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Biology

सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग ऑफ सबसेलुलर संरचनाओं

Published: January 13, 2021 doi: 10.3791/61563
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, The Johns Hopkins University

Summary

यहां प्रस्तुत अक्षुण्ण ऊतक में सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। हम अपने मूल ऊतक वातावरण में एक अत्यधिक संवेदनशील वयस्क स्टेम सेल आबादी इमेजिंग के लिए शर्तों मानकीकृत किया है । इस तकनीक में जीवित ऊतक में जैविक घटनाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए लौकिक और स्थानिक संकल्प को संतुलित करना शामिल है।

Abstract

इमेजिंग में स्थानिक और लौकिक संकल्प के बीच लंबे समय से एक महत्वपूर्ण ट्रेडऑफ रहा है। प्रकाश की विवर्तन सीमा से परे इमेजिंग पारंपरिक रूप से केवल निश्चित नमूनों या मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ लेबल ऊतक के बाहर जीवित कोशिकाओं पर उपयोग करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है । वर्तमान सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग तकनीकों के लिए विशेष फ्लोरेसेंस प्रोब्स, उच्च रोशनी, अधिग्रहण के बाद प्रसंस्करण के साथ कई छवि अधिग्रहण, या अक्सर इन प्रक्रियाओं के संयोजन के उपयोग की आवश्यकता होती है। ये आवश्यकताएं जैविक नमूनों और संदर्भों को काफी हद तक सीमित करती हैं जिन्हें इस तकनीक पर लागू किया जा सकता है।

यहां हम सीटू में सुपर-रेजोल्यूशन (~ 140 एनएम XY-रिज़ॉल्यूशन) टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस लाइव सेल इमेजिंग करने की विधि का वर्णन करते हैं। यह तकनीक कम फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ भी संगत है, उदाहरण के लिए, ईजीएफपी या रीचेरी को नीच व्यक्त किए गए जीन पर टैग किया गया है। सिद्धांत के सबूत के रूप में, हमने ड्रोसोफिला टेस्टिस में कई उपकोशिकीय संरचनाओं की कल्पना करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है। ऊतक तैयारी के दौरान, सेलुलर संरचना और ऊतक आकृति विज्ञान दोनों विच्छेदित टेस्टिस के भीतर बनाए रखे जाते हैं। यहां, हम माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता, माइक्रोट्यूबुल और परमाणु झिल्ली के बीच बातचीत के साथ-साथ सेंट्रोमेरेस के लिए माइक्रोट्यूबल्स के लगाव के लिए इस तकनीक का उपयोग करते हैं।

इस तकनीक के नमूने तैयार करने, नमूना बढ़ते और नमूनों के स्थिर में विशेष प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, नमूनों को सेलुलर फ़ंक्शन और गतिविधि से समझौता किए बिना विच्छेदन के बाद कई घंटों तक बनाए रखा जाना चाहिए। जबकि हमने विशेष रूप से ड्रोसोफिला पुरुष जर्मलाइन स्टेम सेल (जीएससी) और जनक रोगाणु कोशिकाओं में विच्छेदित टेस्टिस ऊतक में लाइव सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग के लिए शर्तों को अनुकूलित किया है, यह तकनीक मोटे तौर पर विभिन्न कोशिका प्रकारों के लिए लागू होती है। या तो स्थानिक या लौकिक संकल्प त्याग के बिना अपनी शारीरिक परिस्थितियों के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करने की क्षमता सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण सवालों का समाधान करने की मांग शोधकर्ताओं के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में काम करेंगे ।

Introduction

प्रकाश की विवर्तन सीमा से परे संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में उपकोशिकीय संरचनाओं और प्रोटीन गतिशीलता की कल्पना करना आमतौर पर1 -3बहुत चुनौतीपूर्ण होता है। जबकि स्टोचस्टिक-ऑप्टिकल-पुनर्निर्माण-माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), फोटो-एक्टिवेटेड-लोकलाइजेशन-माइक्रोस्कोपी (पाम) और उत्तेजित-उत्सर्जन-कमी (एसटीईटी)4,5,6 माइक्रोस्कोपी विकसित की गई हैं, नमूना तैयार करने में जटिलताओं के साथ-साथ व्यवहार्यता और गतिविधि एक्साविरो वीवो बनाए रखने की आवश्यकता, लाइव नमूनों के लिए पारंपरिक सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के उपयोग को सीमित करें। पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ~ 230 एनएम XY-संकल्प से अधिक स्थानिक संकल्प तक नहीं पहुंच सकती है और अक्सर जटिल सेलुलर उपसंरचनाओं5,6का पालन करने के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, एयरस्कैन सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में हाल ही में एक विकास, लगभग 140 एनएम (XY-रिज़ॉल्यूशन)7, 8प्राप्त करने में सक्षम है औरइसमें अपेक्षाकृत सरल नमूना तैयारी है जो लाइव इमेजिंग के साथ संगत है। चूंकि इस इमेजिंग डिटेक्शन सिस्टम को लंबे अधिग्रहण के समय की आवश्यकता होती है, इसलिए इसका उच्च स्थानिक संकल्प अस्थायी संकल्प 9 की कीमत परआताहै। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है कि लाइव सेल इमेजिंग को उच्च स्थानिक संकल्प के साथ बढ़ाया जाए।

यहां, हमने विस्तृत स्थानिक जानकारी के साथ उपकोशिकीय संरचनाओं को समझने के लिए अपने इष्टतम संकल्प पर बरकरार ऊतक में जीवित कोशिकाओं को देखने के लिए एक विधि विकसित की। इस विधि को इस तरह से डिज़ाइन किया गया है ताकि नमूनों को लंबे समय तक (~ 10 एच) के लिए बिना गति या अपक्षय के स्थिर रूप से रखा जा सके। इस तकनीक में उपयोग किया जाने वाला लाइव सेल मीडिया सेलुलर फ़ंक्शन का समर्थन कर सकता है और सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप के तहत 10 घंटे तक फोटोब्लैचिंग से बच सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया, आर्द्रता और तापमान में परिवर्तन, साथ ही पोषक तत्वों की थकावट जैसे समय की विस्तारित अवधि में लेजर की निरंतर रोशनी के कारण होने वाले अधिकांश तनावों को कम करता है।

ड्रोसोफिला नर जर्मलाइन स्टेम सेल (जीएससी) की छवि के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम यह देखने में सक्षम थे कि माइक्रोट्यूबल्स की असममित गतिविधि एपिलीडिक रूप से अलग बहन क्रोमेटिक्स10 ,11,12,13के साथ तरजीही बातचीत के लिए कैसे अनुमति देती है। इस प्रकार की सेलुलर घटनाएं अत्यधिक गतिशील होती हैं और अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग विधियों जैसे तूफान, पाम या एसटीईटी का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में कल्पना करना बहुत मुश्किल होता है। हम आशा करते हैं कि यह विधि कोशिका जीवविज्ञानियों के लिए अत्यधिक उपयोगी हो जाएगी क्योंकि उनका उद्देश्य ऊतकों में रहने वाली जीवित कोशिकाओं की गतिशील उपकोशिकीय संरचनाओं को समझना है। ऐसे कई क्षेत्र हैं जिनमें इस विधि को लागू किया जा सकता है, जैसे प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करना; कोशिकाओं के आंदोलन को समझना; और वंश ट्रेसिंग और सेलुलर भेदभाव प्रक्रियाओं, अन्य संभावित अनुप्रयोगों के बीच।

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Protocol

1. लाइव सेल इमेजिंग कॉकटेल की तैयारी (लाइव सेल मीडिया)

  1. 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 0.6x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम को पूरक करें। पीएच को लगभग 7.0 पर समायोजित करें।
  2. माध्यम का उपयोग करने से ठीक पहले, इंसुलिन को 200 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    नोट: यह मीडिया सामान्य कोशिका विभाजन को बनाए रखने और समय-चूक इमेजिंग10,14के दौरान ड्रोसोफिला टेस्टिस के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।

2. ग्लास बॉटम सेल कल्चर डिश की तैयारी

  1. ड्रोसोफिला टेस्टिस के लिए 35 एमएम व्यास वाले पॉली एल-लिसिन कोटेड ग्लास-बॉटम सेल कल्चर डिश का इस्तेमाल करें। पकवान के भीतरी कुएं में 23 मिमी व्यास के साथ एक ग्लास बॉटम और 1 मिमी(चित्रा 1ए-ए)की ऊंचाई के साथ एक पक्ष है।
    नोट: एक ग्लास-बॉटम डिश चुनें जो कम काम करने की दूरी, बड़े संख्यात्मक अपर्चर और उच्च आवर्धन उद्देश्य के लिए अनुमति देता है; इन सुविधाओं को एक सुपर संकल्प छवि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
  2. डायलिसिस झिल्ली (MWCO: 12-14kD) का उपयोग करें जो गैसीय विनिमय के लिए अनुमति देता है। झिल्ली को छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें।
    नोट: झिल्ली के टुकड़े पकवान के कांच क्षेत्र से छोटे होने चाहिए, लेकिन नमूना को कवर करने के लिए काफी बड़े हैं।
  3. झिल्ली को ~ 5 मिनट के लिए लाइव सेल मीडिया के 100 माइक्रोन के साथ भिगो दें। नमूने पर सूखी झिल्ली का उपयोग न करें, क्योंकि यह इसे नुकसान पहुंचा सकता है। झिल्ली हाइपोक्सिक तनाव को रोकने में मदद करती है।
  4. झिल्ली पर डालने के लिए 2-3 हल्के वजन वाले ग्लास या प्लास्टिक के टुकड़े तैयार करें ताकि ऊतक तैर न सके। इसके लिए सबसे पहले 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब की बाहरी अंगूठी लें और उसे छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें। फिर, उपयोग से पहले 70% इथेनॉल के साथ टुकड़ों को स्टरलाइज करें।
    नोट: यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि नमूना इमेजिंग के दौरान सतह पर रहता है और तैरने नहीं देता है, जो इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. व्यास में एक अंगूठी ~ 25 मिमी तैयार करें और इसे पकवान के ऊंचा पक्ष पर रखें। दो कक्षों को उत्पन्न करने के लिए उस पर एक कवरलिप रखें। नीचे कक्ष नमूना शामिल होंगे, जबकि शीर्ष कक्ष एक आर्द्रता कक्ष के रूप में काम करने के लिए सुखाने से नमूना रोकने के लिए होगा ।
    1. इस अंगूठी को बनाने के लिए, बाहरी अंगूठी को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब से काट दें, जो इसे 35 मिमी डिश के ऊंचा पक्ष पर सुरक्षित रूप से फिट करने की अनुमति देगा। उदाहरण के लिए, एक समान अंगूठी अन्य तरीकों से बनाई जा सकती है, उदाहरण के लिए, नमूने में हस्तक्षेप किए बिना कवरस्लिप को ठीक से पकड़ने के लिए डिश के बुलंद पक्ष पर फिट करने के लिए रबर बैंड या प्लास्टिक ट्विस्ट टाई का उपयोग करके।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से हाइपोक्सिक स्थितियों जैसे तनावों के प्रति संवेदनशील नमूनों के लिए, और तापमान और आर्द्रता में परिवर्तन।

3. पुरुष मक्खियों और बढ़ते से वृषण का विच्छेदन

  1. ~ 10 युवा पुरुष मक्खियों (2-3 दिन पुराने) ले लो और ड्रोसोफिला वयस्क वृषण के ~ 10 जोड़े प्राप्त करने के लिए लाइव सेल मीडिया में टेस्ट विच्छेदन।
    1. बारीक संदंश का उपयोग करके विच्छेदन पकवान में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे मक्खियों को विच्छेदन करें।
      नोट: ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फ्रूट फ्लाई) स्ट्रेन यूएएस-α-तुबुलिन-जीएफपी ट्रांसजीन एक प्रारंभिक रोगाणु सेल ड्राइवर नैनोस-Gal4 द्वारा संचालित किया जाता है ।
    2. CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके निम्नलिखित नॉक-इन ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर उपभेदों को उत्पन्न करें: लैमिन-म्हेरी (सी-टर्मिनल टैग) और सीएनपी-ए-Dendra2-CENP-A [आंतरिक साइट पर टैग (118 वें-119 वें कोडन के बीच)] ।
      नोट: जबकि प्रत्येक प्रयोग के लिए उत्कृष्ट गुणवत्ता के केवल एक टेस्टिस की आवश्यकता होती है, ऊतकों (15-20) या कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या बढ़ते हुए यह सुनिश्चित करेंगे कि समय-चूक इमेजिंग के लिए उत्कृष्ट फ्लोरेसेंस संकेतों के साथ कम से कम एक स्वस्थ नमूना होगा।
  2. विच्छेदन पकवान में लाइव सेल मीडिया में दो बार टेस्ट्स धोएं।
    1. एक वाशिंग स्टेप के रूप में लाइव सेल मीडिया को हटाने के बाद मीडिया को जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    2. संदंश का उपयोग कर अतिरिक्त ऊतक निकालें। कोई भी अतिरिक्त ऊतक इमेजिंग में हस्तक्षेप करेगा।
      नोट: धोने के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) का उपयोग न करें, क्योंकि यह कुछ सेलुलर घटकों की गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है।
  3. डिश में लाइव सेल मीडिया के 100-150 माइक्रोन जोड़ें (चरण 2.1 में तैयार) और एक पिपेट टिप का उपयोग करके इसे कांच की सतह पर फैलाएं। सतह पर मीडिया का प्रसार ऊतक को ठीक से पकवान से चिपके रहने की अनुमति देगा।
  4. टेस्ट को ठीक संदंश का उपयोग करके डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें डिश के केंद्र में लाएं(चित्रा 1ए-बी)।
    नोट: मलबे को स्थानांतरित करने से बचें क्योंकि यह इमेजिंग में हस्तक्षेप करेगा और छवि की गुणवत्ता को कम कर सकता है।
  5. अतिरिक्त लाइव सेल मीडिया को हटा दें (लगभग 10 माइक्रोन मीडिया छोड़ दें) ऊतक को समतल करने और पकवान के लिए ठीक से चिपकाने की अनुमति देने के लिए। नमूना सूखने से बचने के लिए इस कदम को जल्दी से करें।
  6. टेस्ट (चित्रा1-सी)के शीर्ष पर पूर्व-गीली झिल्ली (चरण 2.2 और2.3में तैयार) रखें।
  7. झिल्ली पर 2-3 छोटे प्लास्टिक वजन (चरण 2.4 में तैयार) रखें ताकि नमूना तैर न जाए और जल्दी से लाइव सेल मीडिया (चित्रा 1ए-डी)के 100-150 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: मीडिया को जल्दी और धीरे से जोड़ना यह सुनिश्चित करता है कि नमूना सूख नहीं जाएगा या विस्थापित हो जाएगा।
  8. प्लास्टिक की अंगूठी (चरण 2.5 में तैयार) पकवान के बुलंद पक्ष पर रखें(चित्रा 1बी-ए)।
  9. रिंग(चित्रा 1बी-बी)के शीर्ष पर 22 मिमी x 22 मिमी कवरलिप रखें। इससे दो कक्ष उत्पन्न होते हैं।
  10. ऊतक कागज का एक टुकड़ा ले लो, यह पानी के साथ गीला है, तो यह भंवर और कवरस्लिप पर डाल दिया, एक आर्द्र कक्ष(चित्रा 1बी-सी)बनाने के लिए । डिश के ढक्कन(चित्रा 1बी-डी)को बंद करें और लाइव सेल इमेजिंग शुरू करें।
    नोट: यदि नमूना हल्का संवेदनशील है, तो अंधेरे में धारा 3 करें।

4. सीटू में ड्रोसोफिला पुरुष जर्मलाइन स्टेम सेल (जीएससी) की लाइव सेल इमेजिंग

  1. डिश को सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और स्टेज क्लैंप के साथ सुरक्षित करें।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें, संचारित प्रकाश को चालू करें, और फोकस घुंडी के साथ टेस्टिस ऊतक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 63x उद्देश्य का उपयोग करें।
      नोट: यदि 63x उद्देश्य के साथ एक नमूना का पता लगाने में कठिनाई होती है, तो 63x पर स्विच करने से पहले पहले 40x या 20x उद्देश्य का उपयोग करें।
    2. लेजर चालू करें, लाइवपर क्लिक करें, और इष्टतम स्थिति और स्थिति के साथ जीएससी ढूंढें। उन टेस्ट से बचें जिनमें कम फ्लोरेसेंस सिग्नल होता है या सतह से दूर हब (आला) होता है।
      नोट: ड्रोसोफिला टेस्ट में, जीएससी हब से जुड़े होते हैं।
  2. जीएससी के लिए फोकस को समायोजित करें और लेजर पावर, इलेक्ट्रॉन-गुणा (ईएम) लाभ, औसत और एयरस्कैन मोड के लिए ज़ूम सहित नमूने के लिए सही सेटिंग्स की पहचान करें। प्रारंभिक चरण की रोगाणु कोशिकाओं में α-ट्यूबलिन टैग किए गए ईजीएफपी को व्यक्त करने वाले ड्रोसोफिला टेस्ट के लिए एक उदाहरण के रूप में निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें।
    1. फ्रेम साइज पर क्लिक करके फ्रेम साइज 512 x 512 पिक्सल और 1024 x 1024 पिक्सल के बीच सेटकरें ।
    2. औसत पर क्लिक करके फ्रेम औसत को 1 या 2 तक सेट करें।
      नोट: फ्रेम आकार (>1024 x 1024 पिक्सल) बढ़ाने और अधिक औसत प्रदर्शन (यानी, 2 से अधिक) फोटोब्लैचिंग या फोटोटॉक्सीसिटी में परिणाम सकता है।
    3. लेजर पर क्लिक करके लेजर पावर को 1%-2% तक सेट करें।
      नोट: लेजर पावर बढ़ाने से फोटोब्लैचिंग या फोटोटॉक्सीसिटी भी हो सकती है।
    4. मास्टर गेन पर क्लिक करके अनुशंसित स्तर (< 800) से नीचे ईएम लाभसेट करें।
      नोट: एक उच्च EM लाभ कलाकृतियों उत्पन्न कर सकते हैं।
    5. छवि अधिग्रहण समय को कम करने और फोटोब्लैचिंग को कम करने के लिए क्षेत्र या ब्याज की कोशिका में ज़ूम करें। यह नमूना लंबे समय तक जीवित रहने की अनुमति देता है।
  3. स्टार्ट एक्सपेरिमेंटपर क्लिक करके एयरस्कैन मोड का उपयोग करके समय-चूक छवि कैप्चर शुरू करें।
    1. स्टार्ट एक्सपेरिमेंटपर क्लिक करने से पहले, सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण को बेहतर ढंग से कॉन्फ़िगर किया गया है।
    2. यदि यह नोटिस के साथ एक चेतावनी प्रदर्शित करता है "Airyscan अधिग्रहण बेहतर विन्यास नहीं है", तो फ्रेम आकार अनुभाग में इष्टतम क्लिक करें, जेड-स्टैक अनुभाग में इष्टतम क्लिक करें, और स्कैन क्षेत्र अनुभाग के लिए इष्टतम क्लिक करें (सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए न्यूनतम 1.3 ज़ूम की आवश्यकता होती है)।
  4. समय अंतराल, जेड-स्लाइस की संख्या, और प्रयोगात्मक डिजाइन और नमूने के प्रकार के अनुसार समय-चूक इमेजिंग की अवधि का अनुकूलन करें, ताकि छवि की गुणवत्ता से समझौता न हो और कोशिकाओं को कोशिका चक्र के विशेष चरणों में गिरफ्तार नहीं किया जाएगा।
    1. एक उदाहरण के रूप में, ड्रोसोफिला टेस्ट के समय-चूक इमेजिंग के मापदंडों को प्रारंभिक अंकुरण में ईजीएफपी-टैग किए गए α-ट्यूबलिन को निम्नलिखित चरणों में दिखाया गया है।
    2. 5 घंटे से अधिक समय-चूक इमेजिंग के लिए, 1% लेजर पावर के साथ 10 मिनट के अंतराल पर छवि और हर समय बिंदु पर 30 जेड-स्लाइस तक ले जाएं।
    3. माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स जैसी अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए, समय बिंदुओं के बीच 2 मिनट का अंतराल सेट करें, 1%लेजर पावर पर 1-2 घंटे समय-चूक इमेजिंग करें, और प्रत्येक समय बिंदु पर 30 जेड-स्लाइस तक ले जाएं।
    4. दुर्लभ सेलुलर घटनाओं के लिए, जैसे कि शुरुआती टेलोफेज क्रोमेटिन गतिशीलता (2-3 मिनट की घटनाओं) के लिए एनाफेज, समय बिंदुओं के बीच 1 मिनट के अंतराल के साथ लाइव सेल इमेजिंग सेट करें, 1% लेजर पावर पर 30 मिनट समय-चूक इमेजिंग करें, और हर बार बिंदु पर 30 जेड-स्लाइस तक ले जाएं।
      नोट: ये पैरामीटर अलग-अलग नमूनों के लिए भिन्न हो सकते हैं, इसलिए विशिष्ट नमूने के लिए इष्टतम उपयोग के लिए परिवर्तन की आवश्यकता होगी।
  5. नमूना और प्रयोगात्मक डिजाइन की संवेदनशीलता के आधार पर या तो समय-चूक इमेजिंग या लाइव स्नैपशॉट इमेजिंग करें।
    नोट: एक लघु फिल्म 15-30 मिनट है, और एक लंबी फिल्म 5 घंटे से अधिक है ।
  6. यदि नमूना बहुत संवेदनशील है और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के साथ समय-चूक इमेजिंग द्वारा अध्ययन नहीं किया जा सकता है, जैसा कि अक्सर ड्रोसोफिला पुरुष जीएससी के मामले में होता है, तो विभिन्न सेल चक्र चरणों में नमूने का सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव स्नैपशॉट (एसआरएलएस) करें (जैसा कि चित्रा 2, चित्र 3, चित्रा 4में दिखाया गया है)।
    1. यदि किसी दुर्लभ सेल जैविक घटना को कैप्चर किया जा रहा है या ब्याज के प्रोटीन में कम अभिव्यक्ति का स्तर होता है, तो एसआरएलएस करें।
    2. एसआरएलएस के लिए, आप में रुचि रखते हैं विशिष्ट सेल चक्र चरण में एक सेल पाते हैं। उदाहरण के लिए, यदि माइक्रोट्यूबुल्स-किनेटोकोर बाइंडिंग पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, तो प्रोमेटाफेज या मेटाफेज पर एक सेल का उपयोग करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि आपको फ्लोरोफोरस के नमूने या ब्लीचिंग के लिए फोटोटॉक्सिसिटी को खतरे में डालने के बिना सही समय पर ब्याज की कोशिका की उच्च गुणवत्ता वाली छवि प्राप्त हो, जो लंबी फिल्म के दौरान हो सकती है।
    3. यदि एसआरएलएस का उपयोग कर रहे हैं, तो कई कोशिकाओं में रुचि के विभिन्न सेल चक्र चरणों की छवि और कालक्रम में इन छवियों की व्यवस्था करें।
      नोट: इसका उपयोग सिग्नल और ऊतक स्वास्थ्य को अधिकतम करते हुए घटनाओं के एक लौकिक आदेश का निर्माण करने के लिए किया जा सकता है, विशेष रूप से संवेदनशील नमूनों या कम सिग्नल वाले नमूनों के लिए घटना का उत्कृष्ट लौकिक समाधान प्राप्त करने के लिए।

5. लाइव सेल छवियों के Airyscan प्रसंस्करण

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ छवि अधिग्रहण के बाद, प्रोसेसिंग,क्लिक बैचका चयन करें, और फिर Airyscan प्रोसेसिंगका चयन करें।
    1. संसाधित की जाने वाली छवियों का चयन करें और फिर सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए रन/प्रोसेस पर क्लिक करें।
    2. डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग करके प्रसंस्करण करें।
      नोट: Airyscan प्रसंस्करण केवल तभी काम करेगा जब एयरस्कैन इमेजिंग के लिए इमेजिंग सेटिंग्स ठीक से स्थापित हों।

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Representative Results

विशेष रूप से जीएससी के लिए ड्रोसोफिला ऊतक में विवर्तन सीमा से परे लाइव सेल इमेजिंग, सेल चक्र प्रगति के संदर्भ में उपकोशिकीय घटनाओं की गतिशीलता की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। हाल ही में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले एक अध्ययन से पता चला है कि मां सेंट्रोसोम बनाम बेटी सेंट्रोसोम में माइक्रोट्यूबुल गतिविधियां जीएससी10में अस्थायी असममित हैं। मां सेंट्रोसोम माइटोटिक प्रवेश से लगभग 4 घंटे पहले माइक्रोट्यूबुल निकलती है, जबकि बेटी सेंट्रोसोम केवल माइटोसिस की शुरुआत में माइक्रोट्यूबुल निकलती है। मां सेंट्रोसोम से अत्यधिक सक्रिय माइक्रोट्यूबुल परमाणु झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं और ध्रुवीकृत परमाणु लिफाफा ब्रेक डाउन (एनईबीडी) को प्रेरित करते हैं। स्थानीय एनईबीडी हब के समीपस्थ है और मां सेंट्रोसोम से माइक्रोट्यूबुल्स को नाभिक में प्रवेश करने की अनुमति देता है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे भविष्य के स्टेम सेल को अलग करने के लिए मजबूत बहन किनेटोकोर और सिस्टर सेंट्रोमेरे को तरजीह देते हैं। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि एक असममित माइटोटिक अक्ष मौजूद है जिसमें माइक्रोट्यूबुल्स, परमाणु झिल्ली, किनेटोकोर और सेंट्रोमर एक स्थानिक रूप से नियंत्रित तरीके से बातचीत करते हैं, ताकि उचित गैर-नियंत्रित गुणसूत्र अलगाव अंततः10,11,12हो सके।

इनमें से प्रत्येक परिणाम को यहां उल्लिखित एसआरएलएस दृष्टिकोण का उपयोग करके समर्थन दिया गया था। प्रारंभिक चरण की रोगाणु कोशिकाओं में α-ट्यूबलिन-जीएफपी को व्यक्त करते हुए ड्रोसोफिला टेस्ट की लाइव सेल इमेजिंग करके, हम जीएससी(चित्र 2)में माइक्रोट्यूबुल गतिविधि में लौकिक विषमता की पहचान करने में सक्षम थे। हम भी मां सेंट्रोसोम पर एक उज्जवल संकेत के रूप में दो सेंट्रोसोम्स पर GFP संकेतों की असममित तीव्रता और बेटी सेंट्रोसोम पक्ष में एक कताई डिस्क कंफोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 2A)का उपयोग कर एक अपेक्षाकृत कमजोर संकेत देखने में सक्षम थे । चमक में अंतर माइक्रोट्यूबुल नाभिक की लौकिक विषमता से परिलक्षित होता है, लेकिन विस्तृत आकृति विज्ञान और माइक्रोट्यूबुल की मात्रा कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके हल नहीं किया जा सकता है। इसके विपरीत, लाइव सेल सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ने हमें आकृति विज्ञान की कल्पना करने और माइक्रोट्यूब्यूल्स(चित्रा 2B)की संख्या की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति दी। इसके बेहतर संकल्प असममित माइक्रोट्यूबुल नाभिक, विस्तार, और परमाणु झिल्ली(चित्रा 2B)के साथ बातचीत में वृद्धि के पैटर्न का पता चला । उदाहरण के तौर पर α-ट्यूबलिन-जीएफपी-एक्सप्रेसिंग जीएससी की टाइम-लैप्स फिल्में एक प्राइमरी रिसर्च पेपर (वीडियो एस3 और वीडियो एस5)10में प्रकाशित हुई हैं ।

इसके बाद, हमने ड्रोसोफिला टेस्ट पर लाइव सेल इमेजिंग का प्रदर्शन किया, जो शुरुआती चरण की रोगाणु कोशिकाओं में लेमिन-एमएचएफपी के साथ या तो α-तुबुलिन-जीएफपी या α-तुबुलिन-मचेरी के साथ सह-व्यक्त करता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि असममित माइक्रोट्यूबुल गतिविधि जीएससी(चित्र 3)में असममित एनईबीडी के साथ हुई। कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, हम असममित परमाणु झिल्ली इनवेजिनेशन की कल्पना कर सकते हैं, लेकिन व्यक्तिगत माइक्रोट्यूब्यूल्स नहीं जो सीधे नाभिक(चित्रा 3 ए)में प्रवेश करते हैं। इसके विपरीत, इस लाइव सेल सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक ने हमें माइक्रोट्यूबल और न्यूक्लियर लैमिना दोनों को एक साथ इमेजिंग करके इन घटनाओं का सीधे अवलोकन करने की अनुमति दी(चित्रा 3 बी)।

इसके बाद, हमने प्रारंभिक चरण की रोगाणु कोशिकाओं में α-तुबुलिन-म्हेरी और सेएनपी-ए-Dendra2 या CENP-A-GFP (सेंट्रोमेरे प्रोटीन ए) को व्यक्त करते हुए ड्रोसोफिला टेस्ट पर लाइव सेल इमेजिंग का प्रदर्शन किया। माइक्रोट्यूबुल और सेंट्रोमेरे लगाव की बेहतर कल्पना करने के लिए, हम उनके लगाव को स्थिर करने के लिए उन्हें कम तापमान (~ 18 डिग्री सेल्सियस) पर चित्रित करते हैं। यदि आवश्यक हो, तो नमूना को माइक्रोटुबुल-सेंट्रोमेरे अटैचमेंट को स्थिर करने और किसी भी असंबद्ध माइक्रोट्यूबुल को विकृत करने के लिए 4-5 मिनट के लिए बर्फ या बर्फ-ठंडे लाइव सेल मीडिया के साथ संक्षेप में ठंडा किया जा सकता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि शुरुआती सक्रिय मां सेंट्रोसोम से निकलने वाले माइक्रोट्यूबुल्स मजबूत सिस्टर सेंट्रोमेरे(चित्रा 4)से अधिमानतः संलग्न होते हैं। कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, α-तुबुलिन-म्हेरी संकेतों ने दो सेंट्रोसोम्स के पास असममित चमक प्रदर्शित की। हम दोनों सिस्टर सेंट्रोमर्स को एक संकेत के रूप में भी पहचान सकते हैं, जैसा कि चित्र 4ए (मेटाफेज) में दिखाया गया है, लेकिन माइक्रोट्यूबुल-सेंट्रोमेरे अटैचमेंट(चित्रा 4A, मेटाफेज)की कल्पना करने में सक्षम नहीं थे। इसके विपरीत, सुपर-रेजोल्यूशन लाइव इमेजिंग ने हमें माइक्रोट्यूबुल-सेंट्रोमेरे अटैचमेंट(चित्रा 4B) कीकल्पना करने की अनुमति दी। हमारे परिणाम बताते हैं कि मां सेंट्रोसोम-निकलने वाले माइक्रोट्यूबल बेटी सेंट्रोसोम-निकलने वाले माइक्रोट्यूबल्स(चित्रा 4B,अर्ली प्रोफेस्ट) से पहले सेंट्रोमेरे से जुड़ती हैं।

Figure 1
चित्र 1: ड्रोसोफिला टेस्टिस की तैयारी और बढ़ते इसके लिए योजना। (ए)टॉप व्यू: ग्लास-बॉटम सेल कल्चर डिश (ए-ए), ड्रोसोफिला टेस्टिस को डिश (ए-बी) के केंद्र की ओर ट्रांसफर करें, टेस्टिस (ए-सी) के शीर्ष पर डायलिसिस झिल्ली रखें, डायलिसिस झिल्ली (ए-डी) पर तीन प्लास्टिक वजन रखें । (B)पार्श्व दृश्य: डिश (बी-ए) के ऊंचा पक्ष पर प्लास्टिक की अंगूठी रखें, प्लास्टिक की अंगूठी (बी-बी) पर 22 मिमी × 22 मिमी कवरलिप रखें, कवरस्लिप (बी-सी) पर एक भंवर और गीले ऊतक कागज रखें, ढक्कन (बी-डी) के साथ पकवान को बंद करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सुपर-रिज़ॉल्यूशन समय-ड्रोसोफिला ऊतक (टेस्ट) में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता की चूक इमेजिंग α-ट्यूबलिन-जीएफपी (ए)पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी लाइव सेल छवि को व्यक्त करते हुए मध्य जी2 चरण में मेटाफेज में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता दिखा रहा है। (ख)Airyscan माइक्रोस्कोप लाइव सेल छवि विस्तृत संरचनात्मक जानकारी के साथ मेटाफेज के लिए मध्य G2 चरण में मां बनाम बेटी सेंट्रोसोम्स से निकलने वाले असममित माइक्रोट्यूबुले दिखा रहा है । एक कार्टून में ड्रोसोफिला नर जर्मलाइन स्टेम सेल को दर्शाया गया है। स्केल बार: 5μm; तारांकन: हब (आला); हरा तीर: मां सेंट्रोसोम (स्टेम सेल साइड [एम]); लाल तीर: बेटी सेंट्रोसोम (बेटी सेल साइड [डी]) में अंतर; पीला तीर: शुक्राणुओं की कोशिका में सेंट्रोसोम (जनक गैर-स्टेम रोगाणु कोशिका); मैजेंटा तीर: नाभिक में माइक्रोटुबुल पोकिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सुपर-रिज़ॉल्यूशन समय-माइक्रोट्यूबुल पोकिंग-इन गतिविधि और ड्रोसोफिला ऊतक (टेस्ट) में असममित परमाणु लिफाफा टूटने की चूक इमेजिंग लैमिन-म्हेरी और α-तुबुलिन-जीएफपी को सह-व्यक्त करते हैं। (A)पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेज जिसमें जी2-एम फेज से माइटोसिस तक माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स दिखाई देती है । स्टेम सेल साइड में उच्च α-तुबुलिन-जीएफपी तीव्रता और परमाणु झिल्ली के साथ इसकी बातचीत को दिखाने वाली छवि । (ख)एयरवाईस्कैन माइक्रोस्कोप लाइव सेल इमेज जिसमें स्टेम सेल साइड में माइक्रोट्यूबुल पोकिंग-इन और असममित एनईबीडी दिखाया गया है । स्केल बार: 5μm; तारांकन: हब (आला); नारंगी तीर: परमाणु झिल्ली में माइक्रोट्यूबुल पोकिंग की साइट; मजेंटा तीर: माइक्रोट्यूबुल्स जो स्टेम सेल साइड में प्रहार करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सुपर-रिज़ॉल्यूशन समय-ड्रोसोफिला ऊतक (टेस्ट) में माइक्रोट्यूबुले और सेंट्रोमेरे अटैचमेंट की चूक इमेजिंग α-तुबुलिन-मचेरी और सीएनपी-ए-Dendra2 व्यक्त करते हैं । (ए)ट्रेडिशनल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेज में माइक्रोट्यूबुल और सेंट्रोमेरे इंटरैक्शन को शुरुआती प्रोफैकेशन से मेटाफेज में दिखाया गया है । स्टेम सेल साइड और सेनपी-ए-जीएफपी सिग्नल पर उच्च α-तुबुलिन-मचेरी तीव्रता दिखाने वाली छवि। (ख)एयरिस्कन माइक्रोस्कोप लाइव सेल इमेज जिसमें मदर सेंट्रोसोम से निकलने वाले माइक्रोट्यूबुल्स और शुरुआती प्रोफेसी में मजबूत सेंट्रोमर्स से अटैचमेंट दिखाई देता है । मेटाफेज में, सेंट्रोमर विपरीत ध्रुव (द्वि-अभिविन्यास) से जुड़े होते हैं। स्केल बार: 5μm; तारांकन: हब (आला); मजेंटा तीर: किनेटोकोर फाइबर या के-फाइबर (सेंट्रोमेरे से जुड़े माइक्रोट्यूबुल्स)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी विधियां 10 के रूप में स्थानिक संकल्प प्रदान करती हैं 10 के रूप में नैनोमीटर4,5,6। स्टॉर्म और पाम माइक्रोस्कोपी विधियां 20 से 50 एनएम (XY-रिज़ॉल्यूशन) तक रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती हैं, जबकि एसटीईड माइक्रोस्कोपी 20 से 100 एनएम (XY-रिज़ॉल्यूशन) का रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है। सिम माइक्रोस्कोपी का स्थानिक संकल्प 100 से 130 एनएम15तक सीमित है । हालांकि, इसके उच्च फोटॉन घनत्व और लंबे अधिग्रहण समय के कारण, लाइव सेल इमेजिंग के लिए इन तकनीकों का उपयोग करना बेहद चुनौतीपूर्ण है।

इमेजिंग सबसेलुलर संरचनाओं, जैसे साइटोस्केलेटन, गुणसूत्रों, और ऊतकों के भीतर जीवित कोशिकाओं में ऑर्गेनेल्स, तकनीक को अल्ट्रासेंसिटिव और नॉनइनवेसिव दोनों की आवश्यकता होती है, जबकि अभी भी उच्च स्थानिक संकल्प है। यहां प्रस्तुत Airyscan सुपर-रेजोल्यूशन तकनीक 0.2 एयरी यूनिट पिनहोल के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग को जोड़ती है, साथ में पिक्सेल रीअसाइनमेंट और डिकोवोोल्यूशन के साथ। यह तकनीक पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी7की तुलना में 1.7 x अधिक संकल्प प्राप्त कर सकती है। पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का ~ 220-230 एनएम संकल्प प्रकाश की विवर्तन सीमा द्वारा प्रतिबंधित है, लेकिन यह इमेजिंग तकनीक लगभग 140 एनएम XY-संकल्प प्राप्त करने में सक्षम है, जो सिम (110-120 एनएम पर संकल्प)16जैसे अन्य व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के बराबर है।

एयरिसकैन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की अनुकूलनशीलता और बहुमुखी प्रतिभा इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के ऊतकों और कोशिकाओं पर लागू होने की अनुमति देगी ताकि विभिन्न प्रकार की कोशिका जीव विज्ञान प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके7,16। इस तकनीक का उपयोग करके, शोधकर्ता अभूतपूर्व स्थानिक विस्तार के साथ सेलुलर गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्तर पर समय-चूक छवियों को प्राप्त कर सकते हैं।

इस तकनीक में महत्वपूर्ण कदम पकवान पर नमूना बढ़ रहा है ताकि यह समय चूक इमेजिंग के दौरान कदम या नाव नहीं है । नमूना को इमेजिंग सतह के करीब या अटके हुए रखना (यानी, पकवान का ग्लास बॉटम) सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने और नमूने के लिए इष्टतम माइक्रोएनवायरमेंट को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि हाइपोक्सिया जैसी स्थितियों और तापमान या आर्द्रता में परिवर्तन के कारण नमूने पर जोर नहीं दिया जाता है।

इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता के बावजूद, कुछ चेतावनी हैं। एयरस्कैन मोड के साथ टाइम-लैप्स इमेजिंग पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग की तुलना में अपेक्षाकृत धीमी प्रक्रिया है। इसलिए, यहां तक कि नमूने की थोड़ी सी भी शारीरिक बदलाव के परिणामस्वरूप खराब समाधान हो सकता है। इमेजिंग सतह (उदाहरण के लिए, पॉली एल-लिसिन कोटिंग या नमूने के साथ संगत अन्य कोटिंग) के नमूनों का पालन करने के लिए एक स्थिरीकरण विधि का उपयोग करके इस स्थिति को रोका जा सकता है। इसके अलावा, ऊतक के शीर्ष पर एक डायलिसिस झिल्ली रखने और इस प्रोटोकॉल में वर्णित कुछ छोटे वजन जोड़ने में मदद करता है ऊतक आंदोलन को रोकने या तैरने जबकि भी गैसीय विनिमय के लिए अनुमति देता है । समय-चूक इमेजिंग कोशिकाएं जो सुपर-रिज़ॉल्यूशन मोड के साथ ऊतक में गहरी स्थित हैं, उच्च रोशनी की आवश्यकता होती है और फोटोब्लैचिंग का कारण बन सकती हैं। नमूने के लिए इष्टतम सेटिंग्स को प्राप्त करने के लिए जेड-स्लाइस, रोशनी शक्ति और औसत एल्गोरिदम की संख्या को समायोजित करके इसे कम किया जा सकता है। यदि कोशिका या ऊतक इमेजिंग के दौरान लेजर विषाक्तता, हाइपोक्सिया या किसी अन्य तनाव के प्रति संवेदनशील है, तो सेल चक्र गिरफ्तारी हो सकती है। इसके अलावा, यदि किसी प्रोटीन में बेहद कम अभिव्यक्ति, छोटा आधा जीवन या कम फ्लोरेसेंस सिग्नल है, तो फोटोब्लेचिंग हो सकती है जिसके परिणामस्वरूप खराब गुणवत्ता वाली छवि होगी। इससे एसआरएल ले जाने, शॉर्ट मूवी बनाने या लगातार टाइम पॉइंट्स के बीच लंबे अंतराल के साथ शूटिंग करने से बचा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप सेटिंग और समय-चूक इमेजिंग पैरामीटर (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है) को नमूने को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

चूंकि यह आवश्यक है कि नमूना प्रक्रिया के दौरान आगे नहीं बढ़ता है या पतित नहीं होता है, इसलिए छवि संकल्प से समझौता किए बिना रात भर या एक दिन से अधिक समय तक चलने वाली समय-चूक इमेजिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है।

मौजूदा तरीके मुख्य रूप से सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी और टाइम-लैप्स इमेजिंग पैरामीटर्स को अलग से1,9के अनुकूल बनाने पर ध्यान केंद्रित करते हैं । हालांकि, ये विधियां नमूना तैयारी या बढ़ते मापदंडों के बारे में विवरण प्रदान नहीं करती हैं, जो नमूने की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने और समय-चूक इमेजिंग के दौरान वांछित सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप की अनुकूलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस विधि में, हमने इमेजिंग मापदंडों, नमूना तैयारी और बढ़ते मापदंडों को अनुकूलित किया है ताकि नमूना और संकल्प के पतन और संकल्प दोनों को खतरे में ए बिना सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए समय-चूक इमेजिंग को विस्तारित अवधि के लिए किया जा सके।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक माइक्रोस्कोप और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय में एकीकृत इमेजिंग कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम प्रूफरीडिंग और सुझावों के लिए जे स्नेडेकर और क्यू यू, और सहायक चर्चाओं और सुझावों के लिए एक्स.C लैब सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। NIGMS/NIH R35GM127075 द्वारा समर्थित, हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, डेविड और ल्यूसिले पैकार्ड फाउंडेशन, और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (X.C.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software) Adobe N/A
Dialysis membrane Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane Cat No. 08-67121
FBS Thermo Fisher Scientific Cat. no. 26140079 15% (V/V)
Fiji (analysis software) NIH N/A Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) World Precision Instrument, Inc. FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software) Bitplane N/A 3D image reconstruction
Imerssion oil Zeiss Immersol 518F/30 °C
Insulin Sigma Cat. No. 15550 200 µg/ml
Penicillin/streptomycin Invitrogen Cat No. - 15140-122 0.6x
Schneider Drosophila media Invitrogen Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope Zeiss N/A equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper Kimwipe N/A Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module Zeiss N/A equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software) Zeiss N/A

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References

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सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग ऑफ सबसेलुलर संरचनाओं
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Ranjan, R., Chen, X.… More

Ranjan, R., Chen, X. Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures. J. Vis. Exp. (167), e61563, doi:10.3791/61563 (2021).

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