes parecen converger para inducir el scrunching a través de varios mecanismos28, el scrunching se diferencia de otros comportamientos planarios porque se pueden utilizar diversos, pero específicos, estímulos para diseccionar distintos circuitos neuronales y estudiar cómo se integran diferentes señales para producir el fenotipo esquiroido.
Es importante destacar que existen diferencias de especies, en las que un producto químico puede provocar esquivar en una especie planaria, pero una respuesta conductual diferente en otra. Por ejemplo, hemos encontrado que la anandamida induce esquivar en la especie planaria Dugesia japonica, pero induce la peristalsis en Schmidtea mediterranea28. Este ejemplo destaca la importancia de poder distinguir de forma fiable entre las diferentes marchas, porque son las manifestaciones fenotípicas de mecanismos moleculares distintos. Sin embargo, la distinción de scrunching de peristalsis es difícil utilizando datos observacionales cualitativos, porque ambas marchas están impulsadas por la musculatura y comparten similitudes cualitativas7,,28. Así, para distinguir las marchas es necesario realizar imágenes de cilios o un estudio de comportamiento cuantitativo, que permita la distinción basada en los parámetros característicos7,,28. Debido a que las imágenes de cilios son experimentalmente desafiantes y requieren equipos especializados como un microscopio compuesto de alto aumento y una cámara de alta velocidad7,,28, no es tan ampliamente accesible para los investigadores como el análisis cuantitativo del comportamiento.
Aquí, presentamos un protocolo para (1) la inducción de scrunching utilizando diversos estímulos físicos (temperatura nociva, amputación, luz casi UV) y químicos (alilo isotiocianato (AITC), cinnamaldehído) y (2) el análisis cuantitativo del comportamiento planario utilizando software de libre disponibilidad. Mediante la cuantificación de cuatro parámetros (frecuencia de oscilaciones de longitud corporal, velocidad relativa, amplitud máxima y asimetría de alargamiento y contracción corporal)7, el esquivar se puede diferenciar de deslizamiento, peristalsis y otros estados de comportamiento reportados en la literatura, como locomoción similar a una serpiente15 o epilepsias15. Además, mientras que el scrunching se conserva entre las diferentes especies planarias7, cada especie tiene su propia frecuencia y velocidad característica; por lo tanto, una vez que se han determinado las velocidades de deslizamiento y esquivar de una especie, la velocidad por sí sola puede utilizarse como un medio para distinguir el esquivar del deslizamiento y la peristalsis29. El protocolo no supone ningún entrenamiento previo en análisis computacional de imágenes o estudios de comportamiento y, por lo tanto, también se puede aplicar para experimentos de comportamiento plano en un contexto de laboratorio de enseñanza a nivel de pregrado. En el Material Suplementario se proporcionan datos de ejemplo para facilitar la adaptación del protocolo.
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Protocol
1. Ensayos de comportamiento plano cuantitativo
- Configuración experimental
- Coloque un panel LED regulable sobre una superficie plana. El panel LED sirve para dos propósitos: (1) proporcionar un fondo blanco uniforme y (2) para ser utilizado como una fuente de luz ajustable para obtener el contraste adecuado. Coloque una arena de 100 mm sobre la placa Petri sobre el panel LED.
NOTA: Para aumentar el rendimiento, una placa de varios pozos se puede utilizar como una arena23,24, pero las arenas más grandes facilitan el análisis automatizado de imágenes. - Monte una cámara en un soporte de anillo sobre la arena(Figura 1A). Ajuste la posición, la altura y el enfoque de la cámara según sea necesario para que toda la arena esté centrada en el campo de visión y esté enfocada (Figura 1B).
NOTA: La resolución de la cámara debe ser lo suficientemente alta como para distinguir claramente un plano del fondo homogéneo proporcionado por el panel LED. - Llene la arena con los medios de exposición apropiados (agua planaria o solución química) a volumen medio máximo (esto se denominará baño). Esto corresponde a aproximadamente 25 ml para una placa Petri de 100 mm. Encienda el panel LED y apague cualquier otra fuente de luz que pueda afectar negativamente a la calidad de la grabación (es decir, fuentes de luz cercanas que producen un deslumbramiento en la arena).
ADVERTENCIA: Gestione las soluciones químicas peligrosas adecuadamente usando equipo de protección personal (PPE) completo y moviendo la configuración experimental a una campana de humo si es necesario. Siga las regulaciones federales y estatales sobre eliminación de desechos. - Suelta un plano hacia el centro de la arena usando una pipeta de transferencia. Comience a grabar. Grabe datos como secuencias de imágenes en un formato nativo de Fiji31 (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM o FITS; véase la sección 1.2).
NOTA: Debido a que los comportamientos y la sensibilidad a los estímulos externos varían entre los planarios individuales, es importante recopilar datos sobre un número suficientemente grande de réplicas biológicas, además de realizar réplicas técnicas. Hemos trabajado con hasta 10 planarios de tamaño medio (4-7 mm) en un plato Petri de 100 mm a la vez. Si bien el tiempo es eficiente, varios planarios en el plato Petri a la vez hacen que el análisis de datos sea más difícil, ya que los planarios pueden cruzarse.- Para experimentos de deslizamiento, grabe con al menos 1 fotograma por segundo (FPS). Para experimentos de scrunching/peristalsis, registre utilizando un FPS que sea al menos el doble de la frecuencia de scrunching/peristalsis de la especie planariana. Si la especie planaria tiene una frecuencia desconocida de scrunching/peristalsis, utilice 10 FPS como punto de partida y aumente/disminuya según corresponda.
- Cuando utilice una solución química, transfiera el planorio utilizando el menor número posible de gotas de agua planaria para que la concentración de la solución química no cambie significativamente.
- Para experimentos de planeo, registre 1-2 minutos de comportamiento de deslizamiento. Para experimentos de scrunching/peristalsis, registre el tiempo suficiente para capturar al menos 3 oscilaciones consecutivas que ocurren en línea recta. Una vez completado el experimento, termine la grabación.
NOTA: Para experimentos de scrunching/peristalsis, si un planario no satisface el criterio de terminación dentro de un período de tiempo fijo que debe ser coherente entre réplicas y se determina empíricamente en función del estímulo, termine la grabación y pruebe otro planario.- Si el planario alcanza el límite de la arena sin cumplir con el criterio de terminación, pipetee el planarian de vuelta al centro de la arena.
NOTA: Evite la pipeteo repetido de un individuo para la grabación, ya que esto puede cambiar su comportamiento.
- Si el planario alcanza el límite de la arena sin cumplir con el criterio de terminación, pipetee el planarian de vuelta al centro de la arena.
- Retire los planarios de la arena y deseche el agua planaria o la solución química en recipientes de desecho apropiados. Los planarios que estaban en agua planaria pueden ser devueltos a su contenedor de origen.
NOTA: Evite la contaminación cruzada utilizando diferentes arenas para diferentes medios (es decir, el deslizamiento en experimentos de agua planaria no debe ejecutarse en una arena utilizada anteriormente para experimentos de esquivar/peristalsis con exposición química).- Enjuague en serie a los planarios expuestos a una solución química en 3 platos Petri limpios de 100 mm llenos de 25 ml de agua planaria para diluir a fondo cualquier producto químico. Si se indujo scrunching o peristalsis, coloque estos planarios en un recipiente separado. Los planarios pueden ser devueltos a su contenedor de origen después de un mes ya que la mayoría de las celdas se habrían dado la vuelta en ese momento1.
NOTA: Si se necesitan varios experimentos diferentes para la misma población de planarios, por ejemplo, para una población de ARNi, permita que los planarios se recuperen durante 24 horas antes de ejecutar el siguiente experimento. Ordene los experimentos de tal manera que el experimento menos invasivo sea el primero y el experimento más invasivo (por ejemplo, la amputación) se ejecute en último lugar. - Si realizas varios experimentos en la misma arena, desecha correctamente la solución de baño y elimina los senderos de moco limpiando la arena con una toalla de papel entre carreras.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Enjuague en serie a los planarios expuestos a una solución química en 3 platos Petri limpios de 100 mm llenos de 25 ml de agua planaria para diluir a fondo cualquier producto químico. Si se indujo scrunching o peristalsis, coloque estos planarios en un recipiente separado. Los planarios pueden ser devueltos a su contenedor de origen después de un mes ya que la mayoría de las celdas se habrían dado la vuelta en ese momento1.
- Coloque un panel LED regulable sobre una superficie plana. El panel LED sirve para dos propósitos: (1) proporcionar un fondo blanco uniforme y (2) para ser utilizado como una fuente de luz ajustable para obtener el contraste adecuado. Coloque una arena de 100 mm sobre la placa Petri sobre el panel LED.
- Análisis cuantitativo del comportamiento planario
- Realice ensayos de comportamiento planario como se describe en la Sección 1.1.
- Abra la secuencia de imágenes sin procesar para un experimento en Fiji (Archivo > Importar > Secuencia de imágenes) y seleccione la primera imagen de la secuencia de imágenes. En la ventana Opciones de secuencia, marque la casilla "Ordenar nombres numéricamente" y haga clic en "Aceptar". Una vez cargada la secuencia de imágenes, convierta la secuencia de imágenes a 8 bits(Imagen > Texto > 8 bits)y utilice la herramienta de flecha o el control deslizante en la parte inferior de la pila de imágenes para observar o desplazarse por la secuencia de imágenes.
NOTA: Para experimentos de deslizamiento, todos los datos se pueden utilizar siempre y cuando el planario se pueda ver claramente a lo largo de la grabación. Sin embargo, por lo general es suficiente analizar el movimiento libre en el centro de la arena extrayendo la(s) parte(s) relevante(s) como se describe a continuación. - Para extraer un período de tiempo y una región de interés, dibuje una región de interés que abarque la ruta completa de un planario utilizando la herramienta rectángulo(Figura 2A, 2B). Haga clic con el botón derecho en la pila de imágenesy seleccione Duplicar ..., marque la casilla Duplicar pila, ingrese el primer y el último fotogramas de la secuencia de interés y haga clic en Aceptar. Si se crearon varias imágenes planarios simultáneamente, repita este paso de selección y duplicación de regiones para cada planario en la arena para que haya tantas pilas de imágenes abiertas como planarios en la arena. Los siguientes pasos (pasos 1.2.4-1.2.10) deben realizarse en cada pila de imágenes, uno a la vez.
- Para experimentos de deslizamiento, extraiga un período de deslizamiento donde el plano se mueve al menos el doble de su longitud corporal.
NOTA: Cuantos más datos de deslizamiento se extraigan por planarian, más fiables serán los datos. El planario no necesita moverse en línea recta para el análisis de deslizamiento. - Para experimentos de scrunching/peristalsis, extraiga una instancia cuando el planario se someta a un mínimo de tres oscilaciones corporales consecutivas (idealmente más) en línea recta, asegurándose de que cada oscilación sea un ciclo completo de elongación-contracción, ya que las oscilaciones completas son necesarias para determinar con precisión la frecuencia.
NOTA: Cuantas más oscilaciones se puedan extraer, más fiables serán los datos. No utilice secuencias en las que el plano esté girando, ya que dará lugar a mediciones de longitud inexactas.
- Para experimentos de deslizamiento, extraiga un período de deslizamiento donde el plano se mueve al menos el doble de su longitud corporal.
- Aplique un umbral a la pila de imágenes duplicadas (Imagen > Ajustar > Umbral) para binarizar la imagen y extraer el planorio del fondo. Ajuste las barras deslizantes según sea necesario para que todo el plano esté resaltado en rojo. Los valores exactos dependen de la calidad de la imagen. Deje las casillas Fondo oscuro, Histograma de pilay No restablecer el rango desactivadas. Desplácese por la pila de imágenes para asegurarse de un buen rango de umbrales (es decir, el planario está bien separado del fondo en toda la pila) y, a continuación, haga clic en Aplicar.
- En la ventana Convertir pila en binario, establezca método en Predeterminado y Fondo en Luz. Desmarque todas las casillas de esta ventana y, a continuación, haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen binarizada que muestra un plano negro sobre un fondo blanco (Figura 2C). Asegúrese de que todo el plano está visible en todos los fotogramas de la secuencia de imágenes.
NOTA: Los objetos no deseados de la secuencia de imágenes binarizadas que son más pequeños o más grandes que el planario se pueden filtrar en el análisis posterior utilizando un filtro de tamaño (Figura 2Ciii). - Establezca las medidas haciendo clic en Analizar > Definir medidas. Marque las casillas De laelipse Area , Center of mass, Stack positiony Fit y haga clic en OK.
NOTA: Estos parámetros solo deben establecerse una vez por sesión de Fiji. - Seleccione la pila de imágenes abiertas y seleccione Analizar > Analizar partículas.
- En la ventana Analizar partículas, seleccione Mostrar > Máscaras para abrir una nueva pila que muestre todos los objetos detectados con los parámetros elegidos. Esto se puede utilizar para comprobar visualmente que solo se están tomando medidas del plano. Se puede establecer un filtro de tamaño en este paso para eliminar el ruido no deseado introduciendo el área aproximada del planorio (en píxeles2 unidades) en el espacio proporcionado. Marque las casillas Mostrar resultados y Borrar resultados y haga clic en Aceptar.
NOTA: En la ventana Resultados, si el índice (primera columna) no es igual al número de sector para todas las filas, esto significa que se realizaron un seguimiento de demasiados o muy pocos objetos. Una posibilidad para esta discrepancia es la presencia de otros objetos además del planario o que el planario no fue rastreado en marcos específicos. - Pase por la pila de imágenes de máscara con el control deslizante situado en la parte inferior del panel. Si hay algún ruido o hay fotogramas que carecen de un plano, cierre la ventana Resultados y la pila de imágenes de máscara. Repita los pasos 1.2.7-1.2.8 ajustando el filtro de área para eliminar solo objetos distintos del planario.
NOTA: Si falta el plano de la máscara, esto sugiere que el límite inferior del filtro de área se ha establecido demasiado alto. - En la ventana Resultados, guarde los datos mediante Archivo>Guardar como. Agregue la extensión .csv al nombre de archivo para guardar los datos como valores separados por comas. Una vez guardados los datos de la pila de imágenes, cierre la pila de imágenes respectiva y las ventanas Resultados y Máscara.
- Importe datos y analice más a fondo utilizando cualquier software de hoja de cálculo o software gratuito. Para calcular la velocidad de deslizamiento, consulte la sección 1.3. Para calcular el conjunto de parámetros completos scrunching/peristalsis, consulte la sección 1.4.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. - Para determinar la conversión de píxel a longitud real, abra una imagen en Fiji con una longitud de referencia (por ejemplo, el diámetro de la arena). Seleccione la herramienta de línea y dibuje una línea sobre la longitud conocida.
- Convierta unidades de píxeles en una unidad de longitud estándar haciendo clic en Analizar > Establecer escala. Introduzca la longitud correspondiente a la línea dibujada en la imagen en el cuadro Distancia conocida y cambie Unidad de longitud de píxel a la unidad de longitud estándar elegida. El factor de conversión se escribe junto a Escala.
NOTA: No se requiere un valor de conversión de píxeles para los análisis de deslizamiento o scrunching/peristalsis en las secciones 1.3 y 1.4.
- Cálculo de la velocidad de deslizamiento
- Utilizando el archivo de datos guardado en la Sección 1.2, cargue las coordenadas x e y del centro de masa (COM) y los datos del eje principal. Si los datos se guardan como un archivo de valores separados por comas, estas listas corresponden a las columnas "XM", "YM" y "Major", respectivamente.
- Calcule el desplazamiento (d) del centro de masa planario en píxeles para cada fotograma con respecto al siguiente fotograma utilizando las columnas de datos "XM" e "YM". El desplazamiento (d) depende de:
donde x1 e y1 se refieren a las coordenadas COM (XM, YM) de un fotograma y x2 e y2 se refieren a las coordenadas COM (XM, YM) del fotograma subsiguiente. - Establezca la longitud del cuerpo plano como elpercentil 95 de la columna "Mayor". Dado que los planarios exhiben un comportamiento de preferencia de muro32,esto garantiza que la longitud del cuerpo planario calculada sea representativa de cuándo el planario es alargado24.
- Normalice el desplazamiento por longitud de cuerpo planario dividiendo los desplazamientos de píxeles por fotograma por la longitud del cuerpo planoiano (l). El desplazamiento normalizado (dn) depende de:
- Genere una lista de velocidades normalizadas dividiendo los desplazamientos normalizados por el tiempo transcurrido por fotograma (inverso del FPS registrado). La velocidad de deslizamiento normalizada (sn) viene dada por:
- Calcular la velocidad de deslizamiento normalizada del planario tomando el promedio de la lista de velocidades normalizadas (sn). La desviación estándar se puede utilizar como una medida de incertidumbre para el planario.
- Repita los pasos 1.3.1-1.3.6 para cada planario que se va a analizar. Promedio y tomar la desviación estándar de las velocidades de deslizamiento para todos los planarios para obtener la velocidad de deslizamiento y la incertidumbre asociada, respectivamente, para una población planaria.
- Distinción de las marchas de scrunching y peristalsis utilizando el conjunto de parámetros completo
- Cargue la lista de datos del eje principal desde el archivo de datos guardado en la Sección 1.2. Si los datos se guardan como un archivo de valores separados por comas, esto corresponde a la columna Principal.
- Cree una lista que numero cada punto de datos en la columna Principal, empezando por 0. Convierta esta lista en tiempo transcurrido por fotograma dividiendo entre el FPS grabado.
- Trazar los datos de la columna Principal con respecto al tiempo transcurrido para generar una gráfica de oscilación de scrunching/peristalsis (Figura 3A). Usando la gráfica de oscilación, recorte los datos a al menos tres oscilaciones consecutivas en línea recta (Figura 3Bi). Recortar los datos para iniciar y terminar en picos locales (elongación máxima de oscilación) o valles (elongación mínima de oscilación).
NOTA: Si los extremos locales no son aproximadamente iguales (los picos/valles difieren dramáticamente en alturas), esto sugiere que las oscilaciones no son de línea recta (Figura 3Bii). Extraiga otra secuencia de al menos tres oscilaciones consecutivas en línea recta. Consulte la Sección 1.2. - Confirme que la secuencia de oscilación de interés se ha extraído y recortado correctamente mediante la nueva gráfica de los datos principales recortados con respecto al tiempo. Utilice esta lista de datos recortados para todos los cálculos posteriores.
- Para calcular la frecuencia de oscilación ,mdivida el número de oscilaciones (On) por el número total de puntos de datos de la lista de datos del eje principal recortado (N). Multiplique FPS por este valor para obtener frecuencia en oscilaciones por segundo.
- Para calcular el alargamiento máximo (o el alargamiento máximo) max), restar la longitud mínima absoluta del cuerpo (lmin) de la longitud máxima absoluta del cuerpo (lmax). Normalizar a la longitud del cuerpo alargado dividiendo por la longitud máxima absoluta del cuerpo.
- Para calcular la velocidad por longitud del cuerpo (v*m), multiplique la elongación máxima calculada por la frecuencia de oscilación.
NOTA: La velocidad por sí sola se puede utilizar para distinguir entre marchas scrunching y peristalsis7. - Para calcular la fracción de tiempo dedicado a alargar (felong),tome la derivada de la lista de datos del eje principal recortado con respecto al tiempo. Divida el número de puntos de datos positivos (es decir, cuando la derivada es >0 (np), por el número total de puntos de datos en la lista de datos del eje principal (nt)).
NOTA: Los planarios escurridos exhiben una fracción asimétrica del tiempo dedicado a alargar, mientras que los planarios que realizan peristalsis pasan la misma cantidad de tiempo alargando y contratando7. - Repita los pasos 1.4.1-1.4.8 para cada planario que se va a analizar. Calcule un parámetro de población plana establecido tomando la desviación media y estándar de cada parámetro.
NOTA: El conjunto de parámetros se puede utilizar para determinar si el comportamiento de oscilación es scrunching, peristalsis o alguna otra forma de locomoción con cambios periódicos en la forma del cuerpo. Tanto el scrunching como la peristalsis tienen parámetros fijos para una especie dada7,con parámetros escrupulosos generalmente mayores que los parámetros de peristalsis7. Si bien es posible que uno de los parámetros pueda quedar fuera del rango específico de la especie, como hemos observado previamente con la inducción química28,el comportamiento observado debe estar de acuerdo con al menos 3 de 4 parámetros publicados para ser categorizados como peristalsis o scrunching.
2. Inducción de esquivar
- Estímulos físicos (temperatura nocúable, luz UV, amputación)
- Para todos los experimentos de estímulo físico, consulte la Sección 1.1 para la configuración experimental.
NOTA: Lo mejor es utilizar una arena grande, como una placa Petri de 100 mm, para experimentos de estímulo físico para permitir más espacio abierto para maniobrar una pipeta y / o cuchilla de afeitar. - Para inducir el scrunching a través de una temperatura nocárica, caliente el agua planaria en un vaso de precipitados de vidrio (al menos 100 ml por planarian a probar) a 65 oC en una placa caliente.
- Coloque un plano en el centro de la arena. Espere hasta que el plano se oriente erguido y comience a deslizarse. Comience a grabar.
- Usando una pipeta P-200, pipetee lentamente 100 l del agua planaria de 65oC postfaríngea en el extremo de la cola del planario para inducir el scrunching.
NOTA: Asegúrese de que el agua planariana calentada se mantenga a 65oC. Si es necesario, vuelva a recalentar el agua a 65oC antes de iniciar otro experimento. Dado que la presión también puede inducir el encogimiento, es necesario pipetear lentamente. Pipetear agua a temperatura ambiente de la misma manera que en el experimento puede servir como una opción de control y práctica. - Detenga la grabación una vez que el scrunching haya cesado. Coloque el planario en un recipiente de recuperación e intercambie los medios en el plato de petri con agua planaria fresca a temperatura ambiente si realiza más experimentos.
- Para inducir el scrunching a través de la amputación, transfiera un plano al centro de la arena y espere hasta que el plano se oriente erguido y comience a deslizarse. Comience a grabar.
- Amputar el planario usando una cuchilla de afeitar limpia. Las amputaciones se pueden hacer en cualquier lugar a lo largo del plano, siempre y cuando la ubicación de corte sea consistente en todos los experimentos.
NOTA: Los parámetros de escote se extraen de la pieza anterior. Por lo tanto, evite obstruir la vista de la cámara de esta parte del plano al aplicar el corte acercándose desde el extremo posterior. Los resbalones de cubierta de plástico también funcionan bien para el corte y son una opción más segura, especialmente en un entorno de enseñanza. - Detenga la grabación una vez que la pieza anterior haya dejado de correr. Retire ambas piezas, colóquelas en un recipiente separado y deje que se regeneren durante 7 días. Los planarios amputados se pueden reincorporarse en el contenedor doméstico una vez regenerados.
- Amputar el planario usando una cuchilla de afeitar limpia. Las amputaciones se pueden hacer en cualquier lugar a lo largo del plano, siempre y cuando la ubicación de corte sea consistente en todos los experimentos.
- Para inducir el scrunching usando luz cercana a los rayos UV, adjunte los filtros apropiados (por ejemplo, filtros Roscolux) a la lente de la cámara para reducir la cantidad de luz reflejada cerca de los rayos UV que es recogida por la cámara y puede interferir con la toma de imágenes de la respuesta del planario. En lugar de utilizar el panel LED para iluminar la arena desde abajo, utilice la iluminación roja ambiental a la que los planarios son insensibles33.
- Llenar una arena de platos Petri de 100 mm con agua planaria y colocar un solo planario (5-9 mm) en el centro de la arena. Comience a grabar a 10 FPS.
- Sostenga un puntero láser UV clase II (405 ± 10 nm, potencia de salida <5 mW) aproximadamente a 30 cm de la arena. Coloque el puntero láser en un ángulo de 45o desde el plano de deslizamiento y luego brille el puntero láser durante 5-10 segundos a medio camino entre el extremo posterior de la faringe y la punta de la cola para inducir el esquico.
NOTA: La potencia del puntero láser se puede medir utilizando un medidor de potencia casi sensible a los rayos UV. - Espere a que el planario comience a deslizarse de nuevo antes de intentar dos estimulaciones más en el mismo individuo para probar la reproducibilidad de la reacción. Si el planario sigue mostrando el mismo comportamiento, deje de grabar y vuelva a colocar el plano en su contenedor. Si el comportamiento cambia entre estimulaciones, pruebas adicionales mostrarán qué respuesta es la más prominente.
NOTA: Los planarios pueden desensibilizarse a la luz cercana a los rayos UV y dejarán de reaccionar. Las estimulaciones consecutivas requieren un período de descanso de 8-10 segundos.
- Para todos los experimentos de estímulo físico, consulte la Sección 1.1 para la configuración experimental.
- Estímulo químico (AITC)
- Para inducir el scrunching usando un producto químico, por ejemplo, el agonista TRPA1 AITC28, los planarios están idealmente sumergidos en un baño de la sustancia química. Si es necesario, el pipeteo se puede aplicar como se describe en la sección 2.1.2.3.
ADVERTENCIA: AITC es inflamable, agudamente tóxico, puede causar irritación de la piel y los ojos, sensibilización respiratoria y de la piel, y es peligroso para la vida acuática. El aceite AITC debe manipularse en una campana de humo. Antes de hacer soluciones de stock de AITC, póngase el EPI apropiado (guantes de nitrilo y una capa de laboratorio) y configure contenedores adecuados de eliminación de residuos sólidos y líquidos peligrosos. - En una campana de humo, haga una solución de stock de 10 mM de AITC en agua planaria en un tubo centrífugo de 50 ml. Esta solución en stock se puede utilizar hasta un mes cuando se almacena a 4oC.
- A partir de este stock, preparar una solución de trabajo de 25 ml de 100 m AITC en agua planaria en un tubo centrífugo de 50 ml. Esta solución AITC de 100 m se utilizará para inducir el esquivar en los planarios.
NOTA: 100 M AITC induce un scrunching consistente en D. japonica y S. mediterranea planarians28. Para otros planarios acuáticos, 100 m puede servir como concentración inicial y se puede ajustar en consecuencia. - Configure la configuración experimental (consulte la Sección 1.1). Llene la arena con la solución de trabajo AITC y colóquela en un contenedor secundario. El contenedor secundario debe contener al menos el doble del volumen de la arena.
NOTA: Los experimentos se pueden llevar a cabo dentro de una campana de humo para mayor seguridad. - Transfiera hasta 10 planarios al centro de la arena y comience a grabar.
- Una vez que los planarios se vuelven insensibles y dejan de correr, deje de grabar. Retire los planarios de la solución AITC y enjuague (consulte la Sección 1.1). Deseche los residuos sólidos y líquidos de AITC en contenedores de residuos adecuados.
- Verifique la especificidad de la respuesta a AITC utilizando RNAi a TRPA128 siguiendo los protocolos estándar.
- A partir de este stock, preparar una solución de trabajo de 25 ml de 100 m AITC en agua planaria en un tubo centrífugo de 50 ml. Esta solución AITC de 100 m se utilizará para inducir el esquivar en los planarios.
- Para inducir el scrunching usando un producto químico, por ejemplo, el agonista TRPA1 AITC28, los planarios están idealmente sumergidos en un baño de la sustancia química. Si es necesario, el pipeteo se puede aplicar como se describe en la sección 2.1.2.3.
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Representative Results
La percepción extraocular cercana a los rayos UV en S. mediterranea planarians depende de TRPA1 y se ha propuesto vincularse a H2O2 release17. Debido a que la exposición H2O2 induce a la aceptación dependiente de TRPA1 en S. mediterranea y D. japonica planarios28, los pasos de la Sección 2.1.4 se pueden utilizar para probar si la exposición a la luz cercana a los rayos UV induce un escote en ambas especies. Mientras que D. japonica planarios escrunch (10/10) cuando se expone a la luz casi UV, S. mediterranea planarians exhiben adelgazamiento de la cola (7/10) como se describió anteriormente17 o ninguna respuesta (3/10) (Figura 4A,4B). Una cuantificación de los parámetros de scrunching, como se describe en la Sección 1.4, para los planarios D. japonica que exhibieron al menos 3 scrunches consecutivos en línea recta revela parámetros característicos de scrunching para esta especie7,28 (má 0.84 ± 0.14, • ? máx. 0,56 ± 0,06, v*m a 0,47 ± 0,07, y f elong a 0,56 ± 0,03, valores notificados como desviación media ± estándar para N-7).
Por el contrario, la exposición a 250 m de cinnamaldehído, un agonista conocido de TRPA1 en ratones34, causa escorzos en S. mediterranea7,28 (má 0,46 ± 0,08, • ? máx. 0,36 ± 0,08, v*m a 0,16 ± 0,04, y felong a 0,58 ± 0,04, los valores notificados como media n ± desviación estándar para N-8) ( Figura5A), mientras que D. japonica planarians al mismo (y 1,6 veces la concentración) muestran una mezcla de movimiento de serpiente y oscilador, interrumpido por deslizamiento y/o giros vigorosos de la cabeza (Figura 5A) . Una cuantificación de las muestras (8/24) con al menos tres oscilaciones consecutivas produce valores significativamente más bajos para 3 de 4 parámetros de los esperados para el esquivar en esta especie(mm a 0,43 ± 0,08, • ? máx. 0,39 ± 0,03, v*m a 0,17 ± 0,02, y f alargar a 0,54 ± 0,06, valores notificados como desviación media ± estándar para N-8). Así, mientras que D. japonica parece estrucerse sobre la exposición al cinnamaldehído, una comparación de los parámetros calculados con los valores de literatura para esta especie7,28 muestra que el movimiento oscilatorio observado no es escarúno. Este ejemplo destaca la importancia de las mediciones cuantitativas junto con una inspección cuidadosa de los datos de comportamiento sin procesar para interpretar correctamente los comportamientos observados.
El ARNi confirma la especificidad de la escogía en respuesta a la exposición al cinnamaldehído en S. mediterranea. Dentro de los 180 segundos de la exposición a 250 m de cinnamaldehído en agua planaria 15/15 unc22 (control) RNAi S. mediterranea planarians escudriñado, mientras que 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians escalofrianos revueltos(Figura 5B), lo que demuestra que S. mediterranea scrunching en cinnamaldedeh requiere SmnaterraDEdehy requiere SmnaTERRAT1. El derribo de SmTRPA1 se confirmó a través de una exposición de 60 segundos a un baño AITC de 100 m28.
Figura 1: Configuración experimental de comportamiento plano.
(A) Ejemplo de configuración experimental para estudiar el comportamiento planario. (B) 100 mm Petri dish arena centrada en el campo de visión de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos representativos del análisis de imágenes de Fiji de los planarios en arena.
(A) Región de interés seleccionada, que abarca la ruta planaria completa, indicada por el rectángulo amarillo. (B) Marcos de muestra de la región de interés después de la duplicación. (C) Restar el plano de fondo y ruido mediante umbral (i) imagen planariana con ruido, denotado por el asterisco. (ii) Imagen binarizada de planario después del umbral. (iii) Máscara de planario después de ajustar el filtrado por tamaño para eliminar el ruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Trazado de la longitud planaria con respecto al tiempo.
(A) Gráfica cruda de longitud planaria frente al tiempo para un S. mediterranea planarian. El asterisco denota un momento en que el plano se volvió mientras se escaba. (B) Posibles formas de recortar los datos de scrunching. (i) Un trazado recortado correctamente que elimina los datos del evento de torneado. (ii) Una gráfica recortada incorrectamente que no elimina los datos del evento de torneado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Respuestas específicas de especies a la luz cercana a los rayos UV.
(A) Marcos de muestra de D. japonica scrunching y S. mediterranea adelgazamiento de la cola en respuesta a la luz cercana a los rayos UV. (B) Gráficas de oscilación representativas de S. mediterranea y D. japonica en respuesta a la luz cercana a los rayos UV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Respuesta específica de la especie a 250 m de cinnamaldehído, un agonista TRPA1.
(A) Gráficas de oscilación representativas para D. japonica y S. mediterranea planarians en un baño de cinnamaldehído de 250 m. (B) Gráficas de oscilación representativas que muestran la pérdida de scrunching en 250 m de cinnamaldehído en SmTRPA1 RNAi S. mediterranea planarians. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Usando este protocolo, se pueden estudiar cuantitativamente los efectos de los estímulos físicos y químicos7,28,29 o la manipulación genética (RNAi)28,29 en la locomoción plana. Para maximizar la resolución espacial, lo mejor es mover la cámara lo más cerca posible de la arena mientras se asegura de que toda la arena esté en el campo de visión. Para aumentar el rendimiento, el comportamiento de varios planarios se puede examinar a la vez mediante la grabación de varios planarios simultáneamente. Al examinar más de un planar en una sola arena, se pueden dibujar regiones de interés en Fiji para aislar planarios individuales como se describe aquí o se puede emplear un seguimiento multiobjeto más avanzado. Un problema con tener varios planarios en la misma arena es que pueden cruzarse. Este problema se puede resolver mediante el uso de placas multi-pozo para aislar planarios entre sí, al mismo tiempo que permite el registro simultáneo de muchas personas para cuantificar el comportamiento23,,24. Sin embargo, los planarios pasarán relativamente más tiempo en la pared en arenas más pequeñas, lo que requiere ajustes en el análisis de la imagen y limita la resolución para la cuantificación de la escrutación/peristalsis.
Cuando los estímulos se administran localmente (por ejemplo, pipeteo7, amputación7,28, puntero láser17), es crucial que los planarios se estimulen constantemente en la misma región porque estimular otras regiones del cuerpo potencialmente puede inducir diferentes comportamientos. Diferentes métodos de administración (como pipeteo o baño de un producto químico) también pueden afectar la consistencia del fenotipo conductual. Además, los planarios pueden desensibilizar rápidamente28, que debe tenerse en cuenta al planificar experimentos como los mismos planarios no deben reutilizarse inmediatamente para varios experimentos, ya sea utilizando el mismo o diferentes estímulos. Por último, como se muestra aquí para la exposición casi UV y el cinnamaldehído, es importante ser consciente de que el mismo estímulo puede inducir comportamientos distintos en diferentes especies planarias. D. japonica escababa cuando se estimula con luz casi UV cerca de la punta de la cola, mientras que los planarios de S. mediterranea mostraron adelgazamiento de la cola. Por el contrario, la exposición al cinnamaldehído indujo scrunching en S. mediterranea pero no en D. japonica planarians. Así, mientras que el scrunching es una respuesta conservada de varias especies planarias a estímulos nocivos7, tiene parámetros específicos de especies7,28, sensibilidades28, e inductores28. Por lo tanto, para una nueva especie para la que aún no se ha parametrizado la escogía, lo mejor es comenzar con un inductor bien conservado, como la amputación7,para determinar los parámetros específicos de la especie antes de probar la respuesta a otros estímulos.
Una limitación del análisis descrito aquí es que no tiene en cuenta los giros y/o comportamientos mixtos, como el retroceso intermitente con la cabeza ondulada, el deslizamiento u otros cambios en la forma del cuerpo. Sin embargo, una inspección minuciosa de los datos sin procesar puede ayudar a mitigar estos problemas si estas instancias se excluyen manualmente del análisis, como se muestra en la figura 3. Además, es posible agregar análisis de forma corporal al centro de seguimiento de masa y longitud descrito aquí y expandir el protocolo para cuantificar estos otros comportamientos planarios. Dado que el análisis no hace ninguna suposición sobre el organismo estudiado, el protocolo podría en principio aplicarse en principio también a otros organismos que muestren tipos de comportamientos similares.
El método de cuantificación de las diferentes marchas planarias y distinguir el scrunching de la peristalsis, como se describe aquí, no supone ningún entrenamiento previo en análisis de imágenes computacionales o estudios conductuales y no requiere equipo o software especializado. Para facilitar la adaptación del protocolo, se proporcionan datos de ejemplo en el Material Suplementario. La facilidad de obtener y cultivar planarios, así como la capacidad de registrar comportamientos sin equipo especializado, hace que los estudios de comportamiento planarios sean ampliamente accesibles para la investigación en todos los niveles, desde las aulas de la escuela primaria hasta los laboratorios académicos. Una versión modificada de este protocolo se ha utilizado con éxito en un entorno de laboratorio de enseñanza que estaba compuesto principalmente por estudiantes de primer y segundo año e incluía tanto a las posibles especializaciones STEM como a las no STEM.
La combinación de herramientas moleculares (RNAi) y químicas con análisis cuantitativos del comportamiento, como se describe en este protocolo, permite a los investigadores obtener información mecanicista sobre el control molecular del comportamiento. Tal trabajo ha descubierto algunos de los mediadores clave y circuitos neuronales implicados en el deslizamiento planoiano19,20, fototaxis17,35,36, termotaxis9,37, y scrunching9,28,29. Aunque los comportamientos planarios pueden no tener comportamientos corolarios directos en organismos superiores, como los seres humanos, estos comportamientos representan funciones neuronales fundamentales importantes para todos los organismos - la capacidad de detectar y procesar estímulos específicos y reaccionar adecuadamente. Debido a la conservación de las funciones neuronales clave en diferentes organismos, los estudios mecánicos en planarios pueden enseñarnos más ampliamente sobre el control neuronal del comportamiento. Además, el análisis del comportamiento plano en respuesta a la exposición química se puede utilizar para estudiar los efectos del producto químico en el sistema nervioso plano23,24,25, que puede informar sobre los riesgos potenciales para el cerebro humano. En particular, se encontró que el escorriente inducido por el calor nocivo era un punto final sensible y específico para el ensayo de la neurotoxicidad, ya que se ve interrumpido por la exposición a ciertas clases de sustancias químicas22,,24,,25,,30. Finalmente, las capacidades regenerativas únicas del planario permiten a los investigadores diseccionar la dinámica de cómo se restauran los diferentes comportamientos durante la neuroregeneración.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Sr. Tapan Goel los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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