Summary
Presentert her er en protokoll for super-oppløsning live-celle avbildning i intakt vev. Vi har standardisert betingelsene for å avbilde en svært følsom stamcellepopulasjon for voksne i sitt opprinnelige vevsmiljø. Denne teknikken innebærer å balansere tidsmessig og romlig oppløsning for å muliggjøre direkte observasjon av biologiske fenomener i levende vev.
Abstract
Det har lenge vært en avgjørende avveining mellom romlig og tidsmessig oppløsning i avbildning. Avbildning utover diffraksjonsgrensen for lys har tradisjonelt vært begrenset til å bare brukes på faste prøver eller levende celler utenfor vev merket med sterkt fluorescerende signal. Nåværende superoppløselige live celleavbildningsteknikker krever bruk av spesielle fluorescenssonder, høy belysning, flere bildeanskaffelser med etteranskaffelsesbehandling, eller ofte en kombinasjon av disse prosessene. Disse forutsetningene begrenser de biologiske prøvene og kontekstene som denne teknikken kan anvendes på.
Her beskriver vi en metode for å utføre superoppløsning (~ 140 nm XY-oppløsning) tidsforløp fluorescens levende celleavbildning in situ. Denne teknikken er også kompatibel med lav fluorescerende intensitet, for eksempel EGFP eller mCherry endogent merket ved lavt uttrykte gener. Som et prinsippbevis har vi brukt denne metoden til å visualisere flere subcellulære strukturer i Drosophila testis. Under vevsforberedelse opprettholdes både cellulær struktur og vevsmorfologi i dissekerte testis. Her bruker vi denne teknikken til å avbilde mikrotubuldynamikk, samspillet mellom mikrotubuler og atommembranen, samt vedlegg av mikrotubuler til sentromerer.
Denne teknikken krever spesielle prosedyrer i prøvepreparering, prøvemontering og immobilisering av prøver. I tillegg må prøvene opprettholdes i flere timer etter disseksjon uten at det går ut over cellulær funksjon og aktivitet. Mens vi har optimalisert betingelsene for levende superoppløselig avbildning spesielt i Drosophila mannlige bakterie stamceller (GSC) og stamceller i dissekert testisvev, er denne teknikken bredt anvendelig for en rekke forskjellige celletyper. Evnen til å observere celler under deres fysiologiske forhold uten å ofre enten romlig eller tidsmessig oppløsning vil fungere som et uvurderlig verktøy for forskere som ønsker å ta opp viktige spørsmål i cellebiologi.
Introduction
Visualisering av subcellulære strukturer og proteindynamikk i levende celler med oppløsning utover diffraksjonsgrensen for lys er vanligvis svært utfordrende1-3. Mens flere superoppløselige teknikker som Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) og Stimulated-Emission-Depletion (STED)4,5,6 mikroskopi er utviklet, komplikasjoner i prøvepreparering samt behovet for å opprettholde levedyktighet og aktivitet ex vivo, begrense bruken av konvensjonell superoppløselig mikroskopi for avbildning av levende prøver. Konvensjonell konfektmikroskopi kan ikke nå romlig oppløsning utover ~230 nm XY-oppløsning og er ofte utilstrekkelig til å observere intrikate cellulære understrukturer5,6. En nylig utvikling innen konfokal mikroskopi, Airyscan super-resolution imaging, er imidlertid i stand til å oppnå omtrent 140 nm (XY-oppløsning)7,8 og har et relativt enkelt prøvepreparering som er kompatibelt med levende bildebehandling. Siden dette bildedeteksjonssystemet krever lang oppkjøpstid, kommer den høye romlige oppløsningen på bekostning av tidsoppløsning9. Derfor er det nødvendig med en metode for å sikre at levende celleavbildning utvides med høy romlig oppløsning.
Her utviklet vi en metode for å observere levende celler i intakt vev med optimal oppløsning for å dechiffrere subcellulære strukturer med detaljert romlig informasjon. Denne metoden er utformet slik at prøver kan monteres stabilt i lang tid (~ 10 timer) uten å bevege seg eller degenerere. Live cellemediet som brukes i denne teknikken kan støtte cellulær funksjon og unngå fotobleaching i opptil 10 timer under et mikroskop med superoppløsning. Til slutt minimerer denne protokollen de fleste påkjenninger forårsaket av konstant belysning av lasere over lengre perioder som hypoksi, endringer i fuktighet og temperatur, samt næringsutmattelse.
Ved å bruke denne protokollen til å bilde Drosophila mannlige bakterie stamceller (GSC), var vi i stand til å observere hvordan den asymmetriske aktiviteten til mikrotubuler gir mulighet for preferanseinteraksjon med epigenetisk distinkte søsterkromotider10,11,12,13. Denne typen cellulære hendelser er svært dynamiske og er svært vanskelige å visualisere i levende celler ved hjelp av andre bildemetoder med superoppløsning, for eksempel STORM, PALM eller STED. Vi forventer at denne metoden vil bli svært nyttig for cellebiologer, da de tar sikte på å forstå de dynamiske subcellulære strukturene til levende celler som bor i vev. Det er mange områder der denne metoden kan brukes på, for eksempel å studere dynamikken i proteiner; forstå bevegelsen av celler; og avledningssporing og cellulære differensieringsprosesser, blant andre mulige applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av levende celle bildecocktail (live celle media)
- Supplement Schneiders Drosophila medium med 15% foster bovint serum (FBS) og 0,6x penicillin/streptomycin. Juster pH til ca. 7,0.
- Rett før du bruker mediet, tilsett insulin i en endelig konsentrasjon på 200 μg/ml.
MERK: Dette mediet er avgjørende for å opprettholde normal celledeling og utvikling av Drosophila testis under tidsforløp bildebehandling10,14.
2. Tilberedning av glassbunncellekulturrett
- Bruk en poly L-lysinbelagt glassbunnscellekulturrett med en diameter på 35 mm for Drosophila testis. Den indre brønnen på parabolen har en glassbunn med en diameter på 23 mm og en side med en høyde på 1 mm (Figur 1A-a).
MERK: Velg en glassbunnsfat som gir kortere arbeidsavstand, større numerisk blenderåpning og høyere forstørrelsesmål; Disse funksjonene er avgjørende for å få et bilde med superoppløsning. - Bruk en dialysemembran (MWCO: 12–14 kD) som muliggjør gassformig utveksling. Klipp membranen i små biter.
MERK: Membranstykkene skal være mindre enn glassområdet på fatet, men store nok til å dekke prøven. - Bløtlegg membranen med 100 μL levende cellemedier i ~ 5 min. Ikke bruk en tørr membran på prøven, da den kan skade den. Membran bidrar til å forhindre hypoksisk stress.
- Forbered 2-3 lette glass- eller plaststykker som skal settes på membranen slik at vevet ikke flyter. For å gjøre dette, ta først den ytre ringen på 50 ml sentrifugerøret og kutt det i små biter. Steriliser deretter brikkene med 70% etanol før bruk.
MERK: Dette trinnet sikrer at prøven forblir på overflaten under bildebehandling og ikke flyter, noe som er avgjørende for å oppnå optimale resultater. - Forbered en ring ~ 25 mm i diameter og plasser den på den forhøyede siden av parabolen. Sett en deksle på den for å generere to kamre. Bunnkammeret vil inneholde prøven mens det øverste kammeret vil fungere som et fuktighetskammer for å forhindre at prøven tørker.
- For å lage denne ringen, kutt av den ytre ringen fra et 50 ml sentrifugerør, noe som gjør at den passer godt på den forhøyede siden av 35 mm parabolen. En lignende ring kan gjøres på andre måter, for eksempel ved å bruke et gummibånd eller plast vri slips for å passe på den forhøyede siden av parabolen for å holde dekslene riktig uten å forstyrre prøven.
MERK: Dette trinnet er kritisk, spesielt for prøver som er følsomme for påkjenninger som hypoksiske forhold, og endringer i temperatur og fuktighet.
- For å lage denne ringen, kutt av den ytre ringen fra et 50 ml sentrifugerør, noe som gjør at den passer godt på den forhøyede siden av 35 mm parabolen. En lignende ring kan gjøres på andre måter, for eksempel ved å bruke et gummibånd eller plast vri slips for å passe på den forhøyede siden av parabolen for å holde dekslene riktig uten å forstyrre prøven.
3. Disseksjon av testikler fra mannlige fluer og montering
- Ta ~ 10 unge mannlige fluer (2-3 dager gamle) og disseker testiklene i live cellemediene for å få ~ 10 par Drosophila voksen testikler.
- Disseker fluene under et disseksjonsmikroskop i en disseksjonsfat ved hjelp av fine tang.
MERK: Drosophila melanogaster (fruktflue) stammen bærer UAS-α-Tubulin-GFP transgene drevet av en tidlig bakteriecelledriver nanos-Gal4. - Generer følgende knock-in Drosophila melanogaster stammer ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologien: Lamin-mCherry (C-terminal tag) og CENP-A-Dendra2-CENP-A [tag på det interne stedet (mellom 118th - 119th codon)].
MERK: Selv om det bare er behov for én test av utmerket kvalitet for hvert eksperiment, vil montering av nok antall vev (15–20) eller celler sikre at det blir minst én sunn prøve med utmerkede fluorescenssignaler for avbildning av tidsforløp.
- Disseker fluene under et disseksjonsmikroskop i en disseksjonsfat ved hjelp av fine tang.
- Vask testiklene to ganger i levende cellemedier i disseksjonsfatet.
- Bruk en pipette til å legge til medier etterfulgt av å fjerne live-cellemediet som et vasketrinn.
- Fjern overflødig vev ved hjelp av tang. Eventuelt ekstra vev vil forstyrre avbildningen.
MERK: Ikke bruk fosfatbufret saltvann (PBS) til vask, fordi det kan påvirke dynamikken i visse cellulære komponenter.
- Tilsett 100-150 μL levende cellemedier i parabolen (tilberedt i trinn 2.1) og spred det på glassoverflaten ved hjelp av en pipettespiss. Spredning av mediet på overflaten vil tillate vevet å holde seg riktig til parabolen.
- Overfør testiklene til retten med fine tang og ta dem med til midten av parabolen (Figur 1A-b).
MERK: Unngå å overføre rusk fordi det vil forstyrre avbildningen og kan redusere kvaliteten på bildet. - Fjern overflødige levende cellemedier (la ca. 10 μL medier) tillate vevet å flate ut og holde seg riktig til parabolen. Utfør dette trinnet raskt for å unngå å tørke prøven.
- Plasser den for-våte membranen (fremstilt i trinn 2.2 og 2.3) på toppen av testiklene (Figur 1A-c).
- Legg 2–3 små plastvekter (fremstilt i trinn 2.4) på membranen slik at prøven ikke flyter og tilsett raskt 100–150 μL levende cellemedier (Figur 1A-d).
MERK: Hvis du legger til medier raskt og forsiktig, sikrer du at prøven ikke tørker ut eller forskyves. - Plasser plastringen (fremstilt i trinn 2.5) på den forhøyede siden av parabolen (Figur 1B-a).
- Plasser en 22 mm x 22 mm deksleslip på toppen av ringen (Figur 1B-b). Dette genererer to kamre.
- Ta et stykke silkepapir, fukt det med vann, virvle det og legg det på dekslene, for å skape et fuktig kammer (Figur 1B-c). Lukk lokket på parabolen (Figur 1B-d) og start levende celleavbildning.
MERK: Hvis prøven er lysfølsom, utfører du avsnitt 3 i mørket.
4. Levende celleavbildning av Drosophila mannlige bakterie stamceller (GSC) in situ
- Plasser fatet under mikroskopet med superoppløsning og fest det med sceneklemmene.
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren, slå på det overførte lyset og bruk 63x objektiv for å fokusere på testisvevet med fokusknappen.
MERK: Hvis det er problemer med å finne en prøve med 63x-målet, må du først bruke 40x- eller 20x-målet før du bytter til 63x. - Slå på laserne, klikk Live, og finn GSC med optimal posisjon og tilstand. Unngå testikler som har et lavt fluorescenssignal eller har navet (nisje) borte fra overflaten.
MERK: I Drosophila-testikler er GSC-ene festet til navet.
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren, slå på det overførte lyset og bruk 63x objektiv for å fokusere på testisvevet med fokusknappen.
- Juster fokuset for GSC-ene og identifiser de riktige innstillingene for prøven, inkludert lasereffekt, elektron-multipliserende (EM) forsterkning, gjennomsnitt og zoom for Airyscan-modus. Bruk følgende innstillinger som et eksempel for Drosophila-testikler som uttrykker EGFP-kodet α-tubulin i bakterieceller i tidlig fase.
- Angi rammestørrelsen mellom 512 x 512 piksler og 1024 x 1024 piksler ved å klikke Rammestørrelse.
- Sett rammegjennomsnittet til 1 eller 2 ved å klikke Gjennomsnitt.
MERK: Hvis du øker rammestørrelsen (>1024 x 1024 piksler) og utfører mer gjennomsnitt (dvs. mer enn 2), kan det føre til fotobleking eller fototoksisitet. - Sett lasereffekten til 1 %–2 % ved å klikke Lasere.
MERK: Hvis du øker laserkraften, kan det også føre til fotobleking eller fototoksisitet. - Angi EM-forsterkningen under det anbefalte nivået (< 800) ved å klikke Hovedforsterkning.
MERK: En høyere EM-gevinst kan generere artefakter. - Zoom inn på området eller cellen av interesse for å redusere bildeanskaffelsestiden og redusere fotobleaching. Dette gjør det også mulig for prøven å overleve i lengre tid.
- Start bildet for tidsforløp ved hjelp av Airyscan-modus ved å klikke Start eksperiment.
- Før du klikker Start eksperiment, må du kontrollere at anskaffelsen er optimalt konfigurert.
- Hvis den viser en advarsel med meldingen "Airyscan acquisition is not configured optimalt", klikker du Optimal i rammestørrelsesdelen, klikker Optimal i z-stack-delen og klikker Optimal for skanneområdedelen (minimum 1,3 zoom kreves for bildebehandling med superoppløsning).
- Optimaliser tidsintervallet, antall z-skiver og varigheten av tidsforløpavbildningen i henhold til eksperimentell design og type prøve, slik at kvaliteten på bildet ikke blir kompromittert og cellene ikke blir arrestert på bestemte stadier av cellesyklusen.
- Som et eksempel vises parametrene for tidsforløpavbildningen av Drosophila-testikler som uttrykker EGFP-merket α-tubulin i tidlig bakterielinje i følgende trinn.
- For mer enn 5 timers tidsforløpavbildning kan du ta bilde med et intervall på 10 minutter med 1 % lasereffekt og ta opptil 30 z-skiver ved hvert tidspunkt.
- For svært dynamiske cellulære prosesser, for eksempel mikrotubuldynamikk, angir du et intervall på 2 minutter mellom tidspunktene, utfører 1–2 timers tidsforløpavbildning med 1 % lasereffekt og tar opptil 30 z-skiver ved hvert tidspunkt.
- For sjeldne cellulære hendelser, for eksempel anafase til tidlig telofasekromatindynamikk (2–3 min), angi levende celleavbildning med et intervall på 1 min mellom tidspunktene, utfør 30 min tidsforløpavbildning ved 1 % lasereffekt, og ta opptil 30 z-skiver til hvert tidspunkt.
MERK: Disse parametrene kan variere for forskjellige prøver, så det vil være nødvendig med endringer for optimal bruk for den spesifikke prøven.
- Utfør enten tidsforløpavbildning eller levende øyeblikksbilde, avhengig av oppløsningen til prøven og den eksperimentelle utformingen.
MERK: En kort film er 15-30 min, og en lang film er mer enn 5 timer. - Hvis prøven er svært følsom og ikke kan studeres ved tidsforløpavbildning med et mikroskop med superoppløsning, slik det ofte er tilfellet med Drosophila mannlige GSC-er, utfører du et live øyeblikksbilde med superoppløsning (SRLS) av prøven på forskjellige cellesyklusstadier (som vist i figur 2, figur 3, figur 4).
- Hvis en sjelden celle biologisk hendelse blir fanget eller proteinet av interesse har lavt uttrykksnivå, så utfør SRLS.
- For SRLS, finn en celle på det spesifikke cellesyklusstadiet du er interessert i. Hvis du for eksempel fokuserer på mikrotubules-kinetochorebinding, bruk deretter en celle ved prometaphase eller metafase.
MERK: Dette vil bidra til å sikre at du får et bilde av høy kvalitet av cellen av interesse til rett tid uten å risikere fototoksisitet for prøven eller bleking av fluoroforene, som kan oppstå under en lengre film. - Hvis du bruker SRLS, kan du avbilde forskjellige cellesyklusstadier av interesse på tvers av flere celler og ordne disse bildene i kronologisk rekkefølge.
MERK: Dette kan brukes til å konstruere en tidsmessig hendelsesrekkefølge samtidig som signal- og vevshelsen maksimeres, for å oppnå utmerket temporal oppløsning av hendelsen for spesielt sensitive prøver eller prøver med lavt signal.
5. Airyscan behandling av live celle bilder
- Etter bildeinnhenting med bildebehandlingsprogramvaren velger du Behandling, Klikker Batchog velger deretter Airyscan Processing.
- Velg bildene som skal behandles, og klikk deretter Kjør/behandle for å hente bildene med superoppløsning.
- Utfør behandlingen ved hjelp av standardinnstillingen.
MERK: Airyscan-behandling vil bare fungere hvis bildeinnstillingene er riktig etablert for Airyscan-avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levende celleavbildning utover diffraksjonsgrensen i Drosophila-vev, spesielt for GSC-er, gir en mulighet til å undersøke dynamikken i subcellulære hendelser i sammenheng med cellesyklusprogresjon. Nylig har en studie som bruker denne protokollen vist at mikrotubule aktiviteter ved mors sentrosom versus datteren sentrosom er temporally asymmetrisk i GSC10. Morsentrosomet utstråler mikrotubuler ca 4 timer før den mititotiske inngangen, mens datterens sentrosom bare utstråler mikrotubuler ved utbruddet av mitose. De svært aktive mikrotubulene fra mors sentrosomet samhandler med atommembranen og induserer polarisert atomkonvoluttbrudd (NEBD). Den lokale NEBD er proksimal til navet og tillater mikrotubuler fra morsentrumsomet å komme inn i kjernen og fortrinnsvis feste seg til den sterkere søstervinetochore og søster centromere for å sikre at de segregerer til den fremtidige stamcellen. Disse observasjonene antyder at det finnes en asymmetrisk mitotisk akse der mikrotubulene, atommembranen, kinetochore og sentromerer samhandler på en romotemporalt kontrollert måte, for å sikre riktig ikke-perandom kromosom segregering til slutt10,11,12.
Hvert av disse resultatene ble støttet ved hjelp av SRLS-tilnærmingen som er skissert her. Ved å utføre levende celleavbildning av Drosophila-testikler som uttrykker α-tubulin-GFP i tidlige bakterieceller, kunne vi identifisere temporal asymmetri i mikrotubulaktivitet i GSC(figur 2). Vi kunne også se den asymmetriske intensiteten av GFP-signaler ved de to sentrosomene som et lysere signal ved modersentrosomet og et relativt svakere signal på dattersentrosomsiden ved hjelp av et spinnende diskkonfokalt mikroskop (Figur 2A). Forskjellen i lysstyrke gjenspeiles sannsynligvis av den tidsmessige asymmetrien av mikrotubulekjernedannelse, men den detaljerte morfologien og mengden mikrotubuler kunne ikke løses ved hjelp av spinnende diskkonfokal mikroskopi (figur 2A). Levende celle superoppløsningsavbildning tillot oss derimot å visualisere morfologien og kvantifisere antall mikrotubuler (figur 2B). Den forbedrede oppløsningen avdekket mønstre av asymmetrisk mikrotubul kjernedannelse, forlengelse og økt interaksjon med atommembranen (Figur 2B). Som eksempler er tidsforløpfilmene til α-tubulin-GFP-uttrykkende GSC-er publisert i en primær forskningsartikkel (Videos S3 og Video S5)10.
Deretter utførte vi live celleavbildning på Drosophila-testikler som uttrykte enten α-Tubulin-GFP med Lamin-mCherry eller α-Tubulin-mCherry med Lamin-GFP i tidlige bakterieceller. Våre resultater viser at asymmetrisk mikrotubulaktivitet sammenfalt med asymmetrisk NEBD i GSC(figur 3). Ved hjelp av det konfokale mikroskopet med spinnende disk kunne vi visualisere den asymmetriske kjernefysiske membraninvaginasjonen, men ikke de enkelte mikrotubulene som direkte kom inn i kjernen (figur 3A). I motsetning til dette tillot denne superoppløsningsteknikken oss å observere disse hendelsene direkte ved å forestille oss både mikrotubulene og kjernefysisk lamina samtidig (Figur 3B).
Deretter utførte vi levende celleavbildning på Drosophila-testikler som uttrykte α-Tubulin-mCherry og CENP-A-Dendra2 eller CENP-A-GFP (Centromere Protein A) i tidlige bakterieceller. For bedre å visualisere mikrotubulen og sentromerfestet, live avbildet vi dem ved lavere temperatur (~ 18 °C) for å stabilisere vedlegget. Om nødvendig kan prøven avkjøles kort med is eller iskalde levende cellemedier i 4-5 minutter for å stabilisere mikrotubule-centromere-vedlegget og depolymerisere eventuelle ikke-festet mikrotubule. Våre resultater viser at mikrotubulene som kommer fra det tidlige aktive morsentrosomet, fortrinnsvis festes til den sterkere søstersenromen (figur 4). Ved hjelp av det konfokale mikroskopet med spinnende disk viste α-Tubulin-mCherry-signalene en asymmetrisk lysstyrke nær de to sentrosomene. Vi kunne også oppdage begge søstersenromer som ett signal, som vist i figur 4A (metafase), men klarte ikke å visualisere mikrotubule-centromere vedlegget (Figur 4A, metafase). I motsetning til dette tillot live-bildet i superoppløsning oss å visualisere mikrotubule-centromere-vedlegget (Figur 4B). Våre resultater viser at mor sentrosom-utstrålende mikrotubuler festes til sentromen før datteren sentrosom-utstrålende mikrotubuler (Figur 4B, tidlig profase).
Figur 1: Ordning for tilberedning og montering av Drosophila testis. (A) Toppvisning: glassbunnscellekulturretten (A-a), overfør Drosophila testis mot midten av parabolen (A-b), plasser en dialysemembran på toppen av testis (A-c), plasser tre plastvekter på dialysemembranen (A-d). (B) Sidevisning: Plasser plastringen på den forhøyede siden av parabolen (B-a), legg en 22 mm × 22 mm deksler på plastringen (B-b), legg et virvel- og vått vevspapir på dekslene (B-c), lukk parabolen med lokket (B-d). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidsforløpbilder av mikrotubule i Drosophila-vev (testikler) som uttrykker α-tubulin-GFP (A) Konvensjonell konfokalmikroskopi levende cellebilde som viser mikrotubuldynamikk i midten av G2-fasen for å metafase. (B) Airyscan mikroskop levende celle bilde som viser asymmetrisk mikrotubule som kommer fra mor versus datter sentrosomer i midten av G2 fase til metafase, med detaljert strukturell informasjon. En tegneserie skildrer Drosophila mannlige bakterie stamcelle. Skala bar: 5μm; stjerne: hub (nisje); grønn pil: mor sentrosom (stamcelle side [M]); rød pil: datter sentrosom (differensierer dattercellesiden [D]); gul pil: sentrosom i spermatogonia celle (forfedre ikke-stamme bakteriecelle); magenta pil: mikrotubule poking i kjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidsforløpbilder av mikrotubule poking-in-aktivitet med superoppløsning og asymmetrisk atomkonvoluttbrudd i Drosophila-vev (testikler) som er medvirkende til å uttrykke Lamin-mCherry og α-Tubulin-GFP. (A) Konvensjonell konfokal mikroskopi levende celle bilde som viser mikrotubule dynamikken fra G2-M fase til mitose. Bilde som viser høyere α-Tubulin-GFP-intensitet på stamcellesiden og samspillet med atommembranen. (B) Airyscan mikroskop levende celle bilde som viser mikrotubule poking-in og asymmetrisk NEBD på stamcellesiden. Skala bar: 5μm; stjerne: hub (nisje); oransje pil: stedet for mikrotubule poking i kjernefysisk membran; magenta pil: mikrotubuler som stikker inn på stamcellesiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidsforløpavbildning av mikrotubul og sentromer i Drosophila-vev (testikler) som uttrykker α-Tubulin-mCherry og CENP-A-Dendra2. (A) Konvensjonell konfokal mikroskopi levende celle bilde som viser mikrotubule og centromere interaksjon fra tidlig profase til metafase. Bilde som viser høyere α-Tubulin-mCherry-intensitet ved stamcellesiden og CENP-A-GFP-signalet. (B) Airyscan mikroskop levende celle bilde som viser mikrotubuler som kommer fra mors sentrosom og feste til sterkere sentromerer i tidlig profase. Ved metafase er sentromerer festet til motsatt pol (bi-orientering). Skala bar: 5μm; stjerne: hub (nisje); magenta pil: kinetochore fiber eller K-fiber (mikrotubuler festet til centromere). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopimetoder med superoppløsning gir romlig oppløsning så høy som 10-tallet med nanometer4,5,6. Mikroskopimetodene STORM og PALM tillater oppløsning på opptil 20 til 50 nm (XY-oppløsning), mens STED-mikroskopi gir en oppløsning på 20 til 100 nm (XY-oppløsning). Den romlige oppløsningen til SIM-mikroskopi er begrenset til 100 til 130 nm15. På grunn av sin høye fotontetthet og lange oppkjøpstid er det imidlertid ekstremt utfordrende å bruke disse teknikkene for levende celleavbildning.
Avbildning av subcellulære strukturer, som cytoskjelett, kromosomer og organeller i levende celler i vev, krever at teknikken er både ultrasensitiv og ikke-invasiv, samtidig som den har høy romlig oppløsning. Den airyskanske superoppløsningsteknikken som presenteres her, kombinerer konfokal avbildning med et 0,2 luftig enhet-hull, sammen med pikselomplassering og dekonvolusjon. Denne teknikken kan oppnå en 1,7 ganger høyere oppløsning enn for konvensjonell konfokal mikroskopi7. ~ 220-230 nm oppløsning av konvensjonell konfektmikroskopi er begrenset av diffraksjonsgrensen for lys, men denne bildeteknikken er i stand til å oppnå omtrent 140 nm XY-oppløsning, som kan sammenlignes med andre mye brukte superoppløsningsteknikker, for eksempel SIM (oppløsning ved 110-120 nm)16.
Tilpasningsevnen og allsidigheten til Airyscan konfokal mikroskopi vil tillate denne protokollen å være anvendelig for ulike andre typer vev og celler for å studere et mangfoldig antall cellebiologiske prosesser7,16. Ved hjelp av denne teknikken kan forskere få tidsforløpbilder på et superoppløsningsnivå for å visualisere cellulær dynamikk med enestående romlige detaljer.
Det kritiske trinnet i denne teknikken er å montere prøven på parabolen slik at den ikke beveger seg eller flyter under tidsforløpavbildning. Å holde prøven nær eller fast på bildeflaten (dvs. glassbunnen på parabolen) er avgjørende for å skaffe bilder med superoppløsning og opprettholde det optimale mikromiljøet for prøven. Dette sikrer at prøven ikke er stresset på grunn av forhold som hypoksi og endringer i temperatur eller fuktighet.
Til tross for nytten av denne protokollen, er det noen få forbehold. Tidsforløpavbildning med Airyscan-modus er en relativt langsom prosess sammenlignet med konvensjonell konfokal mikroskopavbildning. Derfor kan selv det minste fysiske skiftet av prøven føre til dårlig oppløsning. Denne situasjonen kan forhindres ved å bruke en immobiliseringsmetode for å feste prøver til bildeflaten (f.eks. poly L-lysinbelegg eller annet belegg som er kompatibelt med prøven). Også å plassere en dialysemembran på toppen av vevet og legge til noen små vekter som beskrevet i denne protokollen, bidrar til å forhindre vevsbevegelse eller flytende, samtidig som det tillater gassformig utveksling. Tidsforløpavbildningsceller som er plassert dypt i vevet med superoppløsningsmodus, krever høy belysning og kan forårsake fotobleaching. Dette kan minimeres ved å justere antall z-skiver, belysningskraft og gjennomsnittsalgoritme for å oppnå de optimale innstillingene for prøven. Hvis cellen eller vevet er følsomt for lasertoksisitet, hypoksi eller annet stress under avbildning, kan det oppstå cellesyklusstans. Også, hvis et protein har et ekstremt lavt uttrykk, kort halveringstid eller lavt fluorescenssignal, kan det oppstå fotobleaching som vil resultere i et bilde med dårlig kvalitet. Dette kan unngås ved å ta en SRLS, lage en kort film eller ta opp med lange intervaller mellom påfølgende tidspunkter. I tillegg må mikroskopinnstillingen og parameteren for tidsforløpavbildning (som beskrevet i denne protokollen) optimaliseres for å passe til prøven.
Siden det er viktig at prøven ikke beveger seg eller degenereres under prosessen, kan langvarig tidsforløpavbildning som varer over natten eller mer enn en dag uten å gå på kompromiss med bildeoppløsningen være utfordrende.
De eksisterende metodene fokuserer hovedsakelig på å optimalisere mikroskopi- og tidsforløpavbildningsparametrene for superoppløsning separat1,9. Disse metodene gir imidlertid ikke detaljer om prøvepreparerings- eller monteringsparametere, som er avgjørende for å sikre levedyktigheten til prøven og tilpasningsevnen til mikroskopet for å oppnå ønsket superoppløsning under tidsforløpavbildning. I denne metoden har vi optimalisert bildeparametere, prøvepreparering og monteringsparametere slik at tidsforløpavbildning kan utføres i en lengre periode for å skaffe bilder med superoppløsning uten å risikere både degenerasjonen av prøven og oppløsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Integrated Imaging Core-anlegget ved Johns Hopkins University for mikroskoper og programvare for dataanalyse. Vi takker J. Snedeker og Q. E. Yu for korrekturlesing og forslag, og X.C. labmedlemmer for nyttige diskusjoner og forslag. Støttet av NIGMS/NIH R35GM127075, Howard Hughes Medical Institute, David and Lucile Packard Foundation og Johns Hopkins University oppstartsfond (X.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. - 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. - 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
References
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
