Summary

Planarian Scrunching som en kvantitativ beteendemässiga Readout för skadliga Stimuli Sensing

Published: July 30, 2020
doi:

Summary

Sötvatten planarianer uppvisar tre gångarter (glidning, peristaltik, och scrunching) som är urskiljbara genom kvantitativ beteendeanalys. Vi beskriver en metod för att inducera scrunching med hjälp av olika skadliga stimuli, kvantifiering därav och åtskillnad från peristaltik och glidflygning. Med hjälp av gen knockdown, visar vi specificiteten av scrunching som en kvantitativ fenotypisk avläsning.

Abstract

Sötvattenplanarianer glider normalt smidigt genom ciliär framdrivning på deras ventrala sida. Vissa miljöförhållanden kan dock framkalla muskulatur-driven former av förflyttning: peristaltik eller scrunching. Medan peristaltiken resultat från en ciliary defekt, scrunching är oberoende av cilier funktion och är ett specifikt svar på vissa stimuli, inklusive amputation, skadliga temperatur, extrema pH och etanol. Således är dessa två muskulatur-driven gångarter mekanistiskt distinkta. De kan dock vara svåra att urskilja kvalitativt. Här ger vi ett protokoll för att förmå scrunching med hjälp av olika fysiska och kemiska stimuli. Vi detalj den kvantitativa karakterisering av scrunching, som kan användas för att skilja den från peristaltik och glidning, med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Eftersom scrunching är en universell planarisk gång, om än med karakteristiska artspecifika skillnader, kan detta protokoll i stort sett tillämpas på alla arter av planarianer, när man använder lämpliga överväganden. För att visa detta jämför vi svaret från de två mest populära plana arter som används i beteendeforskning, Dugesia japonica och Schmidtea mediterranea, till samma uppsättning fysiska och kemiska stimuli. Dessutom tillåter specificiteten av scrunching detta protokoll som ska användas tillsammans med RNA-interferens och/eller farmakologisk exponering för dissekera de molekylära mål och neuronala kretsar inblandade, potentiellt ger mekanistisk inblick i viktiga aspekter av nociception och neuromuskulär kommunikation.

Introduction

Förutom deras popularitet för stamceller och regenerering forskning1,2,,3, sötvatten planarianer har länge använts i beteendestudier4,5, dra nytta av deras jämförelsevis stora storlek (några millimeter i längd), lätthet och låg kostnad för laboratoriet underhåll, och brett spektrum av observerbara beteenden. Införandet av datorseende och automatiserad spårning till planarisk beteende studier6,7,8,9,10,11 har möjliggjort kvantitativ differentiering av beteendemässiga fenotyper. Djurbeteende är en direkt avläsning av neuronal funktion. Eftersom det planiska nervsystemet är av medelstorlek och komplexitet, men aktier bevarade viktiga element med ryggradsdjur hjärnan12,13,14, studera planarisk beteende kan ge insikt i bevarade mekanismer för neuronala åtgärder som kan vara svårt att direkt sond i mer komplexa organismer. Således är planarianer en värdefull modell för jämförande neurobiologistudier 8,12,15,16,17,18,19,20,21. Dessutom tillåter vattenmiljön för snabb och facile exponering för kemikalier för att studera deras effekt på hjärnans funktion i regenererande och vuxna planarianer, vilket gör dem till ett populärt system för neurotoxikologi22,23,24,25,26.

Planarianer besitter tre distinkta gångarter, som kallas glidflygning, peristaltik och scrunching. Varje gång är utställd under särskilda omständigheter: glidning är standardgång, peristaltik inträffar när ciliär funktion äventyras7,27, och scrunching är en flykt gång – oberoende av cilier funktion – som svar på vissa skadliga stimuli7. Vi har visat att scrunching är ett specifikt svar, framkallas av känslan av vissa kemiska eller fysiska ledtrådar, inklusive extrema temperaturer eller pH, mekanisk skada, eller specifika kemiska inducerare, och därmed inte är en allmän stressrespons7,28,29.

På grund av dess specificitet och stereotypa parametrar, som lätt kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll, scrunching är en kraftfull beteendemässiga fenotyp som gör det möjligt för forskare att utföra mekanistiska studier dissekera sensoriska vägar och neuronal kontroll av beteende25,28. Dessutom har scrunching visat sig vara en känslig endpoint för att analys skadliga kemiska effekter på nervsystemets utveckling och funktion i neurotoxikologistudier 22,24,25,30. Som flera olika sensoriska vägar verkar konvergera för att framkalla scrunchinggenom olika mekanismer 28, scrunching skiljer sig från andra planarian beteenden eftersom olika, men specifika, stimuli kan användas för att dissekera distinkta neuronala kretsar och studera hur olika signaler är integrerade för att producera scrunching fenotyp.

Viktigt, arter skillnader finns, där en kemikalie kan framkalla scrunching i en planarian art, men en annan beteendemässiga svar i en annan. Till exempel har vi funnit att anandamid inducerar scrunching i den plana arter Dugesia japonica men inducerar peristalsis i Schmidtea medelhavet28. Detta exempel belyser vikten av att kunna på ett tillförlitligt sätt skilja mellan de olika gångarter, eftersom de är de fenotypiska manifestationer av distinkta molekylära mekanismer. Men är åtskillnad av scrunching från peristaltiken svårt att använda kvalitativa observationsdata, eftersom båda gångarter är muskulatur-driven och dela kvalitativa likheter7,28. Således, för att skilja de gångarter är det nödvändigt att utföra cilier bildbehandling eller en kvantitativ beteendestudie, som möjliggör åtskillnad baserad på karakteristiska parametrar7,28. Eftersom cilia imaging är experimentellt utmanande och kräver specialiserad utrustning såsom en hög förstoring förening mikroskop och en höghastighetskamera7,28, det är inte så brett tillgänglig för forskare som kvantitativbeteendeanalys.

Här presenterar vi ett protokoll för (1) induktion av scrunching med hjälp av olika fysiska (skadliga temperatur, amputation, nära UV-ljus) och kemiska (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyd) stimuli och (2) den kvantitativa analysen av planarisk beteende med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Genom att kvantifiera fyra parametrar (frekvens av kroppslängd svängningar, relativ hastighet, maximal amplitud, och asymmetri av kroppen töjning och kontraktion)7, scrunching kan skiljas från glidning, peristaltik, och andra beteendemässiga tillstånd rapporteras i litteraturen, såsom orm-liknande locomotion15 ores15. Vidare, medan scrunching bevaras bland olika plana art7, har varje art sin egen karakteristiska frekvens och hastighet; därför, när glid- och scrunchinghastigheterna för en art har fastställts, kan hastigheten ensam användas som ett medel för att skilja scrunching från glidning och peristaltik29. Protokollet förutsätter ingen föregående utbildning i beräkningsbildanalys eller beteendestudier och kan därmed också tillämpas för planatiska beteendeexperiment i ett undervisningslaboratoriekontext på grundnivå. Exempel data för att underlätta protokoll anpassning tillhandahålls i det kompletterande materialet.

Protocol

1. Kvantitativa plana beteende analyser Experimentell inställningPlacera en dimbar LED-panel på en plan yta. LED-panelen tjänar två syften: (1) att ge en enhetlig vit bakgrund och (2) som ska användas som en justerbar ljuskälla för att erhålla lämplig kontrast. Placera en 100 mm Petriskålarena på LED-panelen.OBS: För att öka genomströmningen kan en fler-brunnsplatta användas som en arena23,24, men större arenor underlättar a…

Representative Results

Extraocular near-UV-uppfattning i S. medelhavet planarians är TRPA1-beroende och har föreslagits att kopplas till H2O2 release17. Eftersom H2O2 exponering inducerar TRPA1-beroende scrunching i S. mediterranea och D. japonica planarians28, stegen i avsnitt 2.1.4 kan användas för att testa om nära UV-ljus exponering inducerar scrunching i båda arterna. Medan D. japonica planarians scrunch (1…

Discussion

Med hjälp av detta protokoll kan man kvantitativt studera effekterna av fysiska och kemiska stimuli7,28,29 ellergenetisk manipulation (RNAi)28,29 på planarisk förflyttning. För att maximera rumslig upplösning är det bäst att flytta kameran så nära arenan som möjligt och samtidigt säkerställa att hela arenan är i synfältet. För att öka dataflödet kan bete…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar Mr Tapan Goel för kommentarer om manuskriptet. Detta arbete finansierades av NSF CAREER Grant 1555109.

Materials

Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) Sigma-Aldrich 377430-5G CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4  Tamron 23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated Genesee Scientific  25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile MedSupply Partners 62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95% Sigma-Aldrich W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box Amazon B07HD631RP
Flea3 USB3 camera FLIR FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves Fisher Scientific 11-394-298
Hot plate Fisher Scientific HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water Instant Ocean SS15-10 Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water Sigma-Aldrich various Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene Simport D210-7
Pipette, 20-200 μL range Rainin 17008652
PYREX 150 mL beaker Sigma-Aldrich CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm VWR 55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber Rosco R21 Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red Rosco R27
Roscolux color filter:  Storaro Red Rosco R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture Thermo Fisher 691TS
Support stand  Fisher Scientific 12-947-976
Thermometer VWR 89095-600
UV laser pointer Amazon B082DGS86R This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.

References

  1. Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
  2. Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
  3. Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
  4. Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
  5. Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
  6. Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
  7. Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
  8. Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
  9. Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
  10. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
  11. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
  12. Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
  13. Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
  14. Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
  15. Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
  16. Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
  17. Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
  18. Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
  19. Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
  20. Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
  21. Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
  22. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
  23. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
  24. Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
  25. Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
  26. Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
  27. Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
  28. Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
  29. Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
  30. Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  32. Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
  33. Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
  34. Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
  35. Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
  36. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
  37. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).

Play Video

Cite This Article
Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).

View Video