Summary
ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。
Abstract
イメージングにおける空間的解像度と時間的解像度の間には、長い間重要なトレードオフがありました。光の回折限界を超えるイメージングは、従来、強力な蛍光シグナルで標識された組織外の固定サンプルまたは生細胞にのみ使用することが制限されてきました。現在の超高解像度ライブセルイメージング技術では、特殊な蛍光プローブ、高い照明、取得後処理を伴う複数の画像取得、またはしばしばこれらのプロセスの組み合わせを使用する必要があります。これらの前提条件は、この技術を適用できる生物学的サンプルおよびコンテキストを大幅に制限します。
ここでは、超分解能(〜140nm XY分解能)の蛍光生細胞イメージングをその時点で行う方法について説明する。この技術はまた、低蛍光強度、例えば、低発現遺伝子で内因的にタグ付けされたEGFPまたはmCherryと互換性がある。原理実証として、ショ ウジョウバエ 精巣の複数の細胞下構造を可視化するためにこの方法を用いてきた。組織の準備中に、細胞構造と組織形態の両方が解剖された精巣内で維持される。ここでは、この技術を用いて、微小管ダイナミクス、微小管と核膜の相互作用、セントロメアへの微小管の付着を画像化します。
この技術は、試料の調製、サンプルの取り付けおよび固定化に特別な手順を必要とします。さらに、標本は、細胞機能および活動を損なうことなく解剖後数時間維持されなければならない。ショ ウジョウバエ の男性生殖細胞幹細胞(GSC)および解剖精巣組織の前駆細胞における生きた超解像イメージングの条件を最適化しましたが、この技術は様々な異なる細胞タイプに広く適用されます。空間的または時間的な解像度を犠牲にすることなく、生理学的条件下で細胞を観察する能力は、細胞生物学における重要な問題に取り組む研究者にとって非常に貴重なツールとして役立ちます。
Introduction
光の回折限界を超える分解能を持つ生細胞における細胞下構造およびタンパク質ダイナミクスの可視化は、典型的には1-3という非常に困難である。確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、光活性化局在化顕微鏡(PALM)、刺激放出破壊(STED)4、5、6顕微鏡検査などの複数の超解像技術が開発されている一方で、検体調製の合併症、および生きている生き物の生存率と活性を維持する必要性、ライブイメージング用の従来の超解像顕微鏡の使用が制限されています。従来の共焦点顕微鏡は、〜230 nmのXY解像度を超える空間解像度に達することができず、複雑な細胞下構造5,6を観察するには不十分であることが多い。しかし、最近の共焦点顕微鏡法の開発では、Airyscan超解像イメージングは、約140nm(XY解像度)7、8を達成することができ、ライブイメージングと互換性のある比較的簡単なサンプル調製物を有する。この撮像検出システムは、長い取得時間を必要とするため、その高い空間分解能は、時間分解能9を犠牲にして来る。したがって、ライブセルイメージングを高い空間分解能で拡張するための方法が必要です。
ここでは、細胞内の細胞構造を詳細な空間情報で解読するための最適な分解能で、インタクト組織で生きた細胞を観察する方法を開発しました。この方法は、サンプルが移動または退行することなく長期間(〜10時間)安定して取り付けることができるように設計されています。この技術で使用される生細胞媒体は細胞機能を支え、超解像顕微鏡の下で10時間までの光の消光を避けることができる。最後に、このプロトコルは、低酸素症、湿度や温度の変化、ならびに栄養の枯渇などの長期間にわたってレーザーの一定の照明によって引き起こされるほとんどのストレスを最小限に抑えます。
このプロトコルを用いてショウジョウバエの生殖細胞幹細胞(GSC)をイメージし、微小管の非対称活性がエピジェネティックに異なる姉妹クロマチド10、11、12、13との優向的相互作用を可能にする方法を観察することができた。これらのタイプの細胞イベントは非常に動的であり、STORM、PALM、STEDなどの他の超解像度イメージング法を使用して、生細胞で視覚化することは非常に困難です。この方法は、組織に存在する生細胞の動的な細胞下構造を理解することを目的として、細胞生物学者にとって非常に有用なものになると予想されます。タンパク質のダイナミクスの研究など、この方法を適用できる多くの分野があります。細胞の動きを理解する。他の可能なアプリケーションの中で、系統トレースと細胞分化プロセス。
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Protocol
1. 生細胞イメージングカクテル(生細胞培地)の調製
- 15%のウシ胎児血清(FBS)と0.6xペニシリン/ストレプトマイシンとシュナイダーの ショウジョウバエ 培地を補う。pH を約 7.0 に調整します。
- 培地を使用する直前に、インスリンを200 μg/mLの最終濃度に加えます。
注:この培地は、タイムラプスイメージング10、14の間に正常な細胞分裂およびショウジョウバエ精巣の発達を維持するために重要です。
ガラス底細胞培養皿の調製
- ショウジョウバエの精巣に直径35mmのポリL-リジンコーティングガラス底細胞培養皿を使用してください。皿の内側の井戸は直径23 mmのガラス底と1mmの高さの側面がある(図1A-a)。
注:より短い作業距離、より大きな数値絞り、および高い倍率の目的を可能にするガラス底皿を選択してください。これらの機能は、超解像度のイメージを取得するために重要です。 - ガス交換を可能にする透析膜(MWCO:12~14kD)を使用します。膜を小さく切ります。
注:膜片は、皿のガラス部分よりも小さいが、標本をカバーするのに十分な大きさでなければなりません。 - 膜に100μLの生細胞培地を5分間浸します。サンプルに乾燥した膜を使用しないでください, それは、それが損傷を受け、.膜は低酸素ストレスを防ぐのに役立ちます。
- 2~3個の軽量ガラスまたはプラスチック片を準備して、組織が浮遊しないように膜に入れます。これを行うには、まず50 mL遠心分離管の外輪を取り、小片に切ります。その後、使用前に70%エタノールで切片を殺菌する。
注: この手順により、イメージング中にサンプルが表面に残り、浮遊することがないようにします。 - 直径25mmのリングを準備し、皿の高い側に置きます。2つの部屋を生成するために、その上にカバースリップを置きます。最下部のチャンバーは、上部のチャンバーは、乾燥からサンプルを防ぐために湿度チャンバーとして機能する間、サンプルが含まれます。
- このリングを作るためには、外側のリングを50 mL遠心管から切り落とし、35mm皿の高い側にしっかりと収まるようにします。同様のリングは、例えば、サンプルに干渉することなくカバースリップを適切に保持するために、皿の高い側に収まるようにゴムバンドまたはプラスチックのツイストタイを使用することによって、他の方法で作ることができます。
注: この手順は、特に低酸素状態や温度や湿度の変化などのストレスに敏感なサンプルに対して重要です。
- このリングを作るためには、外側のリングを50 mL遠心管から切り落とし、35mm皿の高い側にしっかりと収まるようにします。同様のリングは、例えば、サンプルに干渉することなくカバースリップを適切に保持するために、皿の高い側に収まるようにゴムバンドまたはプラスチックのツイストタイを使用することによって、他の方法で作ることができます。
3. 雄のハエと取り付けからの精巣の解剖
- ~10個の若い雄のハエ(生後2~3日)を服用し、生細胞培地で精巣を解剖して、ショ ウジョウバエ の成人精巣の約10組を得る。
- 細かい鉗子を使用して解剖皿の解剖顕微鏡の下でハエを解剖する。
注: ショウジョウバエメラノガスター (フルーツフライ)株は、初期の胚芽細胞ドライバーnanos-Gal4によって駆動されるUAS-α-Tubulin-GFPトランスジーンを運びます。 - CRISPR-Cas9技術を使用して、次のノックイン ショウジョウバエメラノガスター 株を生成します: ラミン-mCherry (C末端タグ) と CENP-A-Dendra2-CENP-A [内部サイトでタグ (118th - 119 番目のコドンの間)].
注:各実験に必要な優れた品質のテストは1つだけですが、十分な数の組織(15〜20)または細胞を取り付けることで、タイムラプスイメージングのための優れた蛍光信号を持つ少なくとも1つの健康なサンプルが存在することを保証します。
- 細かい鉗子を使用して解剖皿の解剖顕微鏡の下でハエを解剖する。
- 解剖皿の生細胞媒体で精巣を2回洗う。
- ピペットを使用して、洗浄工程としてライブセルメディアを取り除いて、培地を追加します。
- 鉗子を使用して余分な組織を除去する。余分な組織はイメージングを妨げる。
注:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、特定の細胞成分のダイナミクスに影響を与える可能性があるため、洗浄に使用しないでください。
- 100~150 μL のライブセルメディアを皿に加え(ステップ 2.1 で作成)、ピペットチップを使用してガラス表面に広げます。表面にメディアを広げると、組織が皿に適切に固執することができます。
- 精巣を細かい鉗子で皿に移し、皿の中央に持って来なさい(図1A-b)。
注: デブリの転送は、画像の妨げとなり、画像の品質が低下する可能性があるため、転送を避けてください。 - 余分な生細胞培地(約10μLの培地を残す)を取り除き、組織が平らになり、皿に適切に付着できるようにします。サンプルの乾燥を避けるために、このステップを迅速に実行します。
- プリウェット膜(ステップ2.2と2.3で準備)を精巣の上に置きます(図1A-c)。
- サンプルが浮かばないように(ステップ2.4で準備された)2~3個の小さなプラスチック重量を膜に入れ、100~150μLの生細胞媒体を素早く加える(図1A-d)。
注:メディアを素早く、穏やかに加えて、サンプルが乾燥したり、変位しないようにします。 - プラスチックリング(ステップ2.5で用意)を皿の高い側に置きます(図1B-a)。
- リングの上に22 mm x 22 mmのカバースリップを置きます(図1B-b)。これは2つの部屋を生成する。
- ティッシュペーパーを取り、水で湿らせ、それを渦巻いてカバースリップに置き、湿気の多いチャンバーを作ります(図1B-c)。皿のふたを閉じて (図 1B-d) ライブセルイメージングを開始します。
注: サンプルが光に敏感な場合は、暗い部分 3 を実行します。
4. ショ ウジョウバエ の生殖細胞幹細胞(GSC)の細胞を生画像化
- 超分解能顕微鏡の下に皿を置き、ステージクランプで固定します。
- イメージングソフトウェアを開き、透過光をオンにし、63xの目的を使用して、フォーカスノブで精巣組織に焦点を当てます。
注:63xの目的でサンプルを見つけるのが難しい場合は、最初に40xまたは20xの目的を使用してから63xに切り替えます。 - レーザーをオンにし、[ ライブ] をクリックして、最適な位置と条件を持つ GSC を見つけます。蛍光信号が低い場合や、表面から離れたハブ(ニッチ)を持つ精巣は避けてください。
注: ショウジョウバエ のテストでは、GSCはハブに取り付けられています。
- イメージングソフトウェアを開き、透過光をオンにし、63xの目的を使用して、フォーカスノブで精巣組織に焦点を当てます。
- GSCの焦点を調整し、レーザーパワー、電子乗算(EM)ゲイン、平均化、Airyscanモードのズームなど、サンプルに適した設定を特定します。初期段階の生殖細胞にタグ付きαチューブリンを発現する ショウジョウバエ 精巣の例として、以下の設定を使用する。
- [フレーム サイズ] をクリックして、512 x 512 ピクセルから 1024 x 1024 ピクセルの 間でフレーム サイズを設定します。
- [ 平均化] をクリックして、フレーム平均を 1 または 2 に設定します。
注:フレームサイズ(>1024 x 1024ピクセル)を大きくして、より多くの平均化(すなわち、2以上)を実行すると、光の漂白または光毒性が生じる可能性があります。 - [レーザー] をクリックして、 レーザーパワーを 1%~2% に設定します。
注:レーザーパワーを高くすると、光の漂白や光毒性を引き起こし得る可能性があります。 - [マスターゲイン]をクリックして、EMゲインを推奨レベル(<800)以下に設定します。
注: EM ゲインが高いほど、アーティファクトが生成される場合があります。 - 対象となる領域またはセルを拡大して、画像取得時間を短縮し、フォトブリーチを減らします。これにより、標本はより長い時間生き残ることができます。
- [テストの開始] をクリックして、Airyscan モードを使用してタイムラプス イメージのキャプチャ を開始します。
- [ 実験の開始] をクリックする前に、取得が最適に構成されていることを確認します。
- 「Airyscan の取得が最適に構成されていません」という警告が表示された場合は、[フレーム サイズで 最適] をクリックし、[Z スタック] セクションの [最適] をクリックして、[スキャン領域に 最適 ] セクションをクリックします (超解像度イメージングには最低 1.3 ズームが必要です)。
- 実験計画と標本の種類に応じて、時間間隔、zスライス数、タイムラプスイメージングの持続時間を最適化し、画像の品質が損なわれず、細胞周期の特定の段階で細胞が逮捕されないようにします。
- 一例として、初期生殖細胞系列におけるEGFPタグ付きαチューブリンを発現する ショウジョウバエ 精巣のタイムラプスイメージングのパラメータを以下の手順で示す。
- 5時間以上のタイムラプスイメージングでは、1%レーザーパワーで10分間隔で画像を撮影し、各時点で最大30 Zスライスを取ります。
- 微小管ダイナミクスなどの非常に動的な細胞プロセスでは、時間間隔を 2 分に設定し、1~ 2 時間のタイムラプスイメージングを 1% レーザーパワーで実行し、各タイム ポイントで最大 30 z スライスを取ります。
- アナフェーズから初期のテロ相クロマチンダイナミクス(2〜3分の事象)のようなまれな細胞事象の場合、タイムポイント間に1分間隔でライブセルイメージングを設定し、1%レーザーパワーで30分のタイムラプスイメージングを行い、各タイムポイントで最大30 zスライスを取ります。
注: これらのパラメータはサンプルによって異なる場合があるため、特定のサンプルに最適な使用のために変更が必要になります。
- サンプルの感度と実験計画に応じて、タイムラプスイメージングまたはライブスナップショットイメージングを実行します。
注:短編映画は15〜30分で、長い映画は5時間以上です。 - サンプルが非常に敏感で、超解像顕微鏡によるタイムラプスイメージングでは研究できない場合、ショウジョウバエオスGSCの場合が多い場合と同様に、異なる細胞周期段階でサンプルの超分解能ライブスナップショット(SRLS)を実行する(図2、図3、図4を参照)。
- 希少な細胞生物学的事象が捕捉されているか、または目的のタンパク質の発現レベルが低い場合は、SRLSを実行する。
- SRLS の場合、興味のある特定のセル・サイクル・ステージでセルを見つけます。例えば、微小管キネトコレ結合に焦点を当てる場合、前転移またはメタフェーズで細胞を使用する。
注:これは、より長い映画の間に発生する可能性のある蛍光HORのサンプルや漂白に光毒性を危険にさらすことなく、適切なタイミングで関心のある細胞の高品質の画像を得るのに役立ちます。 - SRLSを使用する場合は、複数のセル間で目的の異なる細胞周期段階を画像化し、これらの画像を時系列に並べ替えます。
注:これは、信号と組織の健康を最大化しながらイベントの時系列順序を構築するために使用することができ、特に低信号を有する特に敏感なサンプルまたはサンプルのイベントの優れた時間分解能を得るために使用することができる。
5. ライブセル画像のエアリスキャン処理
- イメージング ソフトウェアでイメージを取得した後で、[ 処理]、[ バッチ] の順に選択し 、[Airyscan 処理] を選択します。
- 処理するイメージを選択し、[ 実行/処理 ] をクリックして、超解像度イメージを取得します。
- デフォルト設定を使用して処理を実行します。
メモ:Airyscanの処理は、イメージング設定がAiryscanイメージング用に正しく設定されている場合にのみ機能します。
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Representative Results
ショウジョウバエ組織の回折限界を超えた生細胞イメージングは、特にGSCの場合、細胞周期進行の文脈における細胞内事象のダイナミクスを調査する機会を提供する。最近、このプロトコルを利用した研究では、母中心と娘の中心点での微小管活動がGSC10において時間的に非対称であることを示している。母心部は、有糸の開始の約4時間前に微小管を発するが、娘のセントロソームは、有糸分裂の発症時にしか微小管を発する。母心管からの非常に活性な微小管は核膜と相互作用し、偏極核エンベロープブレークダウン(NEBD)を誘導する。地元のNEBDはハブに近く、母親の中心から微小管が核に入り、より強い姉妹キネトコレと姉妹セントロメアに優先的に付着して、将来の幹細胞に分離することを確実にします。これらの観察は、微小管、核膜、キネトコレ、およびセントロメアが、最終的に10、11、12の適切な非ランダム染色体分離を確実にするために、時空間的に制御された方法で相互作用する非対称の有糸分裂軸が存在することを示唆している。
これらの各結果は、ここで概説する SRLS アプローチを使用してサポートされました。初期の生殖細胞でα-管-GFPを発現する ショウジョウバエ 精巣の実細胞イメージングを行うことにより、GSCにおける微小管活性における時間的非対称性を同定することができた(図2)。また、2つのセントロソームにおけるGFP信号の非対称強度は、回転ディスク共焦点顕微鏡を用いて、母中心体での明るい信号と、娘の中心側の比較的弱い信号として見ることができました(図2A)。明るさの違いは微小管核形成の時間的非対称性によって反映される可能性が高いが、微細管の詳細な形態および量は、紡績円盤共焦点顕微鏡法を用いて解決できなかった(図2A)。対照的に、生細胞超解像イメージングは、形態を可視化し、微小管の数を定量化することを可能にした(図2B)。その改善された解像度は、非対称微小管核形成、伸長、および核膜との相互作用の増加のパターンを明らかにした(図2B)。例として、αチューブリンGFP発現GSCのタイムラプス映画を一次研究論文(ビデオS3及びビデオS5)10に掲載している。
次に、初期段階の生殖細胞において、α-tubulin-GFPとラミン-mCherryまたはα-Tubulin-mCherryのいずれかを共同発現するショウジョウバエ精巣で生細胞イメージングを行った。我々の結果は、非対称微小管活性がGSCにおける非対称NEBDと一致したことを示している(図3)。回転円盤共焦点顕微鏡を用いて、核に直接入った個々の微小管ではなく、非対称核膜のイン膣を可視化することができた(図3A)。対照的に、この生細胞超解像技術は、マイクロチューブと核層の両方を同時にイメージングすることによって、これらの事象を直接観察することを可能にした(図3B)。
次に、初期の胚芽細胞でα-チューブリン-ムチェリーおよびCENP-A-デンドラ2またはCENP-A-GFP(セントロメアプロテインA)を発現するショウジョウバエ精巣に対して生細胞イメージングを行った。微小管とセントロメアの付着をよりよく視覚化するために、我々は彼らの愛着を安定させるために、より低い温度(〜18°C)でそれらを生画像化しました。必要に応じて、サンプルを氷または氷冷ライブセルメディアで4〜5分間短時間冷やして、微小管-セントロメア付着を安定化させ、未接続の微小管を非重合することができます。我々の結果は、初期の活性母中心から発せられる微小管が、より強い姉妹中心に優先的に付着することを示している(図4)。回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して、α-tubulin-mCherry信号は2つのセントロソームの近くに非対称的な明るさを示した。また、図4A(メタフェーズ)に示すように、両方の姉妹セントロメレを1つのシグナルとして検出することができましたが、微小管-セントロメアの付着物を視覚化できませんでした(図4A、メタフェーズ)。これに対し、超解像ライブイメージングにより、微小管-セントロメア付着を可視化することができました(図4B)。我々の結果は、母中心性発式微小管が娘の中心性発性微小管の前にセントロメアに付着することを示している(図4B、早期気相)。
図1:ショウジョウバエ精巣の調製および実装のためのスキーム。(A)トップビュー:ガラス底細胞培養皿(A-a)、ショウジョウバエ精巣を皿の中央(A-b)に向かって移し、精巣の上に透析膜(A-c)を置き、透析膜(A-d)に3つのプラスチック重量を置く。(B)側面:皿の高い側にプラスチックリングを置き(B-a)、プラスチックリング(B-b)に22mm×22mmのカバースリップを置き、カバースリップ(B-c)に渦巻きと湿ったティッシュペーパーを置き、蓋(B-d)で皿を閉じます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ショウジョウバエ組織における微小管ダイナミクスの超解像タイムラプスイメージング(精巣)α-管-GFP(A)は、従来の共焦点顕微鏡用生細胞画像は、G2中期相の微管動態をメタフェーズに示す。(B)エアリスキャン顕微鏡は、詳細な構造情報を含む、G2期中期の母と娘の中心体から母と娘の中心体から発する非対称微小管を示す生細胞画像。漫画は、ショウジョウバエの男性生殖細胞幹細胞を描いています。スケールバー:5μm。アスタリスク: ハブ (ニッチ);緑色の矢印:母セントロソーム(幹細胞側[M]);赤い矢印:娘のセントロソーム(娘細胞側[D]を区別する);黄色の矢印: 精子細胞中の中心 (前駆細胞非幹細胞細胞);マゼンタ矢印:核内の微小管の突き刺し。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ショウジョウバエ組織(精巣)の微小管ポッキングイン活性と非対称核エンベロープ破壊の超分解時間経過イメージングは、ラミン-mCherryおよびα-チューブリン-GFPを共同発現する。(A)従来の共焦点顕微鏡の生細胞画像は、G2-M相から有糸分裂までの微小管ダイナミクスを示す。幹細胞側の高いα-チューブリン-GFP強度および核膜との相互作用を示す画像。(B)細胞側の微小管突起及び非対称NEBDを示すエアリスキャン顕微鏡の生細胞像。スケールバー:5μm。アスタリスク: ハブ (ニッチ);オレンジ色の矢印:核膜中の微小管突起の部位;マゼンタ矢印:幹細胞側に突き刺す微小管。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ショウジョウバエ組織における微小管およびセントロメア付着の超解像時間経過画像(精巣)を発現するα-チューブリン-mCherryおよびCENP-A-Dendra2。(A)従来の共焦点顕微鏡の生細胞画像は、初期の段階から転移までの微小管および中心点の相互作用を示す。幹細胞側とCENP-A-GFP信号における高いα-チューブリン-mCherry強度を示す画像。(B)母心房から発せられる微小管と、早期のプロフェーズにおけるより強い中心点への付着を示す、エアリスキャン顕微鏡の生細胞画像。メタフェーズでは、セントロメアは反対極(二方位)に取り付けられます。スケールバー:5μm。アスタリスク: ハブ (ニッチ);マゼンタ矢印:キネトコレ繊維またはK繊維(セントロメアに付着した微小管)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
超解像顕微鏡法は、ナノメートル4、5、6の10sの高い空間分解能を提供する。STORMおよびPALM顕微鏡法では、最大20~50nm(XY解像度)の分解能が可能で、STED顕微鏡は20~100nm(XY解像度)の分解能を実現します。SIM顕微鏡の空間分解能は100〜130 nm15に制限されています。しかし、高光子密度と長い取得時間のため、これらの技術をライブセルイメージングに使用することは非常に困難です。
細胞骨格、染色体、組織内の生きた細胞の細胞内の細胞下構造、細胞質細胞のイメージングでは、高い空間分解能を持ちながら超高感度と非侵襲性の両方を持つ技術が必要です。ここで紹介する Airyscan 超分解技術は、コンフォーカルイメージングと 0.2 Airy Unit ピンホール、およびピクセルの再割り当てとデコンボリューションを組み合わせたものである。この技術は、従来の共焦点顕微鏡7よりも1.7倍高い解像度を達成することができます。従来の共焦点顕微鏡の〜220〜230nmの解像度は光の回折限界によって制限されるが、この画像化技術は、SIM(110-120 nmでの分解能)などの他の広く使用されている超解像技術に匹敵する約140nmのXY解像度を達成することができる。
Airyscan共焦点顕微鏡の適応性と汎用性により、このプロトコルは、細胞生物学プロセス7,16の多様な数を研究するために、様々な他の種類の組織および細胞に適用可能となる。この技術を用いて、研究者は超解像レベルでタイムラプス画像を取得し、前例のない時空間的な詳細を持つ細胞ダイナミクスを視覚化することができます。
この技術の重要なステップは、タイムラプスイメージング中に移動または浮かないようにサンプルを皿に取り付けることです。試料を撮像面(すなわち、皿のガラス底)に近いまたは貼り付けることは、超解像画像を取得し、サンプルに最適な微小環境を維持するために重要です。これにより、低酸素症や温度や湿度の変化などにより、サンプルがストレスを受けないようにします。
このプロトコルの有用性にもかかわらず、いくつかの注意点があります。Airyscanモードによるタイムラプスイメージングは、従来の共焦点顕微鏡イメージングに比べて比較的遅いプロセスです。したがって、サンプルのわずかな物理的なシフトであっても、解像度が低くなる可能性があります。この状況は、イメージング表面に試料を付着させる固定化法(例えば、ポリL-リジンコーティングまたは試料との適合性の他のコーティング)を用いることで防止できる。また、組織の上に透析膜を配置し、このプロトコルに記載されているようにいくつかの小さな重量を追加すると、ガス交換を可能にしながら、組織の動きや浮遊を防ぐことができます。超解像モードで組織の深部に位置するタイムラプスイメージング細胞は、高い照明を必要とし、光漂白を引き起こす可能性があります。これを最小限に抑えるには、Z スライスの数、照明パワー、および平均アルゴリズムを調整して、サンプルの最適な設定を実現します。細胞または組織がレーザー毒性、低酸素、またはイメージング中の他のストレスに敏感である場合、細胞周期停止が起こる可能性があります。また、タンパク質の発現が極めて低い場合、半減期が短い、または蛍光シグナルが低い場合、光の漂白が発生し、画質が悪くなる可能性があります。これは、SRLSを撮ったり、短い映画を作ったり、連続したタイムポイント間の長い間隔で撮影したりすることで回避できます。さらに、顕微鏡設定とタイムラプスイメージングパラメータ(このプロトコルに記載されているように)は、サンプルに合わせて最適化する必要があります。
サンプルがプロセス中に移動または退化しないことが不可欠であるため、画像解像度を損なうことなく一晩または1日以上続く長時間のタイムラプスイメージングは困難である可能性があります。
既存の方法は、主に超解像顕微鏡とタイムラプスイメージングパラメータを個別に1,9に最適化することに焦点を当てています。しかし、これらの方法は、サンプルの製造または取り付けパラメータに関する詳細を提供していません, これは、サンプルの生存率と顕微鏡の適応性を確保するために重要であり、タイムラプスイメージング中に所望の超解像度を達成するために重要です.この方法では、サンプルの変性と分解の両方を危険にさらすことなく、超解像度画像を取得するために、時間経過イメージングを長期間実行できるように、イメージングパラメータ、サンプル調製および取り付けパラメータを最適化しました。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、ジョンズ・ホプキンス大学の統合イメージング・コア施設に、顕微鏡とデータ分析ソフトウェアに感謝したいと考えています。J.スネデカーとQ.E.ユーに校正と提案、X.Cラボメンバーに有益な議論や提案を感謝します。NIGMS/NIH R35GM127075、ハワードヒューズ医学研究所、デビッドとルシルパッカード財団、ジョンズホプキンス大学のスタートアップファンド(X.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. - 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. - 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
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