Summary
Zoetwaterplanariërs vertonen drie gangen (glijden, peristaltiek en scrunching) die te onderscheiden zijn door kwantitatieve gedragsanalyse. We beschrijven een methode om scrunching te induceren met behulp van verschillende schadelijke stimuli, kwantificering daarvan, en onderscheid van peristaltiek en glijden. Met behulp van gen knockdown, tonen we de specificiteit van scrunching als een kwantitatieve fenotypische uitlezing.
Abstract
Zoetwaterplanarianen glijden normaal gesproken soepel door ciliary voortstuwing aan hun ventrale kant. Bepaalde omgevingsomstandigheden kunnen echter spiergestuurde vormen van beweging veroorzaken: peristaltiek of scrunching. Terwijl peristalse het gevolg is van een ciliary defect, scrunching is onafhankelijk van cilia functie en is een specifieke reactie op bepaalde stimuli, met inbegrip van amputatie, schadelijke temperatuur, extreme pH, en ethanol. Dus, deze twee spieren-gedreven gangen zijn mechanistisch verschillend. Ze kunnen echter moeilijk kwalitatief te onderscheiden zijn. Hier bieden we een protocol voor het induceren van scrunching met behulp van verschillende fysieke en chemische stimuli. We beschrijven de kwantitatieve karakterisering van scrunching, die kan worden gebruikt om het te onderscheiden van peristaltiek en glijden, met behulp van vrij beschikbare software. Aangezien scrunching een universele planaire gang is, zij het met kenmerkende soortenspecifieke verschillen, kan dit protocol in grote lijnen worden toegepast op alle soorten planarianen, wanneer u passende overwegingen gebruikt. Om dit aan te tonen, vergelijken we de reactie van de twee meest populaire planaire soorten die worden gebruikt in gedragsonderzoek, Dugesia japonica en Schmidtea mediterranea, met dezelfde set van fysieke en chemische stimuli. Bovendien maakt de specificiteit van scrunching het mogelijk om dit protocol te gebruiken in combinatie met RNA-interferentie en/of farmacologische blootstelling om de betrokken moleculaire doelen en neuronale circuits te ontleden, waardoor mogelijk mechanistisch inzicht kan worden verschaft in belangrijke aspecten van nociception en neuromusculaire communicatie.
Introduction
Naast hun populariteit voor stamcel- en regeneratieonderzoek1,2,,3, zoetwaterplanarianen zijn al lang gebruikt in gedragsstudies4,5, profiterend van hun relatief grote omvang (een paar millimeter in lengte), gemak en lage kosten van laboratoriumonderhoud, en breed spectrum van waarneembaar gedrag. De introductie van computer visie en geautomatiseerde tracking om planaire gedragsstudies6,7,8,9,10,11 hebben kwantitatieve differentiatie van gedragsfenotypen mogelijk gemaakt. Dierlijk gedrag is een directe uitlezing van de neuronale functie. Omdat het vaatstelsel van gemiddelde grootte en complexiteit is, maar geconserveerde sleutelelementen deelt met het gewervelde brein12,13,14,kan het bestuderen van planarian gedrag inzicht geven in geconserveerde mechanismen van neuronale werking die moeilijk direct kunnen worden onderzocht in complexere organismen. Planarianen zijn dus een waardevol model voor vergelijkende neurobiologiestudies8,12,15,16,17,18,19,20,21. Bovendien zorgt het aquatisch milieu voor snelle en facile blootstelling aan chemische stoffen om hun effect op de hersenfunctie te bestuderen bij het regenereren en volwassen planarianen, waardoor ze een populair systeem voor neurotoxicologie22,23,24,25,26.
Planarianen bezitten drie verschillende gangen, aangeduid als zweefvliegen, peristaltiek, en scrunching. Elke gang wordt tentoongesteld onder specifieke omstandigheden: glijden is de standaard gang, peristaltiek treedt op wanneer ciliary functie wordt aangetast7,27, en scrunching is een ontsnapping gang - onafhankelijk van trilharen functie - in reactie op bepaalde schadelijke stimuli7. We hebben aangetoond dat scrunching een specifieke reactie is, opgewekt door het gevoel van bepaalde chemische of fysieke signalen, waaronder extreme temperaturen of pH, mechanisch letsel of specifieke chemische inductoren, en dus geen algemene stressrespons is7,28,29.
Vanwege de specificiteit en stereotiepe parameters, die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van dit protocol, scrunching is een krachtige gedragsfenotype dat onderzoekers in staat stelt om mechanistische studies ontleden zintuiglijke trajecten en neuronale controle van gedrag25,28uit te voeren. Bovendien is aangetoond dat scrunching een gevoelig eindpunt is om nadelige chemische effecten op de ontwikkeling van het zenuwstelsel en de functie in neurotoxicologiestudies 22,,24,25,30te testen .24 Zoals verschillende zintuiglijke paden lijken te convergeren om scrunching induceren door middel van verschillende mechanismen28, scrunching verschilt van andere planarian gedrag, omdat verschillende, maar specifieke, stimuli kunnen worden gebruikt om aparte neuronale circuits ontleden en bestuderen hoe verschillende signalen zijn geïntegreerd om de singcrunch fenotype te produceren.
Belangrijk is dat er soortenverschillen bestaan, waarbij de ene chemische stof scrunching kan uitlokken bij de ene planaire soort, maar een andere gedragsreactie in een andere. We hebben bijvoorbeeld ontdekt dat anandamide scrunching induceert bij de planaire soorten Dugesia japonica, maar peristaltiek induceert in Schmidtea mediterranea28. Dit voorbeeld benadrukt het belang van het betrouwbaar kunnen onderscheiden van de verschillende gangen, omdat ze de fenotypische manifestaties zijn van verschillende moleculaire mechanismen. Het onderscheid tussen scrunching en peristaltiek is echter moeilijk met behulp van kwalitatieve observationele gegevens, omdat beide gangen op spierstelsels zijn gericht en kwalitatieve gelijkenissen hebben7,28. Om de gangen te onderscheiden is het dus noodzakelijk om cilia imaging of een kwantitatieve gedragsstudie uit te voeren, die onderscheid mogelijk maakt op basis van karakteristieke parameters7,28. Omdat cilia imaging is experimenteel uitdagend en vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals een high-vergroting samengestelde microscoop en een high-speed camera7,28, het is niet zo breed toegankelijk voor onderzoekers als kwantitatieve gedragsanalyse.
Hier presenteren we een protocol voor (1) de inductie van scrunching met behulp van verschillende fysieke (schadelijke temperatuur, amputatie, bijna-UV-licht) en chemische (allyl isothiocyanaat (AITC), cinnamaldehyde) stimuli en (2) de kwantitatieve analyse van planair gedrag met behulp van vrij beschikbare software. Door vier parameters te kwantificeren (frequentie van lichaamslengteschommelingen, relatieve snelheid, maximale amplitude en asymmetrie van lichaamsverlenging en samentrekking)7, kan scrunching worden onderscheiden van zweefvliegen, peristaltiek en andere gedragstoestanden die in de literatuur worden gemeld, zoals slangachtige voortbeweging15 of epilepsies15. Bovendien, terwijl scrunching wordt bewaard onder verschillende planaire soorten7, elke soort heeft zijn eigen karakteristieke frequentie en snelheid; daarom, zodra de glijdende en knarsende snelheden van een soort zijn bepaald, kan de snelheid alleen worden gebruikt als een middel om scrunching van glijden en peristaltiek29te onderscheiden. Het protocol gaat uit van een voorafgaande opleiding in computationele beeldanalyse of gedragsstudies en kan dus ook worden toegepast voor planaire gedragsexperimenten in een onderwijslaboratoriumcontext op bachelorniveau. Voorbeeldgegevens om protocolaanpassing te vergemakkelijken worden verstrekt in het supplementaire materiaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kwantitatieve planaire gedragstesten
- Experimentele installatie
- Plaats een dimbaar LED-paneel op een vlak oppervlak. Het LED-paneel dient twee doeleinden: (1) om een uniforme witte achtergrond te bieden en (2) om te worden gebruikt als een verstelbare lichtbron om het juiste contrast te verkrijgen. Plaats een petrischaalarena van 100 mm op het LED-paneel.
OPMERKING: Om de doorvoer te verhogen, kan een multi-well plaat worden gebruikt als een arena23,24, maar grotere arena's vergemakkelijken geautomatiseerde beeldanalyse. - Monteer een camera op een ringstandaard boven de arena(figuur 1A). Pas de camerapositie, hoogte en scherpstelling zo nodig aan, zodat de hele arena gecentreerd is binnen het gezichtsveld en scherp is(figuur 1B).
OPMERKING: De cameraresolutie moet hoog genoeg zijn om een planarian duidelijk te onderscheiden van de homogene achtergrond van het LED-paneel. - Vul de arena met de juiste exposure media (planarian water of chemische oplossing) tot half-maximum volume (dit zal worden aangeduid als een bad). Dit komt overeen met ongeveer 25 mL voor een petrischaaltje van 100 mm. Schakel het LED-paneel in en schakel alle andere lichtbronnen uit die de opnamekwaliteit negatief kunnen beïnvloeden (d.w.z. lichtbronnen in de buurt die een schittering op de arena produceren).
LET OP: Beheer gevaarlijke chemische oplossingen op de juiste manier door het dragen van volledige persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) en het verplaatsen van de experimentele setup naar een rookkap indien nodig. Volg de federale en staatsvoorschriften inzake afvalverwerking. - Laat een planarian naar het midden van de arena met behulp van een transfer pipet. Begin met opnemen. Gegevens opnemen als beeldsequenties in een native Fiji31-indeling (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM of FITS; zie afbeeldingsanalysesectie 1.2).
OPMERKING: Omdat gedrag en gevoeligheid voor externe stimuli verschillen tussen individuele planarianen, is het belangrijk om gegevens te verzamelen over een voldoende groot aantal biologische replica's, naast het uitvoeren van technische replicaties. We hebben gewerkt met maximaal 10 middelgrote (4-7 mm) planarianen in een 100 mm petrischaaltje tegelijk. Terwijl de tijd efficiënt, meerdere planarianen in de Petri schotel in een keer maken data-analyse moeilijker, omdat planarianen kunnen paden kruisen.- Voor zweefexperimenten u opnemen met ten minste 1 frame per seconde (FPS). Voor scrunching / peristaltiek experimenten, opnemen met behulp van een FPS die ten minste twee keer de scrunching / peristaltiek frequentie van de planaire soorten. Als de planaire soort een onbekende scrunching/peristalsis frequentie heeft, gebruik dan 10 FPS als uitgangspunt en verhoging/afname indien van toepassing.
- Bij het gebruik van een chemische oplossing, breng de planarian met behulp van zo weinig mogelijk druppels van planarian water, zodat de concentratie van de chemische oplossing niet significant wordt veranderd.
- Voor zweefexperimenten, record 1-2 minuten van glijden gedrag. Voor scrunching/ peristaltiek experimenten, record lang genoeg om ten minste 3 opeenvolgende oscillaties die zich in een rechte lijn vast te leggen. Nadat het experiment is voltooid, beëindigt u de opname.
OPMERKING: Voor scrunching/peristalsis experimenten, als een planarian niet voldoet aan de beëindiging criterium binnen een bepaalde periode die moet worden consistent over replica's en wordt empirisch bepaald op basis van de stimulus, eindigt de opname en test een andere planarian.- Als de planarian de grens van de arena bereikt zonder te voldoen aan de beëindiging criterium, pipet de planarian terug naar het centrum van de arena.
OPMERKING: Vermijd herhaalde pipetting van een individu voor het opnemen, omdat dit zijn gedrag kan veranderen.
- Als de planarian de grens van de arena bereikt zonder te voldoen aan de beëindiging criterium, pipet de planarian terug naar het centrum van de arena.
- Haal de planarian(s) uit de arena en gooi de planaire water- of chemische oplossing weg in geschikte afvalcontainers. Planarianen die in planarian water waren kunnen aan hun huiscontainer worden teruggegeven.
OPMERKING: Vermijd kruisbesmetting door verschillende arena's te gebruiken voor verschillende media (d.w.z. glijden in planaire waterexperimenten mag niet worden uitgevoerd in een arena die voorheen werd gebruikt voor scrunching/peristaltiek-experimenten met chemische blootstelling).- Seriële spoelplanariërs blootgesteld aan een chemische oplossing in 3 schone 100 mm petrischaaltjes gevuld met 25 mL planarian water om alle chemicaliën grondig te verdunnen. Als scrunching of peristalsis werd veroorzaakt, plaats deze planarianen in een aparte container. Planarianen kunnen worden teruggestuurd naar hun huis container na een maand, omdat de meeste cellen zou zijn omgedraaid tegen die tijd1.
OPMERKING: Als er meerdere verschillende experimenten nodig zijn voor dezelfde populatie van planarianen, bijvoorbeeld voor een RNAi-populatie, laat planarianen zich 24 uur herstellen voordat ze het volgende experiment uitvoeren. Bestel de experimenten zodanig dat het minst invasieve experiment eerste is en het meest invasieve experiment (bijvoorbeeld amputatie) als laatste wordt uitgevoerd. - Als het uitvoeren van meerdere experimenten in dezelfde arena, goed ontdoen van het bad oplossing en verwijder eventuele slijm paden door afvegen van de arena met een papieren handdoek tussen de runs.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Seriële spoelplanariërs blootgesteld aan een chemische oplossing in 3 schone 100 mm petrischaaltjes gevuld met 25 mL planarian water om alle chemicaliën grondig te verdunnen. Als scrunching of peristalsis werd veroorzaakt, plaats deze planarianen in een aparte container. Planarianen kunnen worden teruggestuurd naar hun huis container na een maand, omdat de meeste cellen zou zijn omgedraaid tegen die tijd1.
- Plaats een dimbaar LED-paneel op een vlak oppervlak. Het LED-paneel dient twee doeleinden: (1) om een uniforme witte achtergrond te bieden en (2) om te worden gebruikt als een verstelbare lichtbron om het juiste contrast te verkrijgen. Plaats een petrischaalarena van 100 mm op het LED-paneel.
- Kwantitatieve analyse van planariërlijk gedrag
- Uitvoeren van planaire gedrag testen zoals beschreven in punt 1.1.
- Open de raw-afbeeldingsreeks voor een experiment in Fiji(Bestand > Importeren > Afbeeldingsreeks)en selecteer de eerste afbeelding in de afbeeldingsreeks. Schakel in het venster Volgordeopties het selectievakje 'Namen numeriek sorteren' in en klik op 'OK'. Zodra de afbeeldingsreeks is geladen, converteert u de afbeeldingsreeks naar 8-bits(Afbeelding > Tekst > 8-bits)en gebruikt u het pijlgereedschap of de schuifregelaar onder aan de afbeeldingsstapel om de afbeeldingsreeks te bekijken of door te pannen.
OPMERKING: Voor zweefexperimenten kunnen alle gegevens worden gebruikt zolang de planarian duidelijk zichtbaar is tijdens de opname. Het is echter meestal voldoende om de vrije beweging in het midden van de arena te analyseren door het relevante deel(en) te extraheren zoals hieronder beschreven. - Om een periode en regio van belang te extraheren, trekt u een interessegebied dat het volledige pad van een planarian omvat met behulp van het rechthoeksgereedschap(figuur 2A, 2B). Klik met de rechtermuisknop op de afbeeldingsstapel en selecteer Dupliceren...,schakel het selectievakje voor Stapel duplicerenin, voer de eerste en laatste frames van de reeks van belang in en klik op OK. Als meerdere planarianen werden gelijktijdig afgebeeld, herhaal deze regio selectie en duplicatie stap voor elke planarian in de arena, zodat er zo veel open beeld stapels als er planarians in de arena. De volgende stappen (stap 1.2.4-1.2.10) moeten één voor één op elke afbeeldingsstapel worden uitgevoerd.
- Voor zweefproeven, extract een periode van glijden waar de planarian beweegt ten minste twee keer zijn lichaamslengte.
OPMERKING: Hoe meer glijdende gegevens per planarian worden geëxtraheerd, hoe betrouwbaarder de gegevens zullen zijn. De planarian hoeft niet te bewegen in een rechte lijn voor de zweefvliegen analyse. - Voor scrunching/peristalsis experimenten, extract een instantie wanneer de planarian ondergaat een minimum van drie opeenvolgende (idealiter meer) lichaam oscillaties in een rechte lijn, ervoor te zorgen dat elke oscillatie is een volledige verlenging-contractie cyclus, als volledige oscillaties zijn nodig om nauwkeurig te bepalen van de frequentie.
OPMERKING: Hoe meer schommelingen die kunnen worden geëxtraheerd, hoe betrouwbaarder de gegevens zullen zijn. Gebruik geen sequenties waar de planarian draait als deze zal resulteren in onjuiste lengte metingen.
- Voor zweefproeven, extract een periode van glijden waar de planarian beweegt ten minste twee keer zijn lichaamslengte.
- Pas een drempelwaarde toe op de gedupliceerde afbeeldingsstapel(Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaarde)om de afbeelding te binariseren en de planarian uit de achtergrond te halen. Pas de schuifbalken zo nodig aan, zodat de gehele vediërs rood worden gemarkeerd. De exacte waarden zijn afhankelijk van de beeldkwaliteit. Laat de vakken voor donkere achtergrond, Stack histogram, en Niet opnieuw bereik ongecontroleerd. Blader door de afbeeldingsstapel om een goed drempelbereik te garanderen (d.w.z. de planarian is goed gescheiden van de achtergrond in de hele stapel) en klik vervolgens op Toepassen.
- Stel in het venster Stapel converteren naar binair de methode in op Standaard en de achtergrond op licht. Schakel alle vakjes in dit venster uit en klik op OK. Een binarized beeld dat een zwarte planarian op een witte achtergrond toont zal verschijnen(Cijfer 2C). Zorg ervoor dat de hele planarian zichtbaar is in alle frames van de beeldreeks.
OPMERKING: Ongewenste objecten in de binarized beeldreeks die kleiner of groter zijn dan de planarianen, kunnen in de daaropvolgende analyse worden gefilterd met behulp van een groottefilter(figuur 2Ciii). - Stel metingen in door te klikken op Analyseren > Metingen instellen. Schakel de selectievakjes in voor Gebied, Massacentrum, Stapelpositieen Ellips passen en klik op OK.
OPMERKING: Deze parameters hoeven slechts één keer per Fiji-sessie te worden ingesteld. - Selecteer de open afbeeldingsstack en selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren.
- Selecteer in het venster Deeltjes analyseren de optie Weergeven > Maskers om een nieuwe stapel te openen met alle objecten die zijn gedetecteerd met de gekozen parameters. Dit kan worden gebruikt om visueel te controleren of alleen metingen van de planarian worden uitgevoerd. Bij deze stap kan een filter van grootte worden ingesteld om ongewenste ruis te verwijderen door het geschatte gebied van de planarian (in pixel2-eenheden) in de aanwezige ruimte in te voeren. Schakel de selectievakjes in voor Weergaveresultaten en Resultaten wissen en klik op OK.
OPMERKING: Als de index (eerste kolom) in het venster Resultaten niet gelijk is aan het segmentnummer voor alle rijen, betekent dit dat er te veel of te weinig objecten zijn bijgehouden. Een mogelijkheid voor deze discrepantie is de aanwezigheid van andere objecten naast de planarian of dat de planarian niet werd gevolgd in specifieke frames. - Blader door de stapel maskerafbeelding met de schuifregelaar onder aan het deelvenster. Als er ruis is of als er frames zijn die geen planarian hebben, sluit u het venster Resultaten en de stapel van de maskerafbeelding. Herhaal stap 1.2.7-1.2.8 door het gebiedsfilter aan te passen om alleen andere objecten dan de planarian te verwijderen.
OPMERKING: Als de planarian ontbreekt in het frame in het masker, suggereert dit dat de ondergrens van het gebiedsfilter te hoog is ingesteld. - Sla in het venster Resultaten de gegevens op met Bestand>Opslaan als. Voeg de CSV-extensie toe aan de bestandsnaam om gegevens op te slaan als waarden die door komma's zijn gescheiden. Zodra gegevens voor de afbeeldingsstack zijn opgeslagen, sluit u de respectievelijke afbeeldingsstapel en de vensters Resultaten en Masker.
- Importeer gegevens en analyseer verder met behulp van spreadsheetsoftware of freeware. Raadpleeg punt 1.3 om de zweefsnelheid te berekenen. Raadpleeg sectie 1.4 voor het berekenen van de volledige parameterset scrunching/peristalsis.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. - Als u de pixel wilt bepalen tot conversie met de werkelijke lengte, opent u een afbeelding in Fiji met een referentielengte (bijvoorbeeld de diameter van de arena). Selecteer het lijngereedschap en teken een lijn over de bekende lengte.
- Pixeleenheden converteren naar een standaardeenheid met lengte door op Analyseren > Schaal instellen te klikken. Voer de lengte in die overeenkomt met de lijn die op de afbeelding is getekend in het vak Bekende afstand en wijzig de lengte-eenheid van pixel naar de gekozen standaardeenheid met lengte. De conversiefactor wordt naast Schaalgeschreven.
OPMERKING: Een pixelconversiewaarde is niet vereist voor zweefvliegen of scrunching/peristalsis-analyses in de secties 1.3 en 1.4.
- Berekening van de zweefsnelheid
- Met behulp van het gegevensbestand dat is opgeslagen in sectie 1.2, laadt u het centrum van massa (COM) x- en y-coördinaten en de belangrijkste asgegevens. Als de gegevens worden opgeslagen als een door komma's gescheiden waardenbestand, komen deze lijsten overeen met respectievelijk de kolommen 'XM', 'YM' en 'Major'.
- Bereken de verplaatsing (d) van het planaire massacentrum in pixels voor elk frame ten opzichte van het volgende frame met behulp van de gegevenskolommen "XM" en "YM". Verplaatsing d) wordt gegeven door:
waarbij x1 en y1 verwijzen naar de COM-coördinaten (XM, YM) van één frame en x2 en y2 verwijzen naar de COM-coördinaten (XM, YM) van het volgende frame. - Stel de planaire lichaamslengte inth als het 95e percentiel van de "Major" kolom. Aangezien de planarianen een gedrag van de muurvoorkeur32tentoonstellen , zorgt dit ervoor dat de berekende planarian lichaamslengte representatief is van wanneer de planarian langwerpig24is .
- Normaliseer verplaatsing door planaire lichaamslengte door de pixelverplaatsingen per frame te delen door de planaire lichaamslengte (l). Genormaliseerde verplaatsing (dn) wordt gegeven door:
- Genereer een lijst met genormaliseerde snelheden door de genormaliseerde verplaatsingen te delen door de tijd die per frame is verstreken (omgekeerd van de geregistreerde FPS). Genormaliseerde zweefsnelheid (sn) wordt gegeven door:
- Bereken de genormaliseerde zweefsnelheid van de planarian door het gemiddelde van de lijst met genormaliseerde snelheden (n)nte nemen . De standaarddeviatie kan worden gebruikt als een onzekerheidsmeting voor de planarian.
- Herhaal stap 1.3.1-1.3.6 voor elke planarian te analyseren. Gemiddeld en neem de standaarddeviatie van de glijdende snelheden voor alle planarianen om de glijdende snelheid en bijbehorende onzekerheid, respectievelijk, voor een planarianbevolking te krijgen.
- Onderscheid van scrunching en peristalsis gangen met behulp van de volledige parameter set
- Laad de lijst met belangrijke asgegevens uit het gegevensbestand dat is opgeslagen in sectie 1.2. Als de gegevens worden opgeslagen als een door komma's gescheiden waardenbestand, komt dit overeen met de kolom Major.
- Maak een lijst met elk gegevenspunt in de kolom Major, te beginnen met 0. Converteer deze lijst naar de verstreken tijd per frame door te delen door de opgenomen FPS.
- Plot de belangrijke kolom gegevens met betrekking tot de verstreken tijd om een scrunching / peristalsis oscillatie plot te genereren (Figuur 3A). Met behulp van de oscillatieplot, trim de gegevens tot ten minste drie opeenvolgende, rechte lijn oscillaties (figuur 3Bi). Trim de gegevens om te beginnen en te eindigen op lokale pieken (maximale verlenging van oscillatie) of troggen (minimale verlenging van oscillatie).
OPMERKING: Als lokale extrema niet ongeveer gelijk zijn (pieken/dalen verschillen dramatisch in hoogtes), suggereert dit dat de trillingen niet rechtlijnig zijn(figuur 3Bii). Haal een andere reeks van ten minste drie opeenvolgende, rechte lijnschommelingen. Zie punt 1.2. - Bevestig dat de oscillatievolgorde van de rente is geëxtraheerd en bijgesneden goed door replotting de bijgesneden Belangrijke gegevens met betrekking tot de tijd. Gebruik deze lijst met bijgesneden gegevens voor alle volgende berekeningen.
- Als u de oscillatiefrequentie (νm)wilt berekenen, deelt u het aantal schommelingen (On) door het totale aantal gegevenspunten in de bijgesneden lijst met hoofdasgegevens (N). Vermenigvuldig FPS met deze waarde om frequentie te krijgen in trillingen per seconde.
- Maximale rek berekenen (|Δε| max), trek de absolute minimale lichaamslengte (lmin) af van de absolute maximale lichaamslengte (lmax). Normaliseer tot langwerpige lichaamslengte door te delen door de absolute maximale lichaamslengte.
- Als u de snelheid per lichaamslengte(v* m)mwilt berekenen, vermenigvuldigt u de berekende maximale rek met de oscillatiefrequentie.
OPMERKING: Snelheid alleen kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen scrunching en peristaltiek gangen7. - Voor het berekenen van de fractie van de tijd besteed langwerpige (flong), neem de afgeleide van de bijgesneden grote as gegevenslijst met betrekking tot de tijd. Verdeel het aantal positieve gegevenspunten (d.w.z. wanneer het derivaat >0 (np)is, door het totale aantal gegevenspunten in de belangrijkste asgegevenslijst(nt)).
OPMERKING: Scrunching planarians vertonen een asymmetrische fractie van de tijd besteed aan het verlengen, terwijl planarianen uitvoeren peristaltiek besteden evenveel tijd lang langwerpig en aanbestedende7. - Herhaal stap 1.4.1-1.4.8 voor elke planarian te analyseren. Bereken een planaire bevolkingsparameter die is ingesteld door de gemiddelde en standaarddeviatie van elke parameter te nemen.
OPMERKING: De parameterset kan worden gebruikt om te bepalen of het oscillatiegedrag scrunching, peristalsis of een andere vorm van bewegingsvrijheid is met periodieke veranderingen in de lichaamsvorm. Zowel scrunching als peristalsis hebben vaste parameters voor een bepaalde soort7, waarbij scrunching parameters over het algemeen groter zijn dan peristaltiekparameters7. Hoewel het mogelijk is dat een van de parameters buiten het soortspecifieke bereik kan vallen, zoals we eerder hebben waargenomen bij chemische inductie28,moet het waargenomen gedrag overeenkomen met ten minste 3 van de 4 gepubliceerde parameters die moeten worden gecategoriseerd als peristaltiek of scrunching.
2. Scrunching inductie
- Fysieke stimuli (schadelijke temperatuur, UV-licht, amputatie)
- Voor alle experimenten met fysieke stimuli verwijzen we naar sectie 1.1 voor de experimentele opstelling.
OPMERKING: Het is het beste om een grote arena te gebruiken, zoals een 100 mm petrischaal, voor fysieke stimuli experimenten om meer open ruimte te bieden voor het manoeuvreren van een pipet en/ of scheermesje. - Om scrunching via schadelijke temperatuur te veroorzaken, wordt hitteplanariair water in een glazen beker (ten minste 100 μL per te testen planarian) tot 65 °C op een hete plaat.
- Plaats een planarian in het midden van de arena. Wacht tot de planaire oriënteert zich rechtop en begint te glijden. Begin met opnemen.
- Met behulp van een P-200 pipet, langzaam pipette 100 μL van de 65 °C planarian water post-faryngeally op de staart van de planarian om scrunching te induceren.
LET OP: Zorg ervoor dat het verwarmde vediliaanse water op 65°C blijft. Verwarm het water indien nodig op tot 65°C voordat u met een ander experiment begint. Aangezien druk ook kan leiden tot scrunching, is langzame pipetting noodzakelijk. Pipetten kamertemperatuur water op dezelfde manier als in het experiment kan dienen als een controle en praktijk optie. - Stop de opname zodra scrunching is gestopt. Plaats de planarian in een herstel container en de media uit te wisselen in de petrischaal met verse, kamertemperatuur planarian water als het uitvoeren van meer experimenten.
- Om scrunching via amputatie te induceren, breng een planarian naar het centrum van de arena en wacht tot de planaire oriënteert zich rechtop en begint glijden. Begin met opnemen.
- Amput de planarian met een schoon scheermesje. Amputaties kunnen overal worden gedaan langs de planarian, zolang de cut locatie is consistent over experimenten.
OPMERKING: Scrunching parameters worden geëxtraheerd uit het voorste stuk. Vermijd dus het zicht van de camera op dit deel van de planarianen bij het aanbrengen van de snede door vanaf het achterste uiteinde te naderen. Plastic afdekslipjes werken ook goed voor het snijden en zijn een veiligere optie, vooral in een onderwijsomgeving. - Stop de opname zodra het voorste stuk is gestopt met scrunching. Verwijder beide stukken, plaats ze in een aparte container en laat ze 7 dagen regenereren. Geamputeerde planarianen kunnen opnieuw worden opgenomen in de thuiscontainer zodra ze geregenereerd zijn.
- Amput de planarian met een schoon scheermesje. Amputaties kunnen overal worden gedaan langs de planarian, zolang de cut locatie is consistent over experimenten.
- Om scrunching te induceren met behulp van bijna-UV-licht, bevestig de juiste filters (bijvoorbeeld Roscolux filters) aan de cameralens om de hoeveelheid gereflecteerd near-UV-licht dat wordt verzameld door de camera te verminderen en kan interfereren met de beeldvorming van de planarian de reactie. In plaats van het LED-paneel te gebruiken om de arena van onderaf te verlichten, gebruik je omgevingsrode verlichting waarvoor planarianen ongevoelig zijn33.
- Vul een 100 mm petrischaalarena met planarian water en plaats een enkele planarian (5-9 mm) in het midden van de arena. Begin met opnemen op 10 FPS.
- Houd een UV-laseraanwijzer van klasse II (405 ± 10 nm, uitgangsvermogen <5 mW) ongeveer 30 cm van de arena. Plaats de laseraanwijzer in een hoek van 45° van de glijdende vlier en laat de laseraanwijzer vervolgens 5-10 seconden halverwege schijnen tussen het achterste uiteinde van de keelholte en de staartpunt om scrunching te veroorzaken.
OPMERKING: De kracht van de laseraanwijzer kan worden gemeten met behulp van een bijna UV-gevoelige vermogensmeter. - Wacht tot de planarian weer begint te glijden voordat u nog twee stimulaties van hetzelfde individu probeert te testen op reproduceerbaarheid van de reactie. Als de planarian hetzelfde gedrag blijft vertonen, stop dan met opnemen en stop de planarian terug in zijn container. Als het gedrag verandert tussen stimulaties, zullen aanvullende tests aantonen welke respons het meest prominent is.
OPMERKING: Planarianen kunnen worden ongevoelig voor bijna-UV-licht en zal stoppen met reageren. Opeenvolgende stimulaties vereisen een rusttijd van 8-10 seconden.
- Voor alle experimenten met fysieke stimuli verwijzen we naar sectie 1.1 voor de experimentele opstelling.
- Chemische stimulus (AITC)
- Om scrunching te induceren met behulp van een chemische stof, bijvoorbeeld, de TRPA1 agonist AITC28, worden planarianen idealiter ondergedompeld in een bad van de chemische stof. Indien nodig kan pipetting worden toegepast zoals beschreven in punt 2.1.2.3.
LET OP: AITC is ontvlambaar, acuut giftig, kan huid- en oogirritatie, ademhalings- en huidsensibilisatie veroorzaken en is gevaarlijk voor het waterleven. AITC olie moet worden behandeld in een rookkap. Voordat u voorraadoplossingen van AITC maakt, moet u passende PBM's (nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas) aantrekken en passende afvalcontainers voor vloeibaar en vloeibaar gevaarlijk afval opzetten. - Maak in een rookkap een 10 mM voorraadoplossing van AITC in planarian water in een 50 mL centrifugebuis. Deze voorraadoplossing is tot een maand bruikbaar wanneer deze bij 4°C wordt opgeslagen.
- Bereid uit deze voorraad een 25 mL werkoplossing van 100 μM AITC in planarian water in een 50 mL centrifuge buis. Deze 100 μM AITC oplossing zal worden gebruikt om scrunching in planarianen te induceren.
OPMERKING: 100 μM AITC induceert consistente scrunching in D. japonica en S. mediterranea planarians28. Voor andere aquatische planariërs kan 100 μM dienen als startconcentratie en kan dienovereenkomstig worden aangepast. - De experimentele opstelling instellen (zie punt 1.1). Vul de arena met de AITC werkoplossing en plaats deze in een secundaire container. De secundaire container moet ten minste twee keer het volume van de arena bevatten.
LET OP: Experimenten kunnen worden uitgevoerd in een rookkap voor extra veiligheid. - Breng maximaal 10 planarianen naar het midden van de arena en beginnen met opnemen.
- Zodra de planarianen ongevoelig worden en stoppen met scrunching, stop met opnemen. Verwijder de planarianen uit de AITC-oplossing en spoel af (zie punt 1.1). Gooi vast en vloeibaar AITC-afval in geschikte afvalcontainers.
- Controleer de specificiteit van het antwoord op AITC met RNAi naar TRPA128 volgens standaardprotocollen.
- Bereid uit deze voorraad een 25 mL werkoplossing van 100 μM AITC in planarian water in een 50 mL centrifuge buis. Deze 100 μM AITC oplossing zal worden gebruikt om scrunching in planarianen te induceren.
- Om scrunching te induceren met behulp van een chemische stof, bijvoorbeeld, de TRPA1 agonist AITC28, worden planarianen idealiter ondergedompeld in een bad van de chemische stof. Indien nodig kan pipetting worden toegepast zoals beschreven in punt 2.1.2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Extraoculaire bijna-UV-waarneming in S. mediterranea planarians is TRPA1-afhankelijk en is voorgesteld om te worden gekoppeld aan H2O2 release17. Omdat H2O2 blootstelling trpa1-afhankelijke scrunching in S. mediterranea en D. japonica planarians28induceert, kunnen de stappen in punt 2.1.4 worden gebruikt om te testen of blootstelling aan bijna-UV-licht bij beide soorten scrunching veroorzaakt. Terwijl D. japonica-planariërs scrunch (10/10) bij blootstelling aan bijna-UV-licht, S. mediterranea planarians ofwel vertonen staart dunner (7/10) zoals eerder beschreven17 of geen reactie (3/10) (Figuur 4A,4B). Een kwantificering van de scrunching parameters, zoals beschreven in punt 1.4, voor de D. japonica planariërs die ten minste 3 opeenvolgende rechte lijn scrunches tentoongesteld blijkt kenmerken scrunching parameters voor deze soort7,28 (νm = 0,84 ± 0,14, | Δε| max = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,47 ± 0,07 en f elong = 0,56 ± 0,03, waarden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie voor N=7).
Blootstelling aan 250 μM cinnamaldehyde, een bekende TRPA1 agonist bij muizen34, veroorzaakt daarentegen scrunching in S. mediterranea7,28 (νm = 0,46 ± 0,08, | Δε| max = 0,36 ± 0,08, v*m = 0,16 ± 0,04, en felong = 0,58 ± 0,04, waarden gerapporteerd als gemiddelde n ± standaarddeviatie voor N=8) (figuur 5A), terwijl D. japonica-planariërs op hetzelfde (en 1,6x de concentratie) een mengsel vertonen van slangachtige en oscillerende beweging, onderbroken door glijdende en/of krachtige kopbeurten (figuur 5A). Een kwantificering van de (8/24) monsters met ten minste drie opeenvolgende oscillaties levert aanzienlijk lagere waarden op voor 3 van de 4 parameters dan verwacht voor scrunching bij deze soort (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε| max = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,17 ± 0,02 en f elong = 0,54 ± 0,06, waarden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie voor N=8). Dus, terwijl D. japonica lijken te knarsen op cinnamaldehyde blootstelling, een vergelijking van de berekende parameters met de literatuurwaarden voor deze soort7,28 toont aan dat de waargenomen oscillatorische beweging is niet scrunching. Dit voorbeeld benadrukt het belang van kwantitatieve metingen in combinatie met een zorgvuldige inspectie van de ruwe gedragsgegevens om waargenomen gedrag goed te interpreteren.
RNAi bevestigt de specificiteit van scrunching in reactie op blootstelling aan cinnamaldehyde in S. mediterranea. Binnen 180 seconden na blootstelling aan 250 μM cinnamaldehyde in vlierwater 15/15 unc22 (controle) RNAi S. mediterranea planarians scrunched, terwijl 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched (Figuur 5B), waaruit blijkt dat S. mediterranea scrunching in cinalnamalhyde vereist SmTRPA1. Knockdown van SmTRPA1 werd bevestigd door een blootstelling van 60 seconden aan een 100 μM AITC bad28.
Figuur 1: Planarian gedrag experimentele setup.
(A) Voorbeeld experimentele setup voor het bestuderen van planarian gedrag. (B) 100 mm Petri schotel arena gecentreerd in het gezichtsveld van de camera. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve voorbeelden van de Fiji-beeldanalyse van planarianen in de arena.
(A) Geselecteerde regio van belang, met het volledige planaire pad, aangegeven door de gele rechthoek. (B) Voorbeeldframes uit het gebied van belang na duplicatie. (C) Het aftrekken van de planarian van achtergrond en lawaai via thresholding (i) 8-bits beeld van planarian met lawaai, aangeduid door het sterretje. iiii) Binarized beeld van planarian na thresholding. iiiiii) Masker van planarian na het instellen van filtering op grootte om ruis te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Plotten planarian lengte met betrekking tot de tijd.
(A) Ruwe plot van planaire lengte versus tijd voor een scrunching S. mediterranea planarian. Het sterretje duidt op een moment waarop de planarian zich omdraaide terwijl hij scrunching. (B) Mogelijke manieren om scrunching gegevens bij te snijden. (i) Een correct bijgesneden plot dat de draaiende gebeurtenisgegevens verwijdert. (ii) Een onjuist bijgesneden plot die de gegevens van de draaiende gebeurtenis niet verwijdert. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Soortenspecifieke reacties op bijna-UV-licht.
(A) Monster frames van D. japonica scrunching en S. mediterranea staart dunner in reactie op de buurt-UV-licht. (B) Representatieve oscillatiepercelen S. mediterranea en D. japonica in reactie op bijna-UV-licht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Soortspecifieke respons op 250 μM cinnamaldehyde, een TRPA1 agonist.
aA) Representatieve oscillatiepercelen voor D. japonica en S. mediterranea planarianen in een 250 μM cinnamaldehyde bad. (B) Representatieve oscillatiepercelen waaruit blijkt dat scrunching in 250 μM cinnamaldehyde in SmTRPA1 RNAi S. mediterranea planarians verloren gaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende materialen. Klik hier om deze materialen te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van dit protocol kan men kwantitatief de effecten van fysische en chemische stimuli7,28,,29 of genetische manipulatie (RNAi)28,29 op planaire bewegingsvrijheid bestuderen. Om de ruimtelijke resolutie te maximaliseren, is het het beste om de camera zo dicht mogelijk bij de arena te verplaatsen, terwijl de hele arena zich in het gezichtsveld bevindt. Om de doorvoer te verhogen, kan het gedrag van meerdere planarianen tegelijk worden gescreend door meerdere planarianen tegelijk op te nemen. Wanneer de screening van meer dan een planarian in een enkele arena, regio's van belang kan worden getrokken in Fiji om individuele planarianen te isoleren zoals hier beschreven of meer geavanceerde multi-object tracking kan worden gebruikt. Een probleem met het hebben van meerdere planarianen in dezelfde arena is dat ze paden kunnen kruisen. Dit probleem kan worden opgelost door het gebruik van multi-well platen om planarianen van elkaar te isoleren, terwijl nog steeds gelijktijdige registratie van veel individuen om gedrag23,24te kwantificeren . Echter, planarianen zullen relatief meer tijd doorbrengen aan de muur in kleinere arena's, die aanpassingen aan de beeldanalyse en het beperken van de resolutie voor scrunching / peristalsis kwantificering.
Wanneer stimuli lokaal worden toegediend (bijvoorbeeld pipetting7, amputatie7,28, laseraanwijzer17),is het van cruciaal belang dat de planarianen consequent worden gestimuleerd in dezelfde regio, omdat het stimuleren van andere lichaamsgebieden mogelijk verschillende gedragingen kan veroorzaken. Verschillende methoden van levering (zoals pipetting of bad van een chemische stof) kan ook invloed hebben op de consistentie van het gedragsfenotype. Bovendien kunnen planarianen snel28desensibiliseren , waarmee rekening moet worden gehouden bij het plannen van experimenten als dezelfde planarianen, mogen niet onmiddellijk worden hergebruikt voor meerdere experimenten, hetzij met dezelfde of verschillende stimuli. Ten slotte, zoals hier getoond voor bijna-UV-blootstelling en cinnamaldehyde, is het belangrijk om zich ervan bewust dat dezelfde stimulus kan leiden tot verschillende gedragingen in verschillende planaire soorten. D. japonica scrunched wanneer gestimuleerd met bijna-UV-licht in de buurt van de staart tip, terwijl S. mediterranea planarians weergegeven staart dunner. In tegenstelling, cinnamaldehyde blootstelling geïnduceerd scrunching in S. mediterranea, maar niet in D. japonica planarians. Dus, terwijl scrunching is een geconserveerde reactie van verschillende planaire soorten op schadelijke stimuli7, het heeft soort specifieke parameters7,28, gevoeligheden28, en inducers28. Daarom is het voor een nieuwe soort waarvoor scrunching nog niet is geparameteriseerd, het beste om te beginnen met een goed geconserveerde inducer, zoals amputatie7,om de soortspecifieke parameters te bepalen voordat de reactie op andere stimuli wordt getest.
Een beperking van de hier beschreven analyse is dat het geen rekening houdt met bochten en/of gemengd gedrag, zoals intermitterende scrunching met hoofdwiebelen, glijden of andere veranderingen in de lichaamsvorm. Een grondige inspectie van de ruwe gegevens kan echter helpen deze problemen te beperken als deze gevallen handmatig van de analyse worden uitgesloten, zoals blijkt uit figuur 3. Daarnaast is het mogelijk om lichaamsvormanalyse toe te voegen aan het centrum van massa- en lengtetracking die hier wordt beschreven en het protocol uit te breiden om deze andere planarian gedragingen te kwantificeren. Aangezien de analyse geen veronderstellingen over het bestudeerde organisme maakt, zou het protocol in principe ook kunnen worden toegepast op andere organismen die vergelijkbare soorten gedrag vertonen.
De methode van het kwantificeren van de verschillende planaire gangen en het onderscheiden van scrunching van peristaltiek, zoals hier beschreven, veronderstelt geen voorafgaande opleiding in computationele beeldanalyse of gedragsstudies en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of software. Om de aanpassing van het protocol te vergemakkelijken, worden voorbeeldgegevens verstrekt in het aanvullend materiaal. Het gemak van het verkrijgen en culturing planarians, evenals de mogelijkheid om gedrag op te nemen zonder gespecialiseerde apparatuur, maakt planaire gedragsstudies breed toegankelijk voor onderzoek op alle niveaus, van lagere school klaslokalen tot academische laboratoria. Een gewijzigde versie van dit protocol is met succes gebruikt in een onderwijs laboratorium instelling die voornamelijk was samengesteld uit eerstejaars en tweedejaars studenten en omvatte zowel potentiële STEM en niet-STEM majors.
De combinatie van moleculaire (RNAi) en chemische instrumenten met kwantitatieve gedragsanalyse, zoals beschreven in dit protocol, stelt onderzoekers in staat om mechanistische inzichten te krijgen in de moleculaire controle van gedrag. Dergelijk werk heeft een aantal van de belangrijkste bemiddelaars en neuronale circuits die betrokken zijn bij hetzweefvliegen 19,20, fototaxi's17,35,,36, thermotaxi's9,37, en scrunching9,28,29. Hoewel planarian gedrag kan niet direct gevolg gedrag in hogere organismen, zoals mensen, deze gedragingen vertegenwoordigen fundamentele neuronale functies belangrijk voor alle organismen - het vermogen om te voelen en te verwerken specifieke stimuli en adequaat reageren. Vanwege het behoud van belangrijke neuronale functies tussen verschillende organismen, kunnen mechanistische studies bij planarianen ons breder leren over neuronale controle van gedrag. Bovendien kan het analyseren van planariërlijk gedrag in reactie op chemische blootstelling worden gebruikt om de effecten van de chemische stof op het vaanaliaanse zenuwstelsel23,24,25te bestuderen, die kunnen informeren over mogelijke risico's voor de menselijke hersenen. Met name scrunching veroorzaakt door schadelijke hitte bleek een gevoelig en specifiek eindpunt te zijn voor het testen van neurotoxiciteit, omdat het wordt verstoord door blootstelling aan bepaalde klassen van chemische stoffen22,24,25,30. Ten slotte, de planarian unieke regeneratieve mogelijkheden kunnen onderzoekers om de dynamiek van hoe verschillend gedrag worden hersteld tijdens neuroregeneratie ontleden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de heer Tapan Goel voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
