Summary
هنا هو بروتوكول فائقة الدقة التصوير بالخلايا الحية في الأنسجة سليمة. لقد قمنا بتوحيد شروط تصوير مجموعة الخلايا الجذعية البالغة الحساسة للغاية في بيئة الأنسجة الأصلية. وتنطوي هذه التقنية على تحقيق التوازن بين الاستبانة الزمنية والمكانية للسماح بالملاحظة المباشرة للظواهر البيولوجية في الأنسجة الحية.
Abstract
كانت هناك منذ فترة طويلة مقايضة حاسمة بين الدقة المكانية والزمنية في التصوير. وقد تم تقليديا التصوير خارج الحد الحيود للضوء يقتصر على استخدامها فقط على عينات ثابتة أو الخلايا الحية خارج الأنسجة المسماة مع إشارة الفلورسنت قوية. تتطلب تقنيات تصوير الخلايا الحية فائقة الدقة الحالية استخدام مسابير مضان خاصة ، أو إضاءة عالية ، أو اكتساب صور متعددة مع معالجة ما بعد الاستحواذ ، أو في كثير من الأحيان مزيج من هذه العمليات. وتحد هذه الشروط المسبقة بشكل كبير من العينات والسياقات البيولوجية التي يمكن تطبيق هذه التقنية عليها.
هنا نحن نصف طريقة لأداء فائقة الدقة (~ 140 نانومتر XY القرار) الوقت الفاصل الزمني التصوير الخلايا الحية في الموقع. هذه التقنية متوافقة أيضا مع كثافة الفلورسنت المنخفضة ، على سبيل المثال ، EGFP أو mCherry الموسومة داخليا في الجينات المعبر عنها بشكل منخفض. كدليل على المبدأ ، استخدمنا هذه الطريقة لتصور هياكل فرعية متعددة في اختبار Drosophila. أثناء إعداد الأنسجة ، يتم الحفاظ على كل من البنية الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة داخل الخصية المشرحة. هنا ، نستخدم هذه التقنية لتصوير ديناميات microtubule ، والتفاعلات بين microtubules والغشاء النووي ، فضلا عن ارتباط microtubules إلى centromeres.
تتطلب هذه التقنية إجراءات خاصة في إعداد العينات وتركيب العينات وشل حركة العينات. بالإضافة إلى ذلك، يجب الحفاظ على العينات لعدة ساعات بعد تشريح دون المساس وظيفة الخلوية والنشاط. في حين أننا قمنا بتحسين ظروف التصوير الحي فائق الدقة على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila (GSCs) والخلايا الجرثومية السلف في أنسجة الخصية تشريح، وهذه التقنية تنطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة. إن القدرة على مراقبة الخلايا في ظل ظروفها الفسيولوجية دون التضحية بالدقة المكانية أو الزمنية ستكون بمثابة أداة لا تقدر بثمن للباحثين الذين يسعون إلى معالجة الأسئلة الحاسمة في بيولوجيا الخلايا.
Introduction
تصور الهياكل دون الخلوية وديناميات البروتين في الخلايا الحية مع القرار وراء حد الحيود للضوء وعادة ما يكون تحديا كبيرا1-3. في حين تم تطوير تقنيات متعددة فائقة الدقة مثل الاستشحات البصري - إعادة الإعمار - المجهر (STORM) ، والتنظير الضوئي المنشط - التعريب الدقيق (PALM) وحفز الانبعاثات - الاستنفاد (STED)4،5،6 المجهر ، والمضاعفات في إعداد العينات ، فضلا عن الحاجة إلى الحفاظ على الجدوى والنشاط في الجسم الحي ، والحد من استخدام المجهر فائقة الدقة التقليدية لتصوير العينات الحية. لا يمكن أن يصل المجهر البؤري التقليدي إلى الدقة المكانية بعد دقة XY ~ 230 نانومتر وغالبا ما يكون غير كاف لمراقبة الهياكل الفرعية الخلوية المعقدة5و6. ومع ذلك ، فإن التطور الأخير في المجهر confocal ، Airyscan فائقة الدقة التصوير ، قادرة على تحقيق ما يقرب من 140 نانومتر (XY القرار)7،8 ولديه إعداد عينة بسيطة نسبيا التي تتوافق مع التصوير الحي. منذ هذا النظام الكشف عن التصوير يتطلب وقتا طويلا اقتناء، قرارها المكانية عالية لا تأتي على حساب القرار الزمني9. لذلك، هناك حاجة إلى طريقة لضمان أن يتم توسيع التصوير بالخلايا الحية مع دقة مكانية عالية.
هنا، طورنا طريقة لمراقبة الخلايا الحية في الأنسجة السليمة بدقتها المثلى لفك الهياكل دون الخلوية مع معلومات مكانية مفصلة. تم تصميم هذه الطريقة على هذا النحو بحيث يمكن تركيب العينات بشكل ثابت لفترة طويلة من الزمن (~ 10 ساعة) دون تحريك أو تدهور. يمكن لوسائط الخلايا الحية المستخدمة في هذه التقنية دعم الوظيفة الخلوية وتجنب الbleaching الضوئي لمدة تصل إلى 10 ساعات تحت المجهر فائق الدقة. وأخيرا، يقلل هذا البروتوكول من معظم الضغوط الناجمة عن الإضاءة المستمرة لأشعة الليزر على مدى فترات طويلة من الزمن مثل نقص الأكسيجة، والتغيرات في الرطوبة ودرجة الحرارة، فضلا عن استنفاد المغذيات.
باستخدام هذا البروتوكول لتصوير Drosophila الذكور الخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs)، كنا قادرين على ملاحظة كيف النشاط غير المتماثل من microtubules يسمح للتفاعل التفضيلي مع الكروماتيدات الشقيقة المتميزة وراثيا10،11،12،13. هذه الأنواع من الأحداث الخلوية هي ديناميكية للغاية ويصعب جدا تصور في الخلايا الحية باستخدام طرق التصوير فائقة الدقة الأخرى مثل العاصفة، بالم، أو الأمراض المنقولة جنسيا. نتوقع أن تصبح هذه الطريقة مفيدة للغاية لعلماء الأحياء الخلية لأنها تهدف إلى فهم الهياكل دون الخلوية الديناميكية للخلايا الحية الموجودة في الأنسجة. هناك العديد من المجالات التي يمكن تطبيق هذه الطريقة على, مثل دراسة ديناميات البروتينات; فهم حركة الخلايا؛ وتتبع النسب وعمليات التمايز الخلوي، من بين تطبيقات أخرى ممكنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد كوكتيل تصوير الخلايا الحية (وسائط الخلية الحية)
- ملحق شنايدر Drosophila المتوسطة مع 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 0.6x البنسلين / العقدية. ضبط درجة الحموضة إلى حوالي 7.0.
- قبل استخدام الوسيطة مباشرة، أضف الأنسولين إلى تركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: هذه الوسائط أمر بالغ الأهمية للحفاظ على انقسام الخلايا الطبيعية وتطوير الخصية Drosophila أثناء التصوير الفاصل الزمني10،14.
2. إعداد طبق زجاج زراعة الخلايا السفلية
- استخدم طبق زراعة الخلايا الزجاجية المغلفة بالزجاج من L-lysine بقطر 35 مم لاختبار Drosophila. البئر الداخلي للطبق لديه قاع زجاجي قطره 23 مم وجانب بارتفاع 1 مم(الشكل 1A-a).
ملاحظة: اختر طبق زجاجي القاع يسمح بمسافة عمل أقصر وفتحة رقمية أكبر وهدف تكبير أعلى؛ هذه الميزات هي حاسمة للحصول على صورة فائقة الدقة. - استخدم غشاء غسيل الكلى (MWCO: 12-14kD) الذي يسمح بالتبادل الغازي. قطع الغشاء إلى قطع صغيرة.
ملاحظة: يجب أن تكون قطع الغشاء أصغر من المساحة الزجاجية للطبق ولكنها كبيرة بما يكفي لتغطية العينة. - نقع الغشاء مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الخلية الحية ل ~ 5 دقيقة. لا تستخدم غشاء جاف على العينة، لأنه قد يضر بها. يساعد الغشاء على منع الإجهاد نقص الأكز.
- إعداد 2-3 الزجاج خفيف الوزن أو قطع بلاستيكية لوضع على الغشاء بحيث الأنسجة لن تطفو. للقيام بذلك، أولا تأخذ الحلقة الخارجية من أنبوب الطرد المركزي 50 مل وقطع عليه إلى قطع صغيرة. ثم قم بتعقيم القطع بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل الاستخدام.
ملاحظة: تضمن هذه الخطوة بقاء العينة على السطح أثناء التصوير وعدم طفوها، وهو أمر حاسم للحصول على أفضل النتائج. - إعداد حلقة ~ 25 ملم في القطر ووضعه في الجانب مرتفعة من الطبق. ضع غطاء عليه لتوليد غرفتين. الغرفة السفلية سوف تحتوي على العينة في حين أن الغرفة العليا ستكون بمثابة غرفة الرطوبة لمنع العينة من التجفيف.
- لجعل هذا الخاتم، وقطع الحلقة الخارجية من أنبوب الطرد المركزي 50 مل، والتي سوف تسمح لها لتناسب بشكل آمن على الجانب مرتفعة من طبق 35 ملم. يمكن إجراء حلقة مماثلة بطرق أخرى ، على سبيل المثال ، باستخدام شريط مطاطي أو ربطة عنق بلاستيكية لتناسب على الجانب المرتفع من الطبق لعقد الغطاء بشكل صحيح دون التدخل في العينة.
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة، خاصة بالنسبة للعينات الحساسة للضغوط مثل حالات نقص الأكز، والتغيرات في درجة الحرارة والرطوبة.
- لجعل هذا الخاتم، وقطع الحلقة الخارجية من أنبوب الطرد المركزي 50 مل، والتي سوف تسمح لها لتناسب بشكل آمن على الجانب مرتفعة من طبق 35 ملم. يمكن إجراء حلقة مماثلة بطرق أخرى ، على سبيل المثال ، باستخدام شريط مطاطي أو ربطة عنق بلاستيكية لتناسب على الجانب المرتفع من الطبق لعقد الغطاء بشكل صحيح دون التدخل في العينة.
3. تشريح الخصيتين من الذباب الذكور وتصاعد
- اتخاذ ~ 10 الذباب الذكور الشباب (2-3 يوم من العمر) وتشريح الخصيتين في وسائل الإعلام الخلية الحية للحصول على ~ 10 أزواج من الخصيتين الكبار Drosophila.
- تشريح الذباب تحت مجهر تشريح في طبق تشريح باستخدام ملقط ناعم.
ملاحظة: سلالة Drosophila melanogaster (ذبابة الفاكهة) يحمل UAS-α-Tubulin-GFP transgene يقودها سائق الخلايا الجرثومية المبكر نانوس-Gal4. - توليد السلالات التالية طرق في Drosophila melanogaster باستخدام التكنولوجيا CRISPR-Cas9: لامين-mCherry (علامة C-المحطة الطرفية) وCENP-A-Dendra2-CENP-A [علامة في الموقع الداخلي (بين 118-119 كودون)].
ملاحظة: في حين أن هناك حاجة إلى اختبار واحد فقط من نوعية ممتازة لكل تجربة، وتركيب عدد كاف من الأنسجة (15-20) أو الخلايا سوف تضمن أنه سيكون هناك عينة صحية واحدة على الأقل مع إشارات مضان ممتازة للتصوير الفاصل الزمني.
- تشريح الذباب تحت مجهر تشريح في طبق تشريح باستخدام ملقط ناعم.
- غسل الخصيتين مرتين في وسائط الخلايا الحية في طبق تشريح.
- استخدام ماصة لإضافة وسائل الإعلام تليها إزالة وسائط الخلية الحية كخطوة الغسيل.
- إزالة الأنسجة الزائدة باستخدام ملقط. أي نسيج إضافي سيتدخل في التصوير.
ملاحظة: لا تستخدم المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) لغسلها، لأنها قد تؤثر على ديناميكيات مكونات خلوية معينة.
- أضف 100-150 ميكرولتر من وسائط الخلايا الحية إلى الطبق (أعد في الخطوة 2.1) ووزعه على السطح الزجاجي باستخدام طرف ماصة. انتشار وسائل الإعلام على السطح سوف تسمح للأنسجة التمسك بشكل صحيح إلى الطبق.
- نقل الخصية إلى الطبق باستخدام ملقط غرامة وتقديمهم إلى وسط الطبق (الشكل 1A-ب).
ملاحظة: تجنب نقل الحطام لأنه سيتداخل مع التصوير وقد يقلل من جودة الصورة. - إزالة وسائل الإعلام الزائدة الخلية الحية (ترك ما يقرب من 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام) للسماح للأنسجة لتسطيح والتمسك بشكل صحيح إلى الطبق. قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب تجفيف العينة.
- ضع الغشاء قبل الرطب (المعد في الخطوة 2.2 و 2.3) فوق الخصية(الشكل 1A-c).
- وضع 2-3 الأوزان البلاستيكية الصغيرة (أعدت في الخطوة 2.4) على الغشاء بحيث العينة لن تطفو وإضافة بسرعة 100-150 ميكروغرام من وسائل الإعلام الخلية الحية (الشكل 1A-D).
ملاحظة: إضافة الوسائط بسرعة وبلطف يضمن أن العينة لن تجف أو تصبح المشردين. - ضع الحلقة البلاستيكية (المعدة في الخطوة 2.5) على الجانب المرتفع من الطبق(الشكل 1B-a).
- ضع غطاء 22 مم × 22 مم أعلى الحلقة (الشكل 1B-b). هذا يولد غرفتين.
- خذ قطعة من ورق الأنسجة، وخففها بالماء، ثم قم بتدليبها ووضعها على الغطاء، لإنشاء غرفة رطبة(الشكل 1B-c). أغلق غطاء الطبق(الشكل 1B-D)وابدأ تصوير الخلايا الحية.
ملاحظة: إذا كان العينة حساسة للضوء، نفذ القسم 3 في الظلام.
4. تصوير الخلايا الحية من الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila (GSC) في الموقع
- ضع الطبق تحت المجهر فائق الدقة وآمنه بمشابك المرحلة.
- فتح برنامج التصوير، بدوره على ضوء المرسلة، واستخدام الهدف 63x للتركيز على النسيج الخصية مع مقبض التركيز.
ملاحظة: إذا كان هناك صعوبة في تحديد موقع عينة مع الهدف 63x ثم أولا استخدام الهدف 40x أو 20x قبل التبديل إلى 63x. - تشغيل الليزر، انقر فوق لايف،والعثور على GSC مع الموقف الأمثل وحالة. تجنب الخصية التي تحتوي على إشارة مضان منخفضة أو التي تحتوي على المحور (المتخصصة) بعيدا عن السطح.
ملاحظة: في الخصيتين Drosophila، يتم إرفاق GSCs بلوحة الوصل.
- فتح برنامج التصوير، بدوره على ضوء المرسلة، واستخدام الهدف 63x للتركيز على النسيج الخصية مع مقبض التركيز.
- ضبط التركيز ل GSCs وتحديد الإعدادات الصحيحة للعينة، بما في ذلك طاقة الليزر، والإلكترونات ضرب (EM) كسب، في المتوسط، والتكبير لوضع Airyscan. استخدم الإعدادات التالية كمثال لاختبارات Drosophila التي تعبر عن EGFP الموسومة α-tubulin في الخلايا الجرثومية في المراحل المبكرة.
- تعيين حجم الإطار بين 512 × 512 بكسل و 1024 × 1024 بكسل عن طريق النقر فوق حجم الإطار.
- تعيين متوسط الإطار إلى 1 أو 2 بالنقر فوق متوسط.
ملاحظة: زيادة حجم الإطار (>1024 × 1024 بكسل) وأداء متوسط أكثر (أي أكثر من 2) يمكن أن يؤدي إلى photobleaching أو phototoxicity. - تعيين طاقة الليزر إلى 1٪-2٪ عن طريق النقر على الليزر.
ملاحظة: قد يؤدي تعزيز طاقة الليزر أيضا إلى bleaching ضوئية أو السمية الضوئية. - تعيين مكاسب EM أدناه المستوى الموصى به (< 800) بالنقر فوق كسب رئيسي.
ملاحظة: قد يؤدي زيادة EM إلى إنشاء قطع أثرية. - قم بتكبير المنطقة أو الخلية ذات الاهتمام لتقليل وقت الحصول على الصورة وتقليل bleaching. وهذا يسمح أيضا للعينة البقاء على قيد الحياة لفترة أطول.
- بدء التقاط الصورة الفاصل الزمني باستخدام وضع Airyscan بالنقر فوق بدء التجربة.
- قبل النقر فوق بدء التجربة،تأكد من تكوين عملية الاستحواذ بالشكل الأمثل.
- إذا كان يعرض تحذيرا مع إشعار "لم يتم تكوين اقتناء Airyscan على النحو الأمثل"، ثم انقر فوق الأمثل في مقطع حجم الإطار، انقر فوق الأمثل في مقطع z-المكدس، وانقر فوق الأمثل لمسح المقطع المنطقة (الحد الأدنى من 1.3 التكبير مطلوب للتصوير فائقة الدقة).
- تحسين الفاصل الزمني وعدد شرائح z ومدة التصوير الفاصل الزمني وفقا للتصميم التجريبي ونوع العينة ، بحيث لا يتم اختراق جودة الصورة ولن يتم القبض على الخلايا في مراحل معينة من دورة الخلية.
- وكمثال على ذلك، تظهر في الخطوات التالية معلمات التصوير الفاصل الزمني لاختبارات دروسوفيلا التي تعبر عن α-توبولين الموسومة ب EGFP في الجرثومة المبكرة.
- لأكثر من 5 ساعة التصوير الفاصل الزمني، صورة على فاصل زمني 10 دقيقة مع 1٪ قوة الليزر واتخاذ ما يصل إلى 30 ض شرائح في كل نقطة زمنية.
- بالنسبة للعمليات الخلوية الديناميكية للغاية، مثل ديناميكيات microtubule، قم بتعيين فاصل زمني قدره دقيقتان بين النقاط الزمنية، وأجر تصويرا بفاصل زمني يتراوح بين 1-2 ساعة بقوة ليزر 1٪، واأخذ ما يصل إلى 30 شريحة z في كل نقطة زمنية.
- بالنسبة للأحداث الخلوية النادرة، مثل ديناميكيات الكروماتين الطوروفي المبكر (أحداث 2-3 دقائق)، قم بتعيين تصوير الخلايا الحية بفاصل زمني قدره دقيقة واحدة بين النقاط الزمنية، وأجر التصوير بفارق زمني قدره 30 دقيقة عند طاقة ليزر 1٪، واأخذ ما يصل إلى 30 شريحة z في كل نقطة زمنية.
ملاحظة: قد تختلف هذه المعلمات لعينات مختلفة، لذلك سوف تكون هناك حاجة إلى التغيير للاستخدام الأمثل للعينة محددة.
- قم إما بالتصوير الفاصل الزمني أو التصوير باللقطات الحية، اعتمادا على حساسية العينة والتصميم التجريبي.
ملاحظة: الفيلم القصير هو 15-30 دقيقة، وفيلم طويل هو أكثر من 5 ساعة. - إذا كانت العينة حساسة جدا ولا يمكن دراستها عن طريق التصوير الفاصل الزمني باستخدام مجهر فائق الدقة ، كما هو الحال في كثير من الأحيان مع Drosophila MALE GSCs ، قم بإجراء لقطة حية فائقة الدقة (SRLS) للعينة في مراحل دورة الخلية المختلفة (كما هو موضح في الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4).
- إذا كان يتم التقاط حدث بيولوجي نادر الخلية أو البروتين من الفائدة لديه مستوى التعبير منخفضة، ثم تنفيذ SRLS.
- لSRLS، والعثور على خلية في مرحلة دورة الخلية محددة كنت مهتما. على سبيل المثال، إذا كان التركيز على ربط microtubules-kinetochore، ثم استخدام خلية في بروميتافاس أو ميتافيزي.
ملاحظة: سيساعد هذا في ضمان حصولك على صورة عالية الجودة للخلية ذات الاهتمام في الوقت المناسب دون المخاطرة بالسمية الضوئية للعينة أو تبييض الفلوروفوريس، والتي قد تحدث خلال فيلم أطول. - إذا كنت تستخدم SRLS، قم بتصوير مراحل مختلفة لدورة الخلية ذات أهمية عبر خلايا متعددة ورتب هذه الصور بترتيب زمني.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا لبناء ترتيب زمني للأحداث مع تعظيم صحة الإشارة والأنسجة ، للحصول على دقة زمنية ممتازة للحدث لعينات حساسة بشكل خاص أو عينات ذات إشارة منخفضة.
5. تجهيز Airyscan من الصور الخلية الحية
- بعد الحصول على الصورة باستخدام برنامج التصوير، حدد معالجة، انقر فوق دفعة، ثم حدد معالجة Airyscan.
- حدد الصور التي ستتم معالجتها ثم انقر فوق تشغيل/عملية للحصول على الصور فائقة الدقة.
- تنفيذ المعالجة باستخدام الإعداد الافتراضي.
ملاحظة: لن تعمل معالجة Airyscan إلا إذا تم إنشاء إعدادات التصوير بشكل صحيح للتصوير Airyscan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر تصوير الخلايا الحية خارج حدود الحيود في أنسجة دروسوفيلا، وخاصة بالنسبة ل GSCs، فرصة للتحقيق في ديناميكيات الأحداث دون الخلوية في سياق تطور دورة الخلية. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة تستخدم هذا البروتوكول أن أنشطة microtubule في مركز الأم مقابل سنتروسوم الابنة غير متماثلة زمنيا في GSCs10. تنبعث النيتروسوم الأم من البيبات الدقيقة قبل حوالي 4 ساعات من دخول الميتوتيك ، في حين أن القنطور الصغير لا ينبثق إلا من الميكروبات في بداية الانقسام. تتفاعل البيبوليتولات النشطة للغاية من المركز الأم مع الغشاء النووي وتحفز على كسر المغلف النووي المستقطب (NEBD). و NEBD المحلية قريبة من المحور ويسمح microtubules من المركزي الأم لدخول النواة ونالت بشكل تفضيلي إلى kinetochore الشقيقة أقوى وشقيقة centromere لضمان أنها فصل إلى الخلايا الجذعية في المستقبل. تشير هذه الملاحظات إلى وجود محور ميتوتي غير متماثل تتفاعل فيه الميكروبات والغشاء النووي وkinetochore وال centromeres بطريقة يتم التحكم فيها بشكل كبير ، من أجل ضمان الفصل السليم للكروموسوم غير الدوم في نهاية المطاف10،11،12.
وقد تم دعم كل من هذه النتائج باستخدام نهج SRLS المبين هنا. من خلال إجراء التصوير بالخلايا الحية من الخصيتين Drosophila التعبير عن α-tubulin-GFP في الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة, كنا قادرين على تحديد عدم التماثل الزمني في نشاط microtubule في GSCs (الشكل 2). كنا قادرين أيضا على رؤية كثافة غير متماثلة من إشارات GFP في اثنين من سنتروسومات كإشارة أكثر إشراقا في سنتروسوم الأم وإشارة أضعف نسبيا في الجانب المركزي ابنة باستخدام المجهر confocal القرص الغزل(الشكل 2A). من المرجح أن ينعكس الفرق في السطوع من خلال عدم التماثل الزمني لنوى microtubule ، ولكن لم يتم حل مورفولوجيا مفصلة وكمية من microtubules باستخدام المجهر confocal القرص الغزل(الشكل 2A). في المقابل، سمح لنا التصوير فائق الدقة للخلايا الحية، بتصور مورفولوجيا وتحديد عدد الخلايا الدقيقة(الشكل 2B). كشف تحليله المحسن عن أنماط من نواة microtubule غير المتماثلة ، استطالة ، وزيادة التفاعل مع الغشاء النووي(الشكل 2B). على سبيل المثال، تم نشر الأفلام الفاصلة زمنيا من α-tubulin-GFP-التعبير عن GSCs في ورقة بحثية أولية (فيديو S3 والفيديو S5)10.
بعد ذلك ، قمنا بتصوير الخلايا الحية على خصيتي Drosophila المشاركة في التعبير إما عن α-Tubulin-GFP مع Lamin-mCherry أو α-Tubulin-mCherry مع Lamin-GFP في الخلايا الجرثومية في المراحل المبكرة. تظهر نتائجنا أن نشاط microtubule غير المتماثل تزامن مع NEBD غير المتماثل في GSCs(الشكل 3). باستخدام المجهر الكونفوجال الغزل القرص، يمكننا تصور الغشاء النووي غير المتماثلة الايحاء ولكن ليس microtubules الفردية التي دخلت مباشرة النواة(الشكل 3A). في المقابل، سمحت لنا تقنية الدقة الفائقة للخلايا الحية هذه بمراقبة هذه الأحداث مباشرة من خلال تصوير كل من الخلايا الدقيقة والصفائح النووية في وقت واحد(الشكل 3B).
بعد ذلك ، قمنا بتصوير الخلايا الحية على اختبارات Drosophila التي تعبر عن α-Tubulin-mCherry و CENP-A-Dendra2 أو CENP-A-GFP (بروتين سنترومير A) في الخلايا الجرثومية في المراحل المبكرة. لتصور أفضل للميكروبول ومرفق سنترومير، ونحن نعيش صورت لهم في درجة حرارة أقل (~ 18 درجة مئوية) لتحقيق الاستقرار في تعلقهم. إذا لزم الأمر، يمكن تبريد العينة لفترة وجيزة مع الثلج أو الجليد البارد وسائل الإعلام الخلية الحية لمدة 4-5 دقائق لتحقيق الاستقرار في مرفق microtubule-centromere وإزالة الطابع المرضي أي microtubule غير مرتبط. تظهر نتائجنا أن microtubules المنبثقة من السنتروسوم الأم النشطة في وقت مبكر نعلق بشكل تفضيلي إلى centromere الشقيقة أقوى(الشكل 4). باستخدام المجهر confocal الغزل القرص، أظهرت إشارات α توبولين-mCherry سطوع غير متماثل بالقرب من اثنين من سنتروسومات. يمكننا أيضا الكشف عن كل من ال سنتروميرس الشقيقة كإشارة واحدة، كما هو مبين في الشكل 4A (ميتافيزي)، ولكن لم تكن قادرة على تصور مرفق microtubule-centromere (الشكل 4A، ميتافيزي). في المقابل ، سمح لنا التصوير الحي فائق الدقة بتصور مرفق microtubule-centromere(الشكل 4B). تظهر نتائجنا أن الأم البيبروسات الدقيقة المنبثقة تعلق على centromere قبل microtubules ابنة سينتروسوم المنبثقة(الشكل 4B، prophase في وقت مبكر).
الشكل 1: مخطط لإعداد وتركيب الخصية دروسوفيلا. (A) عرض أعلى: طبق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي (A-a)، نقل الخصية Drosophila نحو مركز الطبق (A-b)، وضع غشاء غسيل الكلى على الجزء العلوي من الخصية (A-c)، ضع ثلاثة أوزان بلاستيكية على غشاء غسيل الكلى (A-d). (B) عرض الجانبية: وضع حلقة بلاستيكية في الجانب مرتفعة من الطبق (B-A)، ووضع 22 ملم × 22 ملم coverslip على حلقة بلاستيكية (B-B)، ووضع دوامة وورق الأنسجة الرطب على غطاء (B-c)، وإغلاق الطبق مع غطاء (B-D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فائقة الدقة التصوير الفاصل الزمني لديناميات microtubule في الأنسجة Drosophila (الخصيتين) التعبير عن α-tubulin-GFP (A)التقليدية صورة الخلية الحية المجهر confocal تظهر ديناميات microtubule في منتصف مرحلة G2 إلى metaphase. (ب) صورة الخلية الحية مجهر Airyscan تظهر microtubule غير المتماثلة المنبثقة من الأم مقابل ابنة سنتروسومات في منتصف المرحلة G2 إلى ميتافيزي، مع معلومات هيكلية مفصلة. رسم كاريكاتوري يصور الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila. شريط المقياس: 5μm؛ النجمة: محور (مكانة)؛ السهم الأخضر: الأم المركزية (جانب الخلايا الجذعية [M])؛ السهم الأحمر: ابنة سنتروسوم (التمييز بين جانب الخلية ابنة [D]); السهم الأصفر: سنتروسوم في خلية spermatogonia (سلف الخلايا الجرثومية غير الجذعية); السهم أرجواني: microtubule بدس في النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التصوير الفاصل الزمني فائق الدقة لنشاط الوخز بالميكروتبول وانهيار المغلف النووي غير المتماثل في أنسجة دروسوفيلا (الخصيتان) المشارك في التعبير عن لامين - mCherry و α - Tubulin - GFP. (أ) التقليدية صورة الخلية الحية المجهر confocal تظهر ديناميات microtubule من مرحلة G2-M إلى الانقسام. صورة تظهر كثافة أعلى α-توبولين-GFP على جانب الخلايا الجذعية وتفاعلها مع الغشاء النووي. (ب) صورة الخلية الحية مجهر Airyscan تظهر microtubule بدس في و NEBD غير المتماثلة في جانب الخلايا الجذعية. شريط المقياس: 5μm؛ النجمة: محور (مكانة)؛ السهم البرتقالي: موقع microtubule بدس في الغشاء النووي; سهم أرجواني: microtubules التي كزة في جانب الخلايا الجذعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصوير الفاصل الزمني فائق الدقة لمرفق الميكروتبول والقنترومير في أنسجة دروسوفيلا (الخصيتين) معبرا عن α- توبولين - مشيري وCENP-A-Dendra2. (أ) التقليدية صورة الخلية الحية المجهر confocal تظهر microtubule وتفاعل centromere من البروبهاز المبكر إلى ميتافاز. صورة تظهر أعلى كثافة α-توبولين-mCherry في جانب الخلايا الجذعية وإشارة CENP-A-GFP. (ب) صورة الخلايا الحية مجهر Airyscan تظهر microtubules المنبثقة من الأم centrosome والتعلق إلى centromeres أقوى في بروبهاز في وقت مبكر. في الميتاباسي، يتم إرفاق ال سنتروميرس إلى القطب المعاكس (ثنائي الاتجاه). شريط المقياس: 5μm؛ النجمة: محور (مكانة)؛ سهم أرجواني: ألياف كينيتوشور أو K-الألياف (microtubules تعلق على centromere). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر طرق الفحص المجهري فائقة الدقة دقة مكانية عالية يصل إلى 10s من نانومتر4،5،6. تسمح طرق الفحص المجهري STORM و PALM بدقة تصل إلى 20 إلى 50 نانومتر (دقة XY)، في حين يوفر المجهر STED دقة تتراوح بين 20 و100 نانومتر (دقة XY). الدقة المكانية للميكروسكوبي SIM يقتصر على 100 إلى 130 نانومتر15. ومع ذلك ، نظرا لكثافة الفوتون العالية ووقت الاستحواذ الطويل ، فمن الصعب للغاية استخدام هذه التقنيات لتصوير الخلايا الحية.
يتطلب تصوير الهياكل دون الخلوية ، مثل الهيكل الخلوي والكروموسومات والعضويات في الخلايا الحية داخل الأنسجة ، أن تكون التقنية حساسة للغاية وغير جراحية مع الاستمرار في وجود دقة مكانية عالية. تقنية Airyscan فائقة الدقة المعروضة هنا تجمع بين التصوير البؤري مع ثقب وحدة متجدد الهواء 0.2 ، جنبا إلى جنب مع إعادة تعيين بكسل وdeconvolution. هذه التقنية يمكن تحقيق دقة أعلى 1.7x من ذلك من المجهر confocal التقليدية7. يتم تقييد ~ 220-230 نانومتر القرار من المجهر confocal التقليدية من قبل الحد الحيود للضوء، ولكن هذه التقنية التصوير قادرة على تحقيق ما يقرب من 140 نانومتر XY القرار، وهو ما يماثل غيرها من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع فائقة الدقة، مثل SIM (القرار في 110-120 نانومتر)16.
فإن التكيف وبراعة المجهر ايروسكان الكونفولوجيا تسمح لهذا البروتوكول أن تكون قابلة للتطبيق على أنواع أخرى مختلفة من الأنسجة والخلايالدراسةعدد متنوع من عمليات بيولوجيا الخلية 7،16. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للباحثين الحصول على صور الفاصل الزمني على مستوى فائق الدقة لتصور الديناميكيات الخلوية بتفاصيل غير مسبوقة.
الخطوة الحاسمة في هذه التقنية هي تركيب العينة على الطبق بحيث لا تتحرك أو تطفو أثناء التصوير الفاصل الزمني. إن إبقاء العينة قريبة من سطح التصوير أو ملتصقة به (أي القاع الزجاجي للطبق) أمر بالغ الأهمية للحصول على صور فائقة الدقة والحفاظ على البيئة الدقيقة المثلى للعينة. وهذا يضمن عدم إجهاد العينة بسبب حالات مثل نقص الأكسيجة والتغيرات في درجة الحرارة أو الرطوبة.
وعلى الرغم من فائدة هذا البروتوكول، هناك بعض المحاذير. التصوير الفاصل الزمني مع وضع Airyscan هو عملية بطيئة نسبيا مقارنة بالتصوير المجهر البؤري التقليدي. لذلك، حتى أدنى تحول مادي للعينة يمكن أن يؤدي إلى ضعف الدقة. يمكن منع هذا الموقف باستخدام طريقة تعطيل للانضمام عينات إلى سطح التصوير (على سبيل المثال، طلاء بولي L-lysine أو طلاء أخرى متوافقة مع العينة). أيضا، وضع غشاء غسيل الكلى على رأس الأنسجة وإضافة بعض الأوزان الصغيرة كما هو موضح في هذا البروتوكول يساعد على منع حركة الأنسجة أو العائمة مع السماح أيضا لتبادل الغازية. تتطلب خلايا التصوير الفاصلة زمنيا الموجودة في عمق الأنسجة باستخدام وضع الدقة الفائقة إضاءة عالية ويمكن أن تسبب bleaching ضوئية. ويمكن تقليل هذا عن طريق ضبط عدد من شرائح ض، وقوة الإضاءة، خوارزمية في المتوسط لتحقيق الإعدادات المثلى للعينة. إذا كانت الخلية أو النسيج حساسا لسمية الليزر أو نقص الأكسيجة أو أي إجهاد آخر أثناء التصوير، فقد يحدث توقف دورة الخلية. أيضا، إذا كان البروتين لديه تعبير منخفض للغاية، نصف العمر القصير، أو إشارة مضان منخفضة، ثم قد تحدث photobleaching مما سيؤدي إلى صورة ذات نوعية سيئة. ويمكن تجنب ذلك عن طريق اتخاذ SRLS، مما يجعل فيلم قصير، أو اطلاق النار مع فترات طويلة بين النقاط الزمنية المتتالية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تحسين إعداد المجهر والمعلمة التصوير الفاصل الزمني (كما هو موضح في هذا البروتوكول) لتناسب العينة.
نظرا لأنه من الضروري ألا تتحرك العينة أو تتدهور أثناء العملية ، فقد يكون التصوير المطول الذي يدوم بين عشية وضحاها أو أكثر من يوم دون المساس بدقة الصورة أمرا صعبا.
تركز الأساليب الحالية بشكل رئيسي على تحسين الفحص المجهري فائق الدقة ومعلمات التصوير الفاصل الزمني بشكل منفصل1و9. ومع ذلك، لا توفر هذه الطرق تفاصيل بشأن إعداد العينة أو معلمات التركيب، والتي تعتبر حاسمة لضمان صلاحية العينة وقدرة المجهر على التكيف لتحقيق الدقة الفائقة المطلوبة أثناء التصوير الفاصل الزمني. في هذه الطريقة، قمنا بتحسين معلمات التصوير وإعداد العينات والمعلمات المتصاعدة بحيث يمكن إجراء التصوير الفاصل الزمني لفترة طويلة من الزمن للحصول على صور فائقة الدقة دون المخاطرة بكل من انحطاط العينة والدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا مرفق التصوير المتكامل الأساسي في جامعة جونز هوبكنز على المجاهر وبرامج تحليل البيانات. نشكر ج. سنيدكر وس. إ. يو على التدقيق اللغوي والاقتراحات، وأعضاء المختبر .C العاشر على المناقشات والاقتراحات المفيدة. بدعم من NIGMS / NIH R35GM127075 ، ومعهد هوارد هيوز الطبي ، ومؤسسة ديفيد ولوسيل باكارد ، وصناديق الشركات الناشئة في جامعة جونز هوبكنز (X.C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. - 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. - 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
References
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al.
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
