Summary
Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.
Abstract
Görüntülemede mekansal ve zamansal çözünürlük arasında uzun zamandır önemli bir denge vardır. Işığın kırınım sınırının ötesinde görüntüleme, geleneksel olarak sadece sabit numunelerde veya güçlü floresan sinyalle etiketlenmiş doku dışındaki canlı hücrelerde kullanılmak üzere kısıtlanmıştır. Mevcut süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme teknikleri, özel floresan problarının, yüksek aydınlatmanın, alım sonrası işlemle birden fazla görüntü alımının veya genellikle bu süreçlerin bir kombinasyonunun kullanılmasını gerektirir. Bu önkoşullar, bu tekniğin uygulanabileceği biyolojik örnekleri ve bağlamları önemli ölçüde sınırlar.
Burada süper çözünürlüklü (~140 nm XY çözünürlüklü) zaman atlamalı floresan canlı hücre görüntüleme in situ gerçekleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik aynı zamanda düşük floresan yoğunluğu ile de uyumludur, örneğin EGFP veya mCherry düşük eksprese genlerde endojen olarak etiketlenmiştir. İlke kanıtı olarak, Drosophila testislerindeki birden fazla hücre altı yapıyı görselleştirmek için bu yöntemi kullandık. Doku hazırlama sırasında, incelenmiş testisler içinde hem hücresel yapı hem de doku morfolojisi korunur. Burada, mikrotübül dinamiklerini, mikrotübüller ve nükleer membran arasındaki etkileşimleri ve mikrotübüllerin merkezkantlara bağlanmasını görüntülemek için bu tekniği kullanıyoruz.
Bu teknik, numune hazırlama, numune montajı ve numunelerin hareketsiz hale alınmasında özel prosedürler gerektirir. Ek olarak, numuneler diseksiyondan sonra hücresel işlevden ve aktiviteden ödün vermeden birkaç saat boyunca tutulmalıdır. Özellikle Drosophila erkek germline kök hücrelerinde (GSC' ler) ve diseksiyonlu testis dokusundaki progenitor mikrop hücrelerinde canlı süper çözünürlüklü görüntüleme koşullarını optimize etmiş olsak da, bu teknik çeşitli hücre tipleri için yaygın olarak geçerlidir. Hücreleri mekansal veya zamansal çözünürlüklerden ödün vermeden fizyolojik koşulları altında gözlemleyebilmeleri, hücre biyolojisinde önemli soruları ele almak isteyen araştırmacılar için paha biçilmez bir araç olarak hizmet edecektir.
Introduction
Canlı hücrelerdeki hücre altı yapıları ve protein dinamiklerini ışığın kırınım sınırının ötesinde çözünürlükle görselleştirmek genellikle çok zordur1-3. Stokastik-Optik Rekonstrüksiyon-Mikroskopi (STORM), Foto-Aktif-Lokalizasyon-Mikroskopi (PALM) ve Uyarılmış Emisyon-Tükenme (STED)4, 5,6mikroskopisi gibi birden fazla süper çözünürlüklü teknik geliştirilirken, numune hazırlamada komplikasyonların yanı sıra canlılık ve aktivite ex vivo'nun korunması ihtiyacı, canlı örneklerin görüntülenmesi için geleneksel süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımını sınırlar. Konvansiyonel konfokal mikroskopi ~ 230 nm XY çözünürlüğünün ötesinde uzamsal çözünürlüğe ulaşamaz ve genellikle karmaşık hücresel alt yapıları gözlemlemek için yetersizdir5,6. Bununla birlikte, konfokal mikroskopide yeni bir gelişme olan Airyscan süper çözünürlüklü görüntüleme, yaklaşık 140 nm (XY çözünürlüklü)7,8 elde edebilir ve canlı görüntüleme ile uyumlu nispeten basit bir örnek preparata sahiptir. Bu görüntüleme algılama sistemi uzun bir alım süresi gerektirdiğinden, yüksek uzamsal çözünürlüğü zamansal çözünürlük9maliyetine gelir. Bu nedenle, canlı hücre görüntülemenin yüksek uzamsal çözünürlükle genişletilmesini sağlamak için bir yönteme ihtiyaç vardır.
Burada, ayrıntılı mekansal bilgilerle hücre altı yapıları deşifre etmek için canlı hücreleri sağlam dokuda en uygun çözünürlükte gözlemlemek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, numunelerin hareket etmeden veya dejenere olmadan uzun bir süre (~ 10 saat) bıçaklanabilmesi için tasarlanmıştır. Bu teknikte kullanılan canlı hücre ortamı hücresel işlevi destekleyebilir ve süper çözünürlüklü bir mikroskop altında 10 saate kadar fotobleachingden kaçınabilir. Son olarak, bu protokol, lazerlerin hipoksi, nem ve sıcaklıktaki değişiklikler ve besin tükenmesi gibi uzun süre boyunca sürekli aydınlatılmasından kaynaklanan çoğu stresi en aza indirir.
Drosophila erkek germline kök hücrelerini (GSC) görüntülemek için bu protokolü kullanarak, mikrotübüllerin asimetrik aktivitesinin epigenetik olarak farklı kardeş kromatizatörleri10 , 11,12,13ile tercihli etkileşime nasıl izin verdiğini gözlemleyebildik. Bu tür hücresel olaylar son derece dinamiktir ve STORM, PALM veya STED gibi diğer süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemlerini kullanarak canlı hücrelerde görselleştirmek çok zordur. Dokularda bulunan canlı hücrelerin dinamik hücre altı yapılarını anlamayı amaçlayan bu yöntemin hücre biyologları için oldukça yararlı hale geleceğini öngörüyoruz. Proteinlerin dinamiklerini incelemek gibi bu yöntemin uygulanabileceği birçok alan vardır; hücrelerin hareketini anlamak; ve diğer olası uygulamaların yanı sıra soy izleme ve hücresel farklılaşma süreçleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Canlı hücre görüntüleme kokteylinin hazırlanması (canlı hücre ortamı)
- Schneider'ın Drosophila ortamını %15 fetal sığır serumu (FBS) ve 0.6x penisilin/streptomisin ile destekleyin. pH'ı yaklaşık 7,0 olarak ayarlayın.
- Ortamı kullanmadan hemen önce, 200 μg / mL'lik son konsantrasyona insülin ekleyin.
NOT: Bu ortam, zaman atlamalı görüntüleme sırasında Drosophila testislerinin normal hücre bölünmesini ve gelişimini korumak için kritik öneme sahiptir10,14.
2. Cam alt hücre kültür çanağının hazırlanması
- Drosophila testisleri için 35 mm çapında bir poli L-lizin kaplı cam-alt hücre kültürü çanağı kullanın. Kabın iç kuyusu 23 mm çapında bir cam tabana ve 1 mm yüksekliğinde bir tarafa sahiptir(Şekil 1A-a).
NOT: Daha kısa çalışma mesafesi, daha büyük sayısal diyafram ve daha yüksek büyütme hedefi sağlayan bir cam tabanlı tabak seçin; bu özellikler süper çözünürlüklü bir görüntü elde etmek için çok önemlidir. - Gaz değişimine izin veren bir diyaliz zarı (MWCO: 12–14kD) kullanın. Zarı küçük parçalar halinde kesin.
NOT: Membran parçaları kabın cam alanından daha küçük ancak numuneyi kaplayacak kadar büyük olmalıdır. - Membranı ~ 5 dakika boyunca 100 μL canlı hücre ortamı ile ıslatın. Numuneye zarar verebileceği için kuru bir zar kullanmayın. Membran hipoksik stresi önlemeye yardımcı olur.
- Dokunun yüzmemesi için zara koymak için 2-3 hafif cam veya plastik parça hazırlayın. Bunu yapmak için, önce 50 mL santrifüj tüpünün dış halkasını alın ve küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra, kullanmadan önce parçaları% 70 etanol ile sterilize edin.
NOT: Bu adım, numunenin görüntüleme sırasında yüzeyde kalmasını ve yüzmemesini sağlar, bu da en iyi sonuçları elde etmek için çok önemlidir. - Yaklaşık 25 mm çapında bir halka hazırlayın ve kabın yükseltilmiş tarafına yerleştirin. İki odacık oluşturmak için üzerine bir kapak kılıfı koyun. Alt oda numuneyi içerirken, üst oda numunenin kurumasını önlemek için bir nem odası görevi görecektir.
- Bu halkayı yapmak için, dış halkayı 35 mm'lik kabın yükseltilmiş tarafına güvenli bir şekilde oturmasını sağlayacak 50 mL santrifüj tüpünden kesin. Benzer bir halka, örneğin, numuneye müdahale etmeden kapak sapını düzgün bir şekilde tutmak için kabın yükseltilmiş tarafına sığacak bir lastik bant veya plastik büküm bağı kullanılarak başka şekillerde de yapılabilir.
NOT: Bu adım, özellikle hipoksik koşullar ve sıcaklık ve nem değişiklikleri gibi gerilmelere duyarlı numuneler için kritik öneme sahiptir.
- Bu halkayı yapmak için, dış halkayı 35 mm'lik kabın yükseltilmiş tarafına güvenli bir şekilde oturmasını sağlayacak 50 mL santrifüj tüpünden kesin. Benzer bir halka, örneğin, numuneye müdahale etmeden kapak sapını düzgün bir şekilde tutmak için kabın yükseltilmiş tarafına sığacak bir lastik bant veya plastik büküm bağı kullanılarak başka şekillerde de yapılabilir.
3. Testislerin erkek sineklerden ve montajdan diseksiyonu
- ~10 genç erkek sinek alın (2-3 günlük) ve ~10 çift Drosophila yetişkin testisi elde etmek için canlı hücre medyasında testisleri inceleyin.
- Sinekleri ince emişler kullanarak bir diseksiyon kabında diseksiyon mikroskobu altında parçalara ayrıştırın.
NOT: Drosophila melanogaster (meyve sineği) suşu, erken mikrop hücresi sürücüsü nanos-Gal4 tarafından tahrik edilen UAS-α-Tubulin-GFP transgene taşır. - CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak aşağıdaki darbe drosophila melanogaster suşlarını oluşturun: Lamin-mCherry (C-terminal etiketi) ve CENP-A-Dendra2-CENP-A [iç sahadaki etiket (118- 119. kodon arasında)].
NOT: Her deney için mükemmel kalitede sadece bir testis gerekirken, yeterli sayıda doku (15-20) veya hücre monte etmek, zaman atlamalı görüntüleme için mükemmel floresan sinyallerine sahip en az bir sağlıklı örnek olmasını sağlayacaktır.
- Sinekleri ince emişler kullanarak bir diseksiyon kabında diseksiyon mikroskobu altında parçalara ayrıştırın.
- Testisleri diseksiyon kabında canlı hücre medyasında iki kez yıkayın.
- Canlı hücre medyasını yıkama adımı olarak kaldırarak ardından medya eklemek için bir pipet kullanın.
- Asalet kullanarak fazla dokuyu çıkarın. Herhangi bir ekstra doku görüntülemeyi bozacaktır.
NOT: Yıkama için fosfat tamponlu salin (PBS) kullanmayın, çünkü bazı hücresel bileşenlerin dinamiklerini etkileyebilir.
- Çanağa 100-150 μL canlı hücre ortamı ekleyin (adım 2.1'de hazırlanır) ve pipet ucu kullanarak cam yüzeye yayın. Ortamı yüzeye yaymak, dokunun çanağa düzgün bir şekilde yapışmasını sağlayacaktır.
- Testisleri ince tokmaklar kullanarak çanağa aktarın ve yemeğin ortasına getirin(Şekil 1A-b).
NOT: Görüntülemeyi engelleyeceğinden ve görüntünün kalitesini düşürebileceğinden enkaz aktarmaktan kaçının. - Dokunun düzleşmesine ve yemeğe düzgün yapışmasına izin vermek için fazla canlı hücre medyasını (yaklaşık 10 μL ortam bırakın) çıkarın. Numunenin kurumasını önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
- Ön ıslatma zarını (adım 2.2 ve 2.3'te hazırlanmış) testislerin üzerine yerleştirin (Şekil 1A-c).
- Membranın üzerine 2-3 küçük plastik ağırlık (Adım 2.4'te hazırlanmıştır) koyun, böylece numune yüzmez ve hızlı bir şekilde 100-150 μL canlı hücre ortamı ekler (Şekil 1A-d).
NOT: Ortamın hızlı ve nazikçe eklenmesi, numunenin kurumasını veya yer değiştirmemesini sağlar. - Plastik halkayı (adım 2,5'te hazırlanmış) kabın yükseltilmiş tarafına yerleştirin(Şekil 1B-a).
- Halkanın üzerine 22 mm x 22 mm kapak kılıfı yerleştirin(Şekil 1B-b). Bu iki odacık oluşturur.
- Nemli bir oda oluşturmak için bir parça kağıt mendil alın, suyla nemlendirin, sonra döndürün ve kapakçığa koyun (Şekil 1B-c). Kabın kapağını kapatın (Şekil 1B-d) ve canlı hücre görüntülemeye başlayın.
NOT: Örnek ışığa duyarlıysa, bölüm 3'ü karanlıkta gerçekleştirin.
4. Drosophila erkek germline kök hücrelerinin (GSC) yerinde canlı hücre görüntülemesi
- Kabı süper çözünürlüklü mikroskobun altına yerleştirin ve sahne kelepçeleriyle sabitleyin.
- Görüntüleme yazılımını açın, iletilen ışığı açın ve odak düğmesiyle testis dokusuna odaklanmak için 63x hedefi kullanın.
NOT: 63x hedefine sahip bir örneği bulmakta zorluk çekiyorsanız, 63x'e geçmeden önce 40x veya 20x hedefini kullanın. - Lazerleri açın, Canlı'yı tıklatın ve GSC'yi en uygun konum ve koşulla bulun. Düşük floresan sinyaline sahip veya hub'ı (niş) yüzeyden uzakta olan testlerden kaçının.
NOT: Drosophila testlerinde GSC'ler hub'a bağlanır.
- Görüntüleme yazılımını açın, iletilen ışığı açın ve odak düğmesiyle testis dokusuna odaklanmak için 63x hedefi kullanın.
- GSC'ler için odağı ayarlayın ve Lazer gücü, elektron çarpma (EM) kazancı, ortalama alma ve Airyscan modu için yakınlaştırma dahil olmak üzere örnek için doğru ayarları tanımlayın. Erken evre mikrop hücrelerinde EGFP etiketli α-tübulin ifade eden Drosophila testisleri için aşağıdaki ayarları örnek olarak kullanın.
- Çerçeve Boyutu 'nu tıklatarak çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel ile 1024 x 1024 piksel arasında ayarlayın.
- Ortalama 'yı tıklatarak çerçeve ortalamasını 1 veya 2 olarak ayarlayın.
NOT: Çerçeve boyutunu artırmak (>1024 x 1024 piksel) ve daha fazla ortalama (yani 2'den fazla) yapmak fotobleaching veya fototoksikliğe neden olabilir. - Lazerler 'i tıklatarak lazer gücünü %1–%2 olarak ayarlayın.
NOT: Lazer gücünün artırılması fotobleaching veya fototoksikiteye de yol açabilir. - Ana Kazanç 'ı tıklatarak EM kazancını önerilen düzeyin (< 800) altına ayarlayın.
NOT: Daha yüksek bir EM kazancı yapıtlar oluşturabilir. - Görüntü alma süresini azaltmak ve fotobleaching'i azaltmak için ilgi çekici bölgeye veya hücreye yakınlaştırın. Bu aynı zamanda numunenin daha uzun süre hayatta kalmasına izin verir.
- Denemeyi Başlat 'ı tıklatarak Airyscan modunu kullanarak zaman atlamalı görüntü yakalamayı başlatın.
- Denemeyi Başlat'ı tıklatmadan önce, edinmenin en iyi şekilde yapılandırıldığından emin olun.
- "Airyscan alma en iyi şekilde yapılandırılmamıştır" uyarısıyla bir uyarı görüntülerse, çerçeve boyutu bölümünde En İyi'yi tıklatın, z yığını bölümünde En İyi'yi tıklatın ve tarama alanı bölümü için En İyi'yi tıklatın (süper çözünürlüklü görüntüleme için en az 1,3 yakınlaştırma gereklidir).
- Zaman aralığını, z-dilim sayısını ve zaman atlamalı görüntüleme süresini deneysel tasarıma ve numune türüne göre optimize edin, böylece görüntünün kalitesinden ödün verilmez ve hücreler hücre döngüsünün belirli aşamalarında tutuklanmaz.
- Örnek olarak, erken mikroplarda EGFP etiketli α-tubulin ifade eden Drosophila testislerinin zaman atlamalı görüntülenmesi için parametreler aşağıdaki adımlarda gösterilmiştir.
- 5 saatten fazla zaman atlamalı görüntüleme için, %1 lazer gücüyle 10 dakika aralıklarla görüntü alın ve her zaman noktasında 30 z dilime kadar alın.
- Mikrotübül dinamikleri gibi son derece dinamik hücresel işlemler için zaman noktaları arasında 2 dakika aralığı ayarlayın, %1 lazer gücünde 1-2 saat hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin ve her zaman noktasında 30 z dilime kadar alın.
- Anafazdan erken telofaz kromatin dinamiklerine (2-3 dakikalık olaylar) gibi nadir hücresel olaylar için, zaman noktaları arasında 1 dakika aralıkla canlı hücre görüntüleme ayarlayın, %1 lazer gücünde 30 dakika zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin ve her zaman noktasında 30 z dilime kadar alın.
NOT: Bu parametreler farklı numuneler için farklılık gösterebilir, bu nedenle belirli bir numune için en iyi kullanım için değişiklik yapılması gerekir.
- Numunenin hassasiyetine ve deneysel tasarıma bağlı olarak zaman atlamalı görüntüleme veya canlı anlık görüntü görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: Kısa bir film 15-30 dakikadır ve uzun bir film 5 saatten fazladır. - Örnek çok hassassa ve drosophila erkek GSC'lerde olduğu gibi süper çözünürlüklü bir mikroskopla zaman atlamalı görüntüleme ile çalışılamazsa, farklı hücre döngüsü aşamalarında numunenin süper çözünürlüklü canlı anlık görüntüsünü (SRLS) gerçekleştirin (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4'tegösterildiği gibi).
- Nadir bir hücre biyolojik olayı yakalanıyorsa veya ilgi çekici protein düşük ifade düzeyine sahipse, SRLS gerçekleştirin.
- SRLS için, ilgilendiğiniz belirli hücre döngüsü aşamasında bir hücre bulun. Örneğin, mikrotübüller-kinetochore bağlamasına odaklanıyorsanız, prometaphaz veya metafazda bir hücre kullanın.
NOT: Bu, daha uzun bir film sırasında ortaya çıkabilecek floroforların örneğine veya ağartılmasına fototoksiklik riski olmadan, ilgi çekici hücrenin yüksek kaliteli bir görüntüsünü doğru zamanda elde etmenize yardımcı olacaktır. - SRLS kullanıyorsanız, birden çok hücrede farklı hücre döngüsü aşamalarını görüntüleyin ve bu görüntüleri kronolojik sırada düzenleyin.
NOT: Bu, sinyal ve doku sağlığını en üst düzeye çıkarırken zamansal bir olay sırası oluşturmak, özellikle hassas numuneler veya düşük sinyalli numuneler için olayın mükemmel zamansal çözünürlüğünü elde etmek için kullanılabilir.
5. Canlı hücre görüntülerinin airyscan işlenmesi
- Görüntüleme yazılımıyla görüntü edindikten sonra, İşleme 'yiseçin, Toplu İş'i tıklatın ve sonra Airyscan İşleme 'yiseçin.
- İşlenecek görüntüleri seçin ve ardından süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için Çalıştır/İşle'yi tıklatın.
- Varsayılan ayarı kullanarak işlemi gerçekleştirin.
NOT: Airyscan işleme, yalnızca görüntüleme ayarları Airyscan görüntüleme için uygun şekilde kurulduğunda çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila dokusunda, özellikle GSC'ler için kırınım sınırının ötesinde canlı hücre görüntüleme, hücre döngüsünün ilerlemesi bağlamında hücre altı olayların dinamiklerini araştırma fırsatı sağlar. Son zamanlarda, bu protokolü kullanan bir çalışma, anne centrozomunda ve kız centrozomunda mikrotübül faaliyetlerinin GSCs10'dazamansal asimetrik olduğunu göstermiştir. Anne merkezkantları mitotik girişe yaklaşık 4 saat kala mikrotübüller yaydırır, kız santrifüj ise sadece mitozun başlangıcında mikrotübüller yaymaktadır. Anne merkezciden gelen son derece aktif mikrotübüller nükleer zarla etkileşime girer ve polarize Nükleer Zarfın Parçalanmasına (NEBD) neden olarak neden ollar. Yerel NEBD, merkeze proksimaldir ve anne merkezden mikrotübüllerin çekirdeğe girmesine ve tercihen gelecekteki kök hücreye ayrılmalarını sağlamak için daha güçlü kardeş kinetochore ve kardeş centromere bağlanmasına izin verir. Bu gözlemler, mikrotübüllerin, nükleer zarların, kinetochore ve centromerlerin, uygun olmayan kromozom ayrımını sağlamak için mekansal olarak kontrol edilen bir şekilde etkileşime girdiği asimetrik bir mitotik eksenin var olduğunugöstermektedir.
Bu sonuçların her biri burada özetlenen SRLS yaklaşımı kullanılarak desteklenmiştir. Erken evre mikrop hücrelerinde α-tubulin-GFP'yi ifade eden Drosophila testislerinin canlı hücre görüntülemesini yaparak, GSC'lerde mikrotübül aktivitesinde zamansal asimetriyi tanımlayabildik (Şekil 2). Ayrıca, iki merkezdeki GFP sinyallerinin asimetrik yoğunluğunu, anne merkezcisinde daha parlak bir sinyal ve dönen bir disk konfokal mikroskobu kullanarak kız merkezkop tarafında nispeten daha zayıf bir sinyal olarak görebildik (Şekil 2A). Parlaklık farkı muhtemelen mikrotübül çekirdeğinin zamansal asimetrisi tarafından yansıtılır, ancak ayrıntılı morfoloji ve mikrotübül miktarı dönen disk konfokal mikroskopisi kullanılarak çözülememiştir (Şekil 2A). Buna karşılık, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, morfolojiyi görselleştirmemize ve mikrotübül sayısını ölçmemize izin verir (Şekil 2B). Geliştirilmiş çözünürlüğü, asimetrik mikrotübül çekirdeklenme, uzama ve nükleer membranla artan etkileşim kalıplarını ortaya çıkardı (Şekil 2B). Örnek olarak, α-tubulin-GFP ifade eden GSC'lerin hızlandırılmış filmleri birincil bir araştırma makalesinde (Videolar S3 ve Video S5)10.
Daha sonra, Drosophila testlerinde lamin-mCherry ile α-Tubulin-GFP veya erken evre mikrop hücrelerinde Lamin-GFP ile α-Tubulin-mCherry ile birlikte canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirdik. Sonuçlarımız asimetrik mikrotübül aktivitesinin GSC'lerde asimetrik NEBD ile çakıştığını göstermektedir (Şekil 3). Eğirme diski konfokal mikroskobu kullanarak, asimetrik nükleer membran invaginasyonunu görselleştirebiliriz, ancak çekirdeğe doğrudan giren bireysel mikrotübülleri görselleştiremedik (Şekil 3A). Buna karşılık, bu canlı hücre süper çözünürlüklü teknik, hem mikrotübülleri hem de nükleer laminayı aynı anda görüntüleyerek bu olayları doğrudan gözlemlememizi sağladı (Şekil 3B).
Daha sonra drosophila testislerinde erken evre mikrop hücrelerinde α-Tubulin-mCherry ve CENP-A-Dendra2 veya CENP-A-GFP (Centromere Protein A) ifade eden canlı hücre görüntülemesi yaptık. Mikrotübül ve centromere ataşmanını daha iyi görselleştirmek için, bağlanmalarını stabilize etmek için daha düşük bir sıcaklıkta (~18 °C) canlı olarak görüntülendik. Gerekirse, numune mikrotübül-centromere ataşmanını stabilize etmek ve eklenmemiş mikrotübülleri depolimerize etmek için 4-5 dakika boyunca buz veya buz gibi canlı hücre ortamı ile kısa bir süre soğutulabilir. Sonuçlarımız, erken aktif anne centrozomundan yayılan mikrotübüllerin tercihen daha güçlü kardeş centromere bağlandığını göstermektedir (Şekil 4). Dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak, α-Tubulin-mCherry sinyalleri iki centrosomes yakınında asimetrik bir parlaklık gösterdi. Ayrıca, Şekil 4A'da (metafaz) gösterildiği gibi her iki kardeş centromere'yi de tek bir sinyal olarak tespit edebildik, ancak mikrotübül-centromere ekini görselleştiremedik (Şekil 4A, metafaz). Buna karşılık, süper çözünürlüklü canlı görüntüleme mikrotübül-centromere ekini görselleştirmemize izin verir (Şekil 4B). Sonuçlarımız, anne merkezkant salınımlı mikrotübüllerin, kız çocuğu centrosome-emaning mikrotübüllerinden önce centromere bağlandığını göstermektedir(Şekil 4B, erken profaz).
Şekil 1: Drosophila testislerinin hazırlanması ve montajı için şema. (A) Üst görünüm: cam-alt hücre kültür çanağı (A-a), Drosophila testislerini yemeğin ortasına (A-b) aktarın, testisin (A-c) üstüne bir diyaliz zarı yerleştirin, diyaliz zarının (A-d) üzerine üç plastik ağırlık yerleştirin. (B) Yanal görünüm: plastik halkayı kabın yükseltilmiş tarafına (B-a) yerleştirin, plastik halkanın üzerine 22 mm × 22 mm kapak kılıfı yerleştirin (B-b), kapakçık (B-c) üzerine bir girdap ve ıslak doku kağıdı koyun, kabı kapakla kapatın (B-d). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Drosophila dokusundaki mikrotübül dinamiklerinin süper çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülenmesi (testisler) α-tubulin-GFP (A)Orta G2 fazında mikrotübül dinamiklerini gösteren geleneksel konfükal mikroskopi canlı hücre görüntüsünü metafaz olarak ifade eder. (B) Airyscan mikroskop canlı hücre görüntüsü, ayrıntılı yapısal bilgilerle, orta G2 fazında anneden kız merkezkrozomlarına karşı yayılan asimetrik mikrotübülleri gösterir. Bir karikatür Drosophila erkek germline kök hücresini tasvir eder. Ölçek çubuğu: 5μm; yıldız işareti: hub (niş); yeşil ok: anne centrosome (kök hücre tarafı [M]); kırmızı ok: kız centrosome (kız hücre tarafı farklılaştırma [D]); sarı ok: spermatogonia hücresinde centrosome (progenitor kök olmayan mikrop hücresi); macenta oku: çekirdekte mikrotübül dürtme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikrotübül dürtme aktivitesinin süper çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülenmesi ve Drosophila dokusunda (testisler) Asimetrik nükleer zarf arızası, Lamin-mCherry ve α-Tubulin-GFP'yi birlikte ifade eder. (A)G2-M fazından mitoza kadar mikrotübül dinamiklerini gösteren geleneksel konfokal mikroskopi canlı hücre görüntüsü. Kök hücre tarafında daha yüksek α-Tubulin-GFP yoğunluğunu ve nükleer membranla etkileşimini gösteren görüntü. (B) Kök hücre tarafında mikrotübül dürtme ve asimetrik NEBD gösteren airyscan mikroskop canlı hücre görüntüsü. Ölçek çubuğu: 5μm; yıldız işareti: hub (niş); turuncu ok: nükleer membranda dürtme mikrotübül yeri; macenta oku: kök hücre tarafında dürden mikrotübüller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Drosophila dokusunda (testislerde) mikrotübül ve centromere bağlanmasının α-Tubulin-mCherry ve CENP-A-Dendra2'yi ifade eden süper çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülenmesi. (A) Erken profazdan metafaza kadar mikrotübül ve centromere etkileşimini gösteren geleneksel konfokal mikroskopi canlı hücre görüntüsü. Kök hücre tarafında daha yüksek α-Tubulin-mCherry yoğunluğu ve CENP-A-GFP sinyali gösteren görüntü. (B) Airyscan mikroskop canlı hücre görüntüsü, anne merkezkantından yayılan mikrotübülleri ve erken profazdaki daha güçlü merkezkromerlere bağlanmayı gösterir. Metafazda, merkezkantlar karşı direğe (çift yönlü) tutturulur. Ölçek çubuğu: 5μm; yıldız işareti: hub (niş); macenta oku: kinetochore lifi veya K-fiber (centromere bağlı mikrotübüller). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri 10s nanometre4, 5,6kadar yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. STORM ve PALM mikroskopi yöntemleri 20 ila 50 nm (XY çözünürlüğü) çözünürlüğe izin verirken, STED mikroskopisi 20 ila 100 nm (XY çözünürlüğü) çözünürlük sunar. SIM mikroskopinin mekansal çözünürlüğü 100 ila 130 nm15ile sınırlıdır. Ancak yüksek foton yoğunluğu ve uzun alım süresi nedeniyle canlı hücre görüntüleme için bu teknikleri kullanmak son derece zordur.
Dokulardaki canlı hücrelerde sitoskeleton, kromozomlar ve organeller gibi hücre altı yapıların görüntülenmesi, tekniğin hem ultra duyarlı hem de noninvaziv olmasını gerektirir. Burada sunulan Airyscan süper çözünürlüklü teknik, konfokal görüntülemeyi 0.2 Airy Unit iğne deliği ile piksel yeniden atama ve dekonvolüsiyon ile birleştirir. Bu teknik, geleneksel konfokal mikroskopi 7'den1,7kat daha yüksek çözünürlük elde edebilir. Geleneksel konfokal mikroskopinin ~ 220-230 nm çözünürlüğü ışığın kırınım sınırı ile kısıtlanır, ancak bu görüntüleme tekniği, SIM (110-120 nm'de çözünürlük)16gibi yaygın olarak kullanılan diğer süper çözünürlük teknikleriyle karşılaştırılabilir yaklaşık 140 nm XY çözünürlüğü elde edebilir.
Airyscan konfokal mikroskopisinin uyarlanabilirliği ve çok yönlülüğü, bu protokolün çeşitli hücre biyolojisi süreçlerini incelemek için diğer çeşitli doku ve hücre türlerine uygulanabilir olmasını sağlayacaktır7,16. Araştırmacılar bu tekniği kullanarak hücresel dinamikleri benzeri görülmemiş mekansal ayrıntılarla görselleştirmek için süper çözünürlük düzeyinde hızlandırılmış görüntüler elde edebilir.
Bu teknikteki kritik adım, numuneyi zaman atlamalı görüntüleme sırasında hareket etmeyecek veya yüzmeyecek şekilde çanağa monte etmektir. Numuneyi görüntüleme yüzeyine (örneğin, kabın cam tabanına) yakın veya yapışmış tutmak, süper çözünürlüklü görüntüler elde etmek ve numune için en uygun mikroçevrimini korumak için kritik öneme sahiptir. Bu, hipoksi ve sıcaklık veya nem değişiklikleri gibi durumlar nedeniyle numunenin strese sokmuyor olmasını sağlar.
Bu protokolün yararlılığına rağmen, birkaç uyarı vardır. Airyscan modu ile hızlandırılmış görüntüleme, geleneksel konfokal mikroskop görüntülemeye kıyasla nispeten yavaş bir işlemdir. Bu nedenle, örneğin en ufak bir fiziksel kayması bile kötü çözünürlüğe neden olabilir. Bu durum, numuneleri görüntüleme yüzeyine (örneğin, poli L-lizin kaplama veya numune ile uyumlu diğer kaplamalar) yapıştırmak için bir hareketsizleştirme yöntemi kullanılarak önlenebilir. Ayrıca, dokunun üzerine diyaliz zarı yerleştirmek ve bu protokolde açıklandığı gibi birkaç küçük ağırlık eklemek, doku hareketini önlemeye veya yüzmeye yardımcı olurken aynı zamanda gaz değişimine izin verir. Süper çözünürlüklü mod ile dokunun derinliklerinde bulunan zaman atlamalı görüntüleme hücreleri yüksek aydınlatma gerektirir ve fotobleachinge neden olabilir. Bu, numune için en uygun ayarları elde etmek için z dilimlerinin sayısını, aydınlatma gücünü ve ortalama algoritmasını ayarlayarak en aza indirilebilir. Hücre veya doku görüntüleme sırasında lazer toksisitesine, hipoksiye veya başka bir strese duyarlıysa, hücre döngüsü durması oluşabilir. Ayrıca, bir protein son derece düşük bir ifadeye, kısa yarı ömretme veya düşük floresan sinyaline sahipse, kötü kalitede bir görüntüye neden olacak fotobleaching oluşabilir. Bu, bir SRLS alarak, kısa bir film yaparak veya ardışık zaman noktaları arasında uzun aralıklarla çekim yaparak önlenebilir. Ayrıca, mikroskop ayarı ve zaman atlamalı görüntüleme parametresi (bu protokolde açıklandığı gibi) örneğe uyacak şekilde en iyi duruma getirilmelidir.
Numunenin işlem sırasında hareket etmemesi veya dejenere olmaması esas olduğundan, görüntü çözünürlüğünden ödün vermeden bir gecede veya bir günden fazla süren uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme zor olabilir.
Mevcut yöntemler esas olarak süper çözünürlüklü mikroskopi ve zaman atlamalı görüntüleme parametrelerini ayrı ayrı optimize etmeye odaklanır1,9. Bununla birlikte, bu yöntemler, numunenin uygulanabilirliğini ve mikroskobun zaman atlamalı görüntüleme sırasında istenen süper çözünürlüğü elde etmek için uyarlanabilirliğini sağlamak için kritik öneme sahip numune hazırlama veya montaj parametreleri ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlamaz. Bu yöntemde görüntüleme parametrelerini, numune hazırlama ve montaj parametrelerini optimize ettik, böylece zaman atlamalı görüntüleme hem numunenin dejenerasyonunu hem de çözünürlüğü riske atmadan süper çözünürlüklü görüntüler elde etmek için uzun bir süre gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.
Acknowledgments
Yazarlar, mikroskoplar ve veri analizi yazılımları için Johns Hopkins Üniversitesi'ndeki Entegre Görüntüleme Çekirdeği tesisine teşekkür eder. Düzeltme ve öneriler için J. Snedeker ve Q. E. Yu'ya ve yardımcı tartışmalar ve öneriler için X.C. laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. NIGMS/NIH R35GM127075, Howard Hughes Tıp Enstitüsü, David ve Lucile Packard Vakfı ve Johns Hopkins Üniversitesi başlangıç fonları (X.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. - 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. - 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
References
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
