Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Abstract

Er is al lang een cruciale afweging tussen ruimtelijke en temporele resolutie in beeldvorming. Beeldvorming buiten de diffractiegrens van licht is traditioneel beperkt tot alleen te gebruiken op vaste monsters of levende cellen buiten weefsel gelabeld met een sterk fluorescerend signaal. De huidige live celbeeldvormingstechnieken met superresolutie vereisen het gebruik van speciale fluorescentiesondes, hoge verlichting, meerdere beeldverwervingen met verwerking na acquisitie of vaak een combinatie van deze processen. Deze vereisten beperken de biologische monsters en contexten waarop deze techniek kan worden toegepast aanzienlijk.

Hier beschrijven we een methode om superresolutie (~ 140 nm XY-resolutie) time-lapse fluorescentie live celbeeldvorming in situ uit te voeren. Deze techniek is ook compatibel met een lage fluorescerende intensiteit, bijvoorbeeld EGFP of mCherry endogene tagged at lowly expressed genes. Als proof-of-principle hebben we deze methode gebruikt om meerdere subcellulaire structuren in de Drosophila testis te visualiseren. Tijdens weefselvoorbereiding worden zowel de cellulaire structuur als de weefselmorfologie gehandhaafd binnen de ontlede testis. Hier gebruiken we deze techniek om de dynamiek van microtubuli, de interacties tussen microtubuli en het kernmembraan, evenals de aanhechting van microtubuli aan centromeren in beeld te brengen.

Deze techniek vereist speciale procedures bij monstervoorbereiding, monstermontage en immobilisatie van monsters. Bovendien moeten de monsters na dissectie enkele uren worden bewaard zonder de cellulaire functie en activiteit in gevaar te brengen. Hoewel we de omstandigheden voor live superresolutiebeeldvorming specifiek in Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC's) en voorloperkiemcellen in ontleed testisweefsel hebben geoptimaliseerd, is deze techniek breed toepasbaar op een verscheidenheid aan verschillende celtypen. Het vermogen om cellen onder hun fysiologische omstandigheden te observeren zonder in te boeten aan ruimtelijke of temporele resolutie zal dienen als een onschatbaar hulpmiddel voor onderzoekers die cruciale vragen in de celbiologie willen beantwoorden.

Introduction

Het visualiseren van subcellulaire structuren en eiwitdynamiek in levende cellen met een resolutie voorbij de diffractiegrens van licht is meestal zeer uitdagend^1-3. Terwijl meerdere superresolutietechnieken zoals Stochastische-Optische-Reconstructie-Microscopie (STORM), Foto-Geactiveerde-Lokalisatie-Microscopie (PALM) en Gestimuleerde-Emissie-Uitputting (STED)^4,5,6 microscopie zijn ontwikkeld, beperken complicaties in de monstervoorbereiding evenals de noodzaak om levensvatbaarheid en activiteit ex vivo te behouden, het gebruik van conventionele superresolutiemicroscopie voor het weergeven van levende monsters. Conventionele confocale microscopie kan geen ruimtelijke resolutie bereiken die verder gaat dan ~230 nm XY-resolutie en is vaak onvoldoende om ingewikkelde cellulaire substructuren^5,6te observeren . Een recente ontwikkeling in confocale microscopie, Airyscan superresolutiebeeldvorming, kan echter ongeveer 140 nm (XY-resolutie)^7,8 bereiken en heeft een relatief eenvoudig monstervoorbereiding dat compatibel is met live beeldvorming. Aangezien dit beelddetectiesysteem een lange acquisitietijd vereist, gaat de hoge ruimtelijke resolutie ten koste van tijdresolutie⁹. Daarom is een methode nodig om ervoor te zorgen dat live cell imaging wordt uitgebreid met een hoge ruimtelijke resolutie.

Hier ontwikkelden we een methode voor het observeren van levende cellen in intact weefsel met de optimale resolutie om subcellulaire structuren te ontcijferen met gedetailleerde ruimtelijke informatie. Deze methode is zo ontworpen dat monsters gedurende een lange periode (~ 10 uur) stabiel kunnen worden gemonteerd zonder te bewegen of te degenereren. De live celmedia die in deze techniek worden gebruikt, kunnen de cellulaire functie ondersteunen en fotobleaching tot 10 uur vermijden onder een microscoop met superresolutie. Ten slotte minimaliseert dit protocol de meeste spanningen veroorzaakt door de constante verlichting van lasers over langere perioden, zoals hypoxie, veranderingen in vochtigheid en temperatuur, evenals uitputting van voedingsstoffen.

Met behulp van dit protocol om Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC's) in beeld te brengen, konden we observeren hoe de asymmetrische activiteit van microtubuli preferentiële interactie mogelijk maakt met epigenetisch verschillende zusterchromatiden^10,11,12,13. Dit soort cellulaire gebeurtenissen zijn zeer dynamisch en zijn zeer moeilijk te visualiseren in levende cellen met behulp van andere beeldvormingsmethoden met superresolutie, zoals STORM, PALM of STED. We verwachten dat deze methode zeer nuttig zal worden voor celbiologen, omdat ze de dynamische subcellulaire structuren van levende cellen in weefsels willen begrijpen. Er zijn veel gebieden waarop deze methode kan worden toegepast, zoals het bestuderen van de dynamiek van eiwitten; inzicht in de beweging van cellen; en lineage tracing en cellulaire differentiatieprocessen, naast andere mogelijke toepassingen.

Protocol

1. Voorbereiding van live cell imaging cocktail (live cell media)

1. Vul Schneider's Drosophila medium aan met 15% foetale runderserum (FBS) en 0,6x penicilline/streptomycine. Stel de pH in op ongeveer 7,0.
2. Voeg vlak voor het gebruik van het medium insuline toe aan een eindconcentratie van 200 μg/ml.
   OPMERKING: Dit medium is van cruciaal belang voor het handhaven van een normale celdeling en ontwikkeling van de Drosophila-testis tijdens time-lapse beeldvorming^10,14.

2. Bereiding van glazen bodemcelkweekschaal

1. Gebruik een poly L-lysine gecoate glasbodemcelkweekschaal met een diameter van 35 mm voor de Drosophila testis. De binnenput van de schotel heeft een glazen bodem met een diameter van 23 mm en een zijde met een hoogte van 1 mm (figuur 1A-a).
   OPMERKING: Kies een schotel met glazen bodem die een kortere werkafstand, een groter numeriek diafragma en een hogere vergrotingsdoelstelling mogelijk maakt; deze functies zijn cruciaal om een afbeelding met een superresolutie te verkrijgen.
2. Gebruik een dialysemembraan (MWCO: 12–14kD) dat de gasvormige uitwisseling mogelijk maakt. Snijd het membraan in kleine stukjes.
   OPMERKING: De membraanstukken moeten kleiner zijn dan het glasoppervlak van de schaal, maar groot genoeg om het monster te bedekken.
3. Week het membraan met 100 μL levende celmedia gedurende ~ 5 minuten. Gebruik geen droog membraan op het monster, omdat dit het kan beschadigen. Membraan helpt hypoxische stress te voorkomen.
4. Bereid 2-3 lichtgewicht glazen of plastic stukken voor om op het membraan te leggen, zodat het weefsel niet zal drijven. Om dit te doen, neemt u eerst de buitenste ring van de 50 ml centrifugebuis en snijdt u deze in kleine stukjes. Steriliseer vervolgens de stukken voor gebruik met 70% ethanol.
   OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat het monster tijdens de beeldvorming op het oppervlak blijft en niet drijft, wat cruciaal is voor het verkrijgen van optimale resultaten.
5. Maak een ring met een diameter van ~ 25 mm en plaats deze aan de verhoogde kant van de schaal. Doe er een deklip op om twee kamers te genereren. De onderste kamer bevat het monster, terwijl de bovenste kamer zal dienen als een vochtigheidskamer om te voorkomen dat het monster droogt.
   1. Om deze ring te maken, snijdt u de buitenste ring af van een centrifugebuis van 50 ml, waardoor deze stevig aan de verhoogde kant van de 35 mm-schotel past. Een vergelijkbare ring kan op andere manieren worden gemaakt, bijvoorbeeld door een elastiekje of plastic twistband te gebruiken om op de verhoogde kant van de schaal te passen om de hoeslip goed vast te houden zonder het monster te verstoren.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, vooral voor monsters die gevoelig zijn voor spanningen zoals hypoxische omstandigheden en veranderingen in temperatuur en vochtigheid.

3. Dissectie van teelballen van mannelijke vliegen en montage

1. Neem ~ 10 jonge mannelijke vliegen (2-3 dagen oud) en ontleed de teelballen in de levende celmedia om ~ 10 paar Drosophila volwassen teelballen te verkrijgen.
   1. Ontleed de vliegen onder een dissectiemicroscoop in een dissectieschaal met behulp van fijne tang.
      OPMERKING: De Drosophila melanogaster (fruitvlieg) stam draagt UAS-α-Tubulin-GFP transgene aangedreven door een vroege kiemcel driver nanos-Gal4.
   2. Genereer de volgende knock-in Drosophila melanogaster stammen met behulp van de CRISPR-Cas9 technologie: Lamin-mCherry (C-terminal tag) en CENP-A-Dendra2-CENP-A [tag op de interne site (tussen 118e - 119e codon)].
      OPMERKING: Hoewel er slechts één testis van uitstekende kwaliteit nodig is voor elk experiment, zal het monteren van voldoende weefsel (15-20) of cellen ervoor zorgen dat er ten minste één gezond monster zal zijn met uitstekende fluorescentiesignalen voor time-lapse beeldvorming.
2. Was de teelballen tweemaal in levende celmedia in de dissectieschaal.
   1. Gebruik een pipet om media toe te voegen, gevolgd door het verwijderen van de live celmedia als wasstap.
   2. Verwijder overtollig weefsel met een tang. Elk extra weefsel zal de beeldvorming verstoren.
      OPMERKING: Gebruik geen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen, omdat dit de dynamiek van bepaalde cellulaire componenten kan beïnvloeden.
3. Voeg 100-150 μL levende celmedia toe aan de schaal (bereid in stap 2.1) en verdeel deze over het glasoppervlak met behulp van een pipetpunt. Door de media op het oppervlak te verspreiden, kan het weefsel goed aan de schaal blijven plakken.
4. Breng de teelballen met een fijne tang over in de schaal en breng ze naar het midden van de schaal (afbeelding 1A-b).
   OPMERKING: Vermijd het overbrengen van vuil omdat het de beeldvorming verstoort en de kwaliteit van het beeld kan verminderen.
5. Verwijder overtollige levende celmedia (laat ongeveer 10 μL media achter) zodat het weefsel kan afvlakken en goed aan de schaal kan blijven plakken. Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat het monster wordt gedroogd.
6. Plaats het voorwettelijke membraan (voorbereid in stap 2.2 en 2.3) bovenop de teelballen (figuur 1A-c).
7. Leg 2-3 kleine plastic gewichten (bereid in stap 2.4) op het membraan, zodat het monster niet drijft en voeg snel 100-150 μL levende celmedia toe (figuur 1A-d).
   OPMERKING: Het snel en voorzichtig toevoegen van media zorgt ervoor dat het monster niet uitdroogt of wordt verplaatst.
8. Plaats de plastic ring (bereid in stap 2.5) op de verhoogde zijde van de schaal (Afbeelding 1B-a).
9. Plaats een afdeklip van 22 mm x 22 mm op de ring (afbeelding 1B-b). Dit genereert twee kamers.
10. Neem een stuk tissuepapier, bevochtig het met water, wervel het en leg het op de coverslip, om een vochtige kamer te creëren (Figuur 1B-c). Sluit het deksel van de schaal (afbeelding 1B-d) en begin met live celbeeldvorming.
    OPMERKING: Als het monster lichtgevoelig is, voert u sectie 3 in het donker uit.

4. Live cel beeldvorming van Drosophila mannelijke kiembaan stamcellen (GSC) in situ

1. Plaats de schotel onder de superresolutiemicroscoop en zet deze vast met de podiumklemmen.
   1. Open de beeldvormingssoftware, schakel het verzonden licht in en gebruik 63x objectief om met de scherpstelknop op het testisweefsel te focussen.
      OPMERKING: Als het moeilijk is om een monster met de 63x-doelstelling te lokaliseren, gebruik dan eerst de 40x- of 20x-doelstelling voordat u overschakelt naar de 63x.
   2. Schakel de lasers in, klik op Liveen zoek het SGR met de optimale positie en conditie. Vermijd teelballen met een laag fluorescentiesignaal of laat de naaf (nis) van het oppervlak verwijderd zijn.
      OPMERKING: In Drosophila-testes zijn de GSC's aan de hub bevestigd.
2. Pas de scherpstelling voor de GSC's aan en identificeer de juiste instellingen voor het monster, waaronder laservermogen, elektronenvermenigvuldiging (EM) versterking, middeling en zoom voor de Airyscan-modus. Gebruik de volgende instellingen als voorbeeld voor Drosophila-teelballen die EGFP-gelabelde α-tubuline in kiemcellen in een vroeg stadium uitdrukken.
   1. Stel de framegrootte in tussen 512 x 512 pixels en 1024 x 1024 pixels door op Framegroottete klikken.
   2. Stel het framegemiddelde in op 1 of 2 door op Gemiddeld teklikken .
      OPMERKING: Het vergroten van de framegrootte (>1024 x 1024 pixels) en het uitvoeren van meer middeling (d.w.z. meer dan 2) kan leiden tot fotobleaching of fototoxiciteit.
   3. Stel het laservermogen in op 1%-2% door op Laserste klikken.
      OPMERKING: Het verhogen van de laserkracht kan ook leiden tot fotobleaching of fototoxiciteit.
   4. Stel de EM-versterking in onder het aanbevolen niveau (< 800) door op Master Gainte klikken.
      OPMERKING: Een hogere EM-versterking kan artefacten genereren.
   5. Zoom in op de regio of cel van belang om de tijd voor het verkrijgen van afbeeldingen te verkorten en fotobleaching te verminderen. Hierdoor kan het exemplaar ook langer overleven.
3. Start de time-lapse-afbeeldingsopname met de Airyscan-modus door op Experiment startente klikken.
   1. Voordat u op Experiment startenklikt, moet u ervoor zorgen dat de acquisitie optimaal is geconfigureerd.
   2. Als er een waarschuwing wordt weergegeven met de melding "Airyscan-acquisitie is niet optimaal geconfigureerd", klikt u op Optimaal in de sectie framegrootte, klikt u op Optimaal in de z-stacksectie en klikt u op Optimaal voor de sectie Scangebied (minimaal 1,3 zoom is vereist voor beeldvorming met superresolutie).
4. Optimaliseer het tijdsinterval, het aantal z-slices en de duur van de time-lapse-beeldvorming volgens het experimentele ontwerp en het type specimen, zodat de kwaliteit van het beeld niet in gevaar komt en de cellen niet worden gearresteerd in bepaalde stadia van de celcyclus.
   1. Als voorbeeld worden de parameters voor de time-lapse-beeldvorming van Drosophila-teelballen die EGFP-gelabelde α-tubuline in vroege kiembaan uitdrukken, in de volgende stappen weergegeven.
   2. Voor meer dan 5 uur time-lapse beeldvorming, beeld op een interval van 10 minuten met 1% laservermogen en neem tot 30 z-slices op elk tijdstip.
   3. Voor zeer dynamische cellulaire processen, zoals microtubulidynamiek, stelt u een interval van 2 minuten in tussen tijdpunten, voert u 1-2 uur time-lapse-beeldvorming uit met 1% laservermogen en neemt u maximaal 30 z-slices in op elk tijdspunt.
   4. Voor zeldzame cellulaire gebeurtenissen, zoals anafase tot vroege telophase chromatine dynamica (2-3 min gebeurtenissen), stel live cel beeldvorming in met een interval van 1 min tussen tijdspunten, voer 30 min time-lapse beeldvorming uit met 1% laservermogen en neem tot 30 z-slices op elk tijdstip.
      OPMERKING: Deze parameters kunnen variëren voor verschillende monsters, dus wijziging is nodig voor optimaal gebruik van het specifieke monster.
5. Voer timelapse-beeldvorming of live snapshot-beeldvorming uit, afhankelijk van de gevoeligheid van het monster en het experimentele ontwerp.
   OPMERKING: Een korte film duurt 15-30 minuten en een lange film is meer dan 5 uur.
6. Als het monster zeer gevoelig is en niet kan worden bestudeerd door time-lapse-beeldvorming met een superresolutiemicroscoop, zoals vaak het geval is bij drosophila mannelijke GSC's, voert u een live snapshot met superresolutie (SRLS) van het monster uit in verschillende celcyclusstadia (zoals weergegeven in figuur 2, figuur 3, figuur 4).
   1. Als een zeldzame celbiologische gebeurtenis wordt vastgelegd of het eiwit van belang een laag expressieniveau heeft, voer dan SRLS uit.
   2. Zoek voor SRLS een cel in de specifieke celcyclusfase waarin u geïnteresseerd bent. Als u zich bijvoorbeeld concentreert op microtubuli-kinetochorebinding, gebruik dan een cel bij prometafase of metafase.
      OPMERKING: Dit zal helpen ervoor te zorgen dat u op het juiste moment een hoogwaardig beeld krijgt van de cel die van belang is zonder het risico van fototoxiciteit voor het monster of het bleken van de fluoroforen, die kunnen optreden tijdens een langere film.
   3. Als u SRLS gebruikt, geeft u verschillende celcyclusfasen van belang weer voor meerdere cellen en rangschikt u deze afbeeldingen in chronologische volgorde.
      OPMERKING: Dit kan worden gebruikt om een temporele volgorde van gebeurtenissen te construeren terwijl de signaal- en weefselgezondheid wordt gemaximaliseerd, om een uitstekende temporele resolutie van de gebeurtenis te verkrijgen voor bijzonder gevoelige monsters of monsters met een laag signaal.

5. Airyscan verwerking van de live celbeelden

1. Selecteer Na het verkrijgen van afbeeldingen met de imagingsoftware de optie Processing, klik op Batchen selecteer vervolgens Airyscan Processing.
   1. Selecteer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt en klik vervolgens op Uitvoeren/verwerken om de afbeeldingen met een superresolutie te verkrijgen.
   2. Voer de verwerking uit met de standaardinstelling.
      OPMERKING: Airyscan-verwerking werkt alleen als de beeldvormingsinstellingen correct zijn ingesteld voor Airyscan-beeldvorming.

Representative Results

Live cell imaging voorbij de diffractielimiet in Drosophila weefsel, vooral voor GSC's, biedt de mogelijkheid om de dynamiek van subcellulaire gebeurtenissen in de context van celcyclusprogressie te onderzoeken. Onlangs heeft een studie die dit protocol gebruikt aangetoond dat microtubuli bij het moeder-centrosoom versus het dochter-centrosoom tijdelijk asymmetrisch zijn in GSC's¹⁰. Het moeder-centrosoom straalt ongeveer 4 uur voor de mitotische ingang microtubuli uit, terwijl het dochter-centrosoom alleen microtubuli uitstraalt bij het begin van mitose. De zeer actieve microtubuli van het moeder-centrosoom interageren met het kernmembraan en veroorzaken gepolariseerde Nuclear Envelope Break Down (NEBD). De lokale NEBD is proximaal aan de hub en stelt microtubuli van het moeder-centrosoom in staat om de kern binnen te dringen en zich bij voorkeur te hechten aan de sterkere zusterkinetochore en zuster centromeer om ervoor te zorgen dat ze zich scheiden naar de toekomstige stamcel. Deze waarnemingen suggereren dat er een asymmetrische mitotische as bestaat waarin de microtubuli, het kernmembraan, kinetochore en centromeren op een spatiotemporale gecontroleerde manier interageren, om een goede nonrandom-chromosoomsegregatie uiteindelijk^10,11,12te garanderen .

Elk van deze resultaten werd ondersteund met behulp van de hier beschreven SRLS-aanpak. Door live celbeeldvorming uit te voeren van Drosophila-teelballen die α-tubuline-GFP uitdrukken in kiemcellen in een vroeg stadium, konden we temporele asymmetrie in microtubuliactiviteit in GSC's identificeren (figuur 2). We konden ook de asymmetrische intensiteit van GFP-signalen bij de twee centrosomen zien als een helderder signaal bij het moeder-centrosoom en een relatief zwakker signaal aan de dochter-centrosoomzijde met behulp van een draaiende schijfconocale microscoop (figuur 2A). Het verschil in helderheid wordt waarschijnlijk weerspiegeld door de temporele asymmetrie van microtubulinucleatie, maar de gedetailleerde morfologie en hoeveelheid microtubuli konden niet worden opgelost met behulp van confocale microscopie van de draaiende schijf (figuur 2A). Daarentegen stelde live cell superresolutiebeeldvorming ons in staat om de morfologie te visualiseren en het aantal microtubuli te kwantificeren (Figuur 2B). De verbeterde resolutie onthulde patronen van asymmetrische microtubulinucleatie, rek en verhoogde interactie met het kernmembraan (figuur 2B). Als voorbeeld zijn de timelapsefilms van α-tubuline-GFP-expresserende GSC's gepubliceerd in een primair onderzoeksdocument (Video's S3 en Video S5)¹⁰.

Vervolgens voerden we live celbeeldvorming uit op Drosophila-teelballen die α-Tubulin-GFP met Lamin-mCherry of α-Tubulin-mCherry met Lamin-GFP in kiemcellen in een vroeg stadium uitdrukken. Onze resultaten tonen aan dat asymmetrische microtubuliactiviteit samenviel met asymmetrische NEBD in GSC's (figuur 3). Met behulp van de confocale microscoop met spinschijf konden we de asymmetrische invaginatie van het kernmembraan visualiseren, maar niet de individuele microtubuli die direct in de kern kwamen (figuur 3A). Deze superresolutietechniek voor levende cellen stelde ons daarentegen in staat om deze gebeurtenissen direct te observeren door zowel de microtubuli als de nucleaire lamina tegelijkertijd in beeld te brengen (figuur 3B).

Vervolgens voerden we live celbeeldvorming uit op Drosophila-teelballen die α-Tubulin-mCherry en CENP-A-Dendra2 of CENP-A-GFP (Centromere Protein A) uitdrukken in kiemcellen in een vroeg stadium. Om de microtubuli en centromeerbevestiging beter te visualiseren, hebben we ze live afgebeeld op een lagere temperatuur (~ 18 °C) om hun gehechtheid te stabiliseren. Indien nodig kan het monster gedurende 4-5 minuten kort worden gekoeld met ijs of ijskoude levende celmedia om de microtubuli-centromeeraanhechting te stabiliseren en eventuele niet-gekoppelde microtubuli te depolymeriseren. Onze resultaten tonen aan dat de microtubuli afkomstig van het vroege actieve moeder-centrosoom zich bij voorkeur hechten aan het sterkere zuster centromeer (figuur 4). Met behulp van de confocale microscoop met spinschijf vertoonden de α-Tubulin-mCherry-signalen een asymmetrische helderheid in de buurt van de twee centrosomen. We konden ook beide zuster centromeren als één signaal detecteren, zoals weergegeven in figuur 4A (metafase), maar waren niet in staat om de microtubuli-centromeeraanhechting te visualiseren (figuur 4A, metafase). De superresolutie live beeldvorming stelde ons daarentegen in staat om de microtubuli-centromeerbevestiging te visualiseren (figuur 4B). Onze resultaten tonen aan dat moeder centrosoom-uitstralende microtubuli hechten aan het centromeer voorafgaand aan de dochter centrosoom-uitstralende microtubuli(Figuur 4B, vroege profase).

Figuur 1: Schema voor de bereiding en montage van Drosophila testis. (A) Bovenaanzicht: de glasbodemcelkweekschaal (A-a), breng de Drosophila-testis over naar het midden van de schaal (A-b), plaats een dialysemembraan op de bovenkant van de testis (A-c), plaats drie plastic gewichten op het dialysemembraan (A-d). (B) Zijdelings zicht: plaats de plastic ring aan de verhoogde kant van de schaal (B-a), plaats een 22 mm × 22 mm afdeklip op de plastic ring (B-b), plaats een werveling en nat tissuepapier op de afdeklip (B-c), sluit de schaal met het deksel (B-d). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Superresolutie time-lapse beeldvorming van microtubulidynamiek in Drosophila weefsel (teelballen) die α-tubuline-GFP (A) Conventioneel confocale microscopie live celbeeld met microtubulidynamiek in het midden van de G2-fase tot metafase uitdrukt. (B) Airyscan microscoop live celbeeld met asymmetrische microtubuli afkomstig van moeder versus dochter centrosomen in het midden van de G2-fase naar metafase, met gedetailleerde structurele informatie. Een beeldverhaal schildert de mannelijke kiembaanstamcel drosophila af. Schaalbalk: 5μm; sterretje: naaf (nis); groene pijl: moeder centrosoom (stamcelzijde [M]); rode pijl: dochter centrosoom (differentiërende dochtercelzijde [D]); gele pijl: centrosoom in spermatogoniacel (voorloper niet-stamkiemcel); magenta pijl: microtubuli prikken in kern. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Superresolutie time-lapse beeldvorming van microtubuli porren-in activiteit en asymmetrische nucleaire enveloppe afbraak in Drosophila weefsel (teelballen) co-expressing Lamin-mCherry en α-Tubulin-GFP. (A) Conventioneel confocale microscopie live celbeeld met microtubulidynamiek van G2-M-fase tot mitose. Afbeelding met een hogere α-Tubulin-GFP intensiteit aan de stamcelzijde en de interactie met het kernmembraan. (B) Airyscan microscoop live celbeeld met microtubuli die in- en asymmetrische NEBD aan de stamcelzijde prikken. Schaalbalk: 5μm; sterretje: naaf (nis); oranje pijl: plaats van microtubuli die in kernmembraan prikken; magentapijl: microtubuli die aan stamcelzijde inzenden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Superresolutie time-lapse beeldvorming van microtubuli en centromeeraanhechting in Drosophila weefsel (teelballen) die α-Tubuline-mCherry en CENP-A-Dendra2 uitdrukken. (A) Conventioneel confocale microscopie live celbeeld met microtubuli en centromeer interactie van vroege profase tot metafase. Afbeelding met een hogere α-Tubuline-mCherry intensiteit aan stamcelzijde en CENP-A-GFP signaal. (B) Airyscan microscoop live celbeeld met microtubuli afkomstig van het moeder centrosoom en gehechtheid aan de sterkere centromeren in de vroege profase. Bij metafase zijn centromeren bevestigd aan de tegenovergestelde pool (bi-oriëntatie). Schaalbalk: 5μm; sterretje: naaf (nis); magenta pijl: kinetochore vezel of K-vezel (microtubuli bevestigd aan het centromeer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Superresolutiemicroscopiemethoden bieden een ruimtelijke resolutie tot 10s nanometer^4,5,6. De STORM- en PALM-microscopiemethoden maken een resolutie tot 20 tot 50 nm (XY-resolutie) mogelijk, terwijl STED-microscopie een resolutie van 20 tot 100 nm (XY-resolutie) biedt. De ruimtelijke resolutie van SIM-microscopie is beperkt tot 100 tot 130 nm¹⁵. Vanwege de hoge fotondichtheid en lange acquisitietijd is het echter uiterst uitdagend om deze technieken te gebruiken voor live cell imaging.

Beeldvorming van subcellulaire structuren, zoals het cytoskelet, chromosomen en organellen in levende cellen in weefsels, vereist dat de techniek zowel ultragevoelig als niet-invasief is en toch een hoge ruimtelijke resolutie heeft. De hier gepresenteerde Airyscan superresolutietechniek combineert confocale beeldvorming met een 0.2 Airy Unit pinhole, samen met pixelherschikking en deconvolutie. Deze techniek kan een 1,7x hogere resolutie bereiken dan die van conventionele confocale microscopie⁷. De ~ 220-230 nm resolutie van conventionele confocale microscopie wordt beperkt door de diffractiegrens van licht, maar deze beeldvormingstechniek is in staat om ongeveer 140 nm XY-resolutie te bereiken, wat vergelijkbaar is met andere veelgebruikte superresolutietechnieken, zoals SIM (resolutie bij 110-120 nm)¹⁶.

Het aanpassingsvermogen en de veelzijdigheid van Airyscan confocale microscopie zullen dit protocol toepasbaar maken op verschillende andere soorten weefsels en cellen om een divers aantal celbiologieprocessen te bestuderen^7,16. Met behulp van deze techniek kunnen onderzoekers time-lapse beelden verkrijgen op een superresolutieniveau om cellulaire dynamiek te visualiseren met ongekende spatiotemporale details.

De cruciale stap in deze techniek is het monteren van het monster op de schotel zodat het niet beweegt of zweeft tijdens time-lapse beeldvorming. Het bewaren van het monster dicht bij of vastgeplakt aan het beeldoppervlak (d.w.z. de glazen bodem van de schaal) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van beelden met een superresolutie en het behoud van de optimale micro-omgeving voor het monster. Dit zorgt ervoor dat het monster niet wordt belast door omstandigheden zoals hypoxie en veranderingen in temperatuur of vochtigheid.

Ondanks het nut van dit protocol zijn er een paar kanttekeningen. Time-lapse beeldvorming met de Airyscan-modus is een relatief langzaam proces in vergelijking met conventionele confocale microscoopbeeldvorming. Daarom kan zelfs de geringste fysieke verschuiving van het monster leiden tot een slechte resolutie. Deze situatie kan worden voorkomen door een immobilisatiemethode te gebruiken om monsters aan het beeldvormingsoppervlak te hechten (bijv. poly L-lysinecoating of andere coating die compatibel is met het monster). Ook helpt het plaatsen van een dialysemembraan bovenop het weefsel en het toevoegen van een paar kleine gewichten zoals beschreven in dit protocol weefselbeweging of drijven te voorkomen, terwijl het ook gasvormige uitwisseling mogelijk maakt. Time-lapse beeldvormingscellen die zich diep in het weefsel bevinden met de superresolutiemodus vereisen een hoge verlichting en kunnen fotobleaching veroorzaken. Dit kan worden geminimaliseerd door het aantal z-slices, het verlichtingsvermogen en het middelingsalgoritme aan te passen om de optimale instellingen voor het monster te bereiken. Als de cel of het weefsel gevoelig is voor lasertoxiciteit, hypoxie of andere stress tijdens beeldvorming, kan celcyclusstilstand optreden. Ook als een eiwit een extreem lage expressie, korte halfwaardetijd of een laag fluorescentiesignaal heeft, kan fotobleaching optreden, wat zal resulteren in een beeld met slechte kwaliteit. Dit kan worden vermeden door een SRLS te nemen, een korte film te maken of met lange intervallen tussen opeenvolgende tijdspunten te fotograferen. Bovendien moeten de microscoopinstelling en de time-lapse beeldparameter (zoals beschreven in dit protocol) worden geoptimaliseerd om in het monster te passen.

Aangezien het essentieel is dat het monster tijdens het proces niet beweegt of degenereert, kan langdurige time-lapse-beeldvorming die 's nachts of meer dan een dag duurt zonder de beeldresolutie in gevaar te brengen, een uitdaging zijn.

De bestaande methoden richten zich voornamelijk op het afzonderlijk optimaliseren van de microscopie- en time-lapse-beeldvormingsparameters met superresolutie^1,9. Deze methoden bevatten echter geen details over monstervoorbereidings- of montageparameters, die van cruciaal belang zijn om de levensvatbaarheid van het monster en het aanpassingsvermogen van de microscoop te waarborgen om de gewenste superresolutie te bereiken tijdens time-lapse-beeldvorming. In deze methode hebben we de beeldparameters, monstervoorbereiding en montageparameters geoptimaliseerd, zodat time-lapse-beeldvorming gedurende een langere periode kan worden uitgevoerd om beelden met superresolutie te verkrijgen zonder zowel de degeneratie van het monster als de resolutie te riskeren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A