Sötvatten planarianer uppvisar tre gångarter (glidning, peristaltik, och scrunching) som är urskiljbara genom kvantitativ beteendeanalys. Vi beskriver en metod för att inducera scrunching med hjälp av olika skadliga stimuli, kvantifiering därav och åtskillnad från peristaltik och glidflygning. Med hjälp av gen knockdown, visar vi specificiteten av scrunching som en kvantitativ fenotypisk avläsning.
Sötvattenplanarianer glider normalt smidigt genom ciliär framdrivning på deras ventrala sida. Vissa miljöförhållanden kan dock framkalla muskulatur-driven former av förflyttning: peristaltik eller scrunching. Medan peristaltiken resultat från en ciliary defekt, scrunching är oberoende av cilier funktion och är ett specifikt svar på vissa stimuli, inklusive amputation, skadliga temperatur, extrema pH och etanol. Således är dessa två muskulatur-driven gångarter mekanistiskt distinkta. De kan dock vara svåra att urskilja kvalitativt. Här ger vi ett protokoll för att förmå scrunching med hjälp av olika fysiska och kemiska stimuli. Vi detalj den kvantitativa karakterisering av scrunching, som kan användas för att skilja den från peristaltik och glidning, med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Eftersom scrunching är en universell planarisk gång, om än med karakteristiska artspecifika skillnader, kan detta protokoll i stort sett tillämpas på alla arter av planarianer, när man använder lämpliga överväganden. För att visa detta jämför vi svaret från de två mest populära plana arter som används i beteendeforskning, Dugesia japonica och Schmidtea mediterranea, till samma uppsättning fysiska och kemiska stimuli. Dessutom tillåter specificiteten av scrunching detta protokoll som ska användas tillsammans med RNA-interferens och/eller farmakologisk exponering för dissekera de molekylära mål och neuronala kretsar inblandade, potentiellt ger mekanistisk inblick i viktiga aspekter av nociception och neuromuskulär kommunikation.
Förutom deras popularitet för stamceller och regenerering forskning1,2,,3, sötvatten planarianer har länge använts i beteendestudier4,5, dra nytta av deras jämförelsevis stora storlek (några millimeter i längd), lätthet och låg kostnad för laboratoriet underhåll, och brett spektrum av observerbara beteenden. Införandet av datorseende och automatiserad spårning till planarisk beteende studier6,7,8,9,10,11 har möjliggjort kvantitativ differentiering av beteendemässiga fenotyper. Djurbeteende är en direkt avläsning av neuronal funktion. Eftersom det planiska nervsystemet är av medelstorlek och komplexitet, men aktier bevarade viktiga element med ryggradsdjur hjärnan12,13,14, studera planarisk beteende kan ge insikt i bevarade mekanismer för neuronala åtgärder som kan vara svårt att direkt sond i mer komplexa organismer. Således är planarianer en värdefull modell för jämförande neurobiologistudier 8,12,15,16,17,18,19,20,21. Dessutom tillåter vattenmiljön för snabb och facile exponering för kemikalier för att studera deras effekt på hjärnans funktion i regenererande och vuxna planarianer, vilket gör dem till ett populärt system för neurotoxikologi22,23,24,25,26.
Planarianer besitter tre distinkta gångarter, som kallas glidflygning, peristaltik och scrunching. Varje gång är utställd under särskilda omständigheter: glidning är standardgång, peristaltik inträffar när ciliär funktion äventyras7,27, och scrunching är en flykt gång – oberoende av cilier funktion – som svar på vissa skadliga stimuli7. Vi har visat att scrunching är ett specifikt svar, framkallas av känslan av vissa kemiska eller fysiska ledtrådar, inklusive extrema temperaturer eller pH, mekanisk skada, eller specifika kemiska inducerare, och därmed inte är en allmän stressrespons7,28,29.
På grund av dess specificitet och stereotypa parametrar, som lätt kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll, scrunching är en kraftfull beteendemässiga fenotyp som gör det möjligt för forskare att utföra mekanistiska studier dissekera sensoriska vägar och neuronal kontroll av beteende25,28. Dessutom har scrunching visat sig vara en känslig endpoint för att analys skadliga kemiska effekter på nervsystemets utveckling och funktion i neurotoxikologistudier 22,24,25,30. Som flera olika sensoriska vägar verkar konvergera för att framkalla scrunchinggenom olika mekanismer 28, scrunching skiljer sig från andra planarian beteenden eftersom olika, men specifika, stimuli kan användas för att dissekera distinkta neuronala kretsar och studera hur olika signaler är integrerade för att producera scrunching fenotyp.
Viktigt, arter skillnader finns, där en kemikalie kan framkalla scrunching i en planarian art, men en annan beteendemässiga svar i en annan. Till exempel har vi funnit att anandamid inducerar scrunching i den plana arter Dugesia japonica men inducerar peristalsis i Schmidtea medelhavet28. Detta exempel belyser vikten av att kunna på ett tillförlitligt sätt skilja mellan de olika gångarter, eftersom de är de fenotypiska manifestationer av distinkta molekylära mekanismer. Men är åtskillnad av scrunching från peristaltiken svårt att använda kvalitativa observationsdata, eftersom båda gångarter är muskulatur-driven och dela kvalitativa likheter7,28. Således, för att skilja de gångarter är det nödvändigt att utföra cilier bildbehandling eller en kvantitativ beteendestudie, som möjliggör åtskillnad baserad på karakteristiska parametrar7,28. Eftersom cilia imaging är experimentellt utmanande och kräver specialiserad utrustning såsom en hög förstoring förening mikroskop och en höghastighetskamera7,28, det är inte så brett tillgänglig för forskare som kvantitativbeteendeanalys.
Här presenterar vi ett protokoll för (1) induktion av scrunching med hjälp av olika fysiska (skadliga temperatur, amputation, nära UV-ljus) och kemiska (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyd) stimuli och (2) den kvantitativa analysen av planarisk beteende med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Genom att kvantifiera fyra parametrar (frekvens av kroppslängd svängningar, relativ hastighet, maximal amplitud, och asymmetri av kroppen töjning och kontraktion)7, scrunching kan skiljas från glidning, peristaltik, och andra beteendemässiga tillstånd rapporteras i litteraturen, såsom orm-liknande locomotion15 ores15. Vidare, medan scrunching bevaras bland olika plana art7, har varje art sin egen karakteristiska frekvens och hastighet; därför, när glid- och scrunchinghastigheterna för en art har fastställts, kan hastigheten ensam användas som ett medel för att skilja scrunching från glidning och peristaltik29. Protokollet förutsätter ingen föregående utbildning i beräkningsbildanalys eller beteendestudier och kan därmed också tillämpas för planatiska beteendeexperiment i ett undervisningslaboratoriekontext på grundnivå. Exempel data för att underlätta protokoll anpassning tillhandahålls i det kompletterande materialet.
Med hjälp av detta protokoll kan man kvantitativt studera effekterna av fysiska och kemiska stimuli7,28,29 ellergenetisk manipulation (RNAi)28,29 på planarisk förflyttning. För att maximera rumslig upplösning är det bäst att flytta kameran så nära arenan som möjligt och samtidigt säkerställa att hela arenan är i synfältet. För att öka dataflödet kan bete…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Mr Tapan Goel för kommentarer om manuskriptet. Detta arbete finansierades av NSF CAREER Grant 1555109.
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
Thermometer | VWR | 89095-600 | |
UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |