Summary
מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.
Abstract
זה זמן רב יש החלפה מכרעת בין רזולוציה מרחבית וטמפורלית בהדמיה. הדמיה מעבר למגבלת עקיפה של אור הוגבלה באופן מסורתי לשימוש רק על דגימות קבועות או תאים חיים מחוץ לרקמה המסומנת באות פלואורסצנטי חזק. טכניקות הדמיית תאים חיים ברזולוציית-על הנוכחית דורשות שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות מיוחדות, תאורה גבוהה, רכישות מרובות של תמונות עם עיבוד לאחר הרכישה, או לעתים קרובות שילוב של תהליכים אלה. תנאים מוקדמים אלה מגבילים באופן משמעותי את הדגימות וההקשרים הביולוגיים שניתן ליישם טכניקה זו.
כאן אנו מתארים שיטה לביצוע רזולוציית-על (~ 140 ננומטר XY-רזולוציה) זמן לשגות הדמיית תאים חיים במקום. טכניקה זו תואמת גם עם עוצמה פלואורסצנטית נמוכה, למשל, EGFP או mCherry אנדוגנית מתויגת בגנים בעלי ביטוי נמוך. כהוכחה לעיקרון, השתמשנו בשיטה זו כדי לדמיין מבנים תת-תאיים מרובים באשך Drosophila. במהלך הכנת הרקמה, הן המבנה התאי והן מורפולוגיה של הרקמות נשמרים בתוך האשכים הניתחו. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לדמיין דינמיקה microtubule, האינטראקציות בין microtubules ואת הממברנה הגרעינית, כמו גם את החיבור של microtubules כדי centromeres.
טכניקה זו דורשת הליכים מיוחדים בהכנת מדגם, הרכבה מדגם ושתקה של דגימות. בנוסף, יש לשמור על הדגימות מספר שעות לאחר הניתוח מבלי להתפשר על תפקוד ופעילות התא. בעוד שיש לנו אופטימיזציה התנאים עבור הדמיה ברזולוציה סופר חי במיוחד בתאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs) ותאי נבט אבות ברקמת האשכים ניתחו, טכניקה זו חלה באופן כללי על מגוון סוגי תאים שונים. היכולת להתבונן בתאים בתנאים הפיזיולוגיים שלהם מבלי להקריב רזולוציה מרחבית או זמנית תשמש ככלי רב ערך לחוקרים המבקשים לטפל בשאלות מכריעות בביולוגיה של התא.
Introduction
הדמיית מבנים תת-תאיים ודינמיקת חלבונים בתאים חיים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה של האור היא בדרך כלל מאתגרת מאוד1-3. בעוד טכניקות סופר-רזולוציה מרובות כגון סטוכוסטיק-אופטי-שחזור-מיקרוסקופיה (STORM), פוטו-מופעל-לוקליזציה-מיקרוסקופיה (PALM) ו-Stimulated-Emission-דלדול (STED)4,5,6 מיקרוסקופיה פותחו, סיבוכים בהכנת הדגימה כמו גם הצורך לשמור על כדאיות ופעילות ex vivo, להגביל את השימוש במיקרוסקופיה סופר-רזולוציה קונבנציונלית עבור דגימות חיות הדמיה. מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית אינה יכולה להגיע לרזולוציה מרחבית מעבר לרזולוציית XY של ~ 230 ננומטר ולעתים קרובות אינה מספיקה כדי לצפות במת-מבנים תאיים מורכבים5,6. עם זאת, פיתוח לאחרונה במיקרוסקופיה קונפוקלית, הדמיה סופר-רזולוציית Airyscan, הוא מסוגל להשיג כ 140 ננומטר (XY-רזולוציה)7,8 ויש לו הכנת מדגם פשוטה יחסית התואמת הדמיה חיה. מאז מערכת זיהוי הדמיה זו דורשת זמן רכישה ארוך, הרזולוציה המרחבית הגבוהה שלה באה במחיר של רזולוציה זמנית9. לכן, דרושה שיטה כדי להבטיח כי הדמיית תאים חיים מורחבת עם רזולוציה מרחבית גבוהה.
כאן, פיתחנו שיטה להתבוננות בתאים חיים ברקמה שלמה ברזולוציה האופטימלית שלה לפענוח מבנים תת-תאיים עם מידע מרחבי מפורט. שיטה זו מתוכננת כך שניתן להרכיב דגימות ביציבות במשך תקופה ארוכה של זמן (~ 10 שעות) מבלי לזוז או להתנוון. המדיה התאית החיה המשמשת בטכניקה זו יכולה לתמוך בתפקוד התאי ולהימנע מהלבנת תמונות עד 10 שעות תחת מיקרוסקופ ברזולוציה סופר. לבסוף, פרוטוקול זה ממזער את רוב הלחצים הנגרמים על ידי תאורה מתמדת של לייזרים על פני פרקי זמן ממושכים כגון היפוקסיה, שינויים בלחות וטמפרטורה, כמו גם תשישות תזונתית.
באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין תאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs), הצלחנו לראות כיצד הפעילות האסימטרית של microtubules מאפשר אינטראקציה מועדפת עם כרומטידים אחות ייחודית אפיגנטית10,11,12,13. סוגים אלה של אירועים תאיים הם דינמיים מאוד וקשה מאוד לדמיין אותם בתאים חיים באמצעות שיטות הדמיה אחרות ברזולוציית-על כגון STORM, PALM או STED. אנו צופים כי שיטה זו תהפוך שימושית מאוד עבור ביולוגים תא כפי שהם שואפים להבין את המבנים התת-תאיים הדינמיים של תאים חיים המתגוררים ברקמות. ישנם תחומים רבים שבהם ניתן ליישם שיטה זו, כגון לימוד הדינמיקה של חלבונים; הבנת תנועת התאים; ותהליכי מעקב אחר שושלת שושלתיים ובידול סלולרי, בין יישומים אפשריים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת קוקטייל הדמיה של תאים חיים (מדיה סלולרית חיה)
- תוספת מדיום הדרוזופילה של שניידר עם 15% סרום בקר עוברי (FBS) ו 0.6x פניצילין/סטרפטומיצין. כוונן את ה- pH לכ- 7.0.
- רגע לפני השימוש במדיום, להוסיף אינסולין לריכוז הסופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל.
הערה: מדיה זו היא קריטית לשמירה על חלוקת תאים נורמלית ופיתוח של האשכים Drosophila במהלך הדמיה בזמן לשגות10,14.
2. הכנת צלחת תרבות תא תחתון זכוכית
- השתמש בצלחת תרבית תאים מצופה L-ליסין מצופה פולי עם קוטר של 35 מ"מ עבור אשכי Drosophila. בבאר הפנימית של המנה יש תחתית זכוכית בקוטר 23 מ"מ וצד עם גובה של 1 מ"מ(איור 1A-a).
הערה: בחר מנה בתחתית זכוכית המאפשרת מרחק עבודה קצר יותר, צמצם מספרי גדול יותר ויעדת הגדלה גבוהה יותר; תכונות אלה חיוניות להשגת תמונה ברזולוציית-על. - השתמש קרום דיאליזה (MWCO: 12-14kD) המאפשר חילופי גזים. חותכים את הממברנה לחתיכות קטנות.
הערה: חתיכות הממברנה צריך להיות קטן יותר מאשר אזור הזכוכית של המנה אבל גדול מספיק כדי לכסות את הדגימה. - להשרות את הממברנה עם 100 μL של מדיה תא חי במשך ~ 5 דקות. אין להשתמש בקרום יבש על המדגם, שכן הוא עלול להזיק לו. ממברנה מסייעת במניעת לחץ היפוקסי.
- הכן 2-3 חתיכות זכוכית או פלסטיק קל לשים על הממברנה, כך הרקמה לא לצוף. כדי לעשות זאת, ראשית לקחת את הטבעת החיצונית של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל לחתוך אותו לחתיכות קטנות. לאחר מכן, לחטא את החלקים עם 70% אתנול לפני השימוש.
הערה: שלב זה מבטיח כי המדגם נשאר על פני השטח במהלך הדמיה ואינו צף, וזה חיוני להשגת תוצאות אופטימליות. - מכינים טבעת בקוטר של כ-25 מ"מ ומניחים אותה בצד המוגבה של המנה. שים כיסוי על זה כדי ליצור שני תאים. התא התחתון יכיל את הדגימה בעוד התא העליון ישמש כתא לחות כדי למנוע את הייבוש של הדגימה.
- כדי להפוך את הטבעת הזאת, לחתוך את הטבעת החיצונית מצינור צנטריפוגה 50 מ"ל, אשר יאפשר לו להתאים בבטחה בצד המוגבה של צלחת 35 מ"מ. טבעת דומה יכולה להתבצע בדרכים אחרות, למשל, באמצעות גומייה או עניבת טוויסט מפלסטיק כדי להתאים בצד המוגבה של המנה כדי להחזיק כראוי את כיסוי מבלי להפריע לדגימה.
הערה: שלב זה הוא קריטי, במיוחד עבור דגימות רגישות ללחצים כגון תנאים היפוקסיים, ושינויים בטמפרטורה ובלחות.
- כדי להפוך את הטבעת הזאת, לחתוך את הטבעת החיצונית מצינור צנטריפוגה 50 מ"ל, אשר יאפשר לו להתאים בבטחה בצד המוגבה של צלחת 35 מ"מ. טבעת דומה יכולה להתבצע בדרכים אחרות, למשל, באמצעות גומייה או עניבת טוויסט מפלסטיק כדי להתאים בצד המוגבה של המנה כדי להחזיק כראוי את כיסוי מבלי להפריע לדגימה.
3. ניתוח האשכים מזבובים זכריים והרכבה
- קח ~ 10 זבובים זכר צעיר (בן 2-3 יום) ולנתח את האשכים בתקשורת התא החי כדי להשיג ~ 10 זוגות של אשכים בוגרים Drosophila.
- לנתח את הזבובים תחת מיקרוסקופ ניתוח בצלחת ניתוח באמצעות מלקחיים עדינים.
הערה: זן Drosophila melanogaster (זבוב פירות) נושא UAS-α-טובולין-GFP טרנסג'ן מונע על ידי ננו-גל 4 נהג תא נבט מוקדם. - צור את הזנים הבאים של Drosophila melanogaster באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9: לאמין-mCherry (תג C-מסוף) ו- CENP-A-Dendra2-CENP-A [תג באתר הפנימי (בין ה -118 - 119 קודון)].
הערה: בעוד רק אשך אחד באיכות מעולה נדרש עבור כל ניסוי, הרכבה מספיק של רקמות (15-20) או תאים יבטיח כי תהיה לפחות מדגם בריא אחד עם אותות פלואורסצנטי מעולה עבור הדמיה לשגות זמן.
- לנתח את הזבובים תחת מיקרוסקופ ניתוח בצלחת ניתוח באמצעות מלקחיים עדינים.
- לשטוף את האשכים פעמיים במדיה סלולרית חיה בצלחת הניתוח.
- השתמש ב- pipette כדי להוסיף מדיה ואחריה הסרת המדיה של התא החי כשלב כביסה.
- הסר רקמה עודפת באמצעות מלקחיים. כל רקמה נוספת תפריע להדמיה.
הערה: אין להשתמש מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לשטיפה, מכיוון שהיא עשויה להשפיע על הדינמיקה של רכיבים תאיים מסוימים.
- מוסיפים 100-150 μL של מדיה סלולרית חיה למנה (מוכנה בשלב 2.1) ומפזרים אותה על משטח הזכוכית באמצעות קצה פיפטה. הפצת המדיה על פני השטח תאפשר לרקמה להיצמד כראוי לצלחת.
- מעבירים את האשכים לצלחת בעזרת מלקחיים עדינים ומביאים אותם למרכז המנה(איור 1A-b).
הערה: הימנע מהעברת פסולת מכיוון שהיא תפריע להדמיה ועלול להפחית את איכות התמונה. - הסר מדיה סלולרית חיה עודפת (להשאיר כ 10 μL של מדיה) כדי לאפשר את הרקמה לשטח ולהיצמד כראוי לצלחת. בצע שלב זה במהירות כדי למנוע ייבוש המדגם.
- מניחים את הממברנה הרטובה מראש (מוכנה בשלב 2.2 ו-2.3) על גבי האשכים(איור 1A-c).
- שים 2-3 משקולות פלסטיק קטנות (שהוכנו בשלב 2.4) על הממברנה כך שהדגימה לא תצוף ותוסיף במהירות 100-150 μL של מדיה חיה של תאים(איור 1A-d).
הערה: הוספת מדיה במהירות ובעדינות מבטיחה שהדגימה לא תתייבש או תעקור. - מניחים את טבעת הפלסטיק (שהוכנה בשלב 2.5) בצד המוגבה של המנה(איור 1B-a).
- מניחים כיסוי 22 מ"מ x 22 מ"מ מעל הטבעת(איור 1B-b). זה יוצר שני תאים.
- קחו חתיכת נייר טישו, דכאו אותה במים, ואז מערבבים אותה ושמו אותה על כיסוי, כדי ליצור תא לח(איור 1B-c). סגור את המכסה של המנה (איור 1B-d) ולהתחיל הדמיה תא חי.
הערה: אם המדגם רגיש לאור, בצע את סעיף 3 בחושך.
4. הדמיית תאים חיים של תאי גזע זכרי Drosophila (GSC) במקום
- מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ ברזולוציה סופר ומאבטחים אותה עם מלחצי הבמה.
- פתח את תוכנת ההדמיה, הפעל את האור המועבר והשתמש במטרה 63x כדי להתמקד ברקמת האשכים עם ידית המיקוד.
הערה: אם יש קושי באיתור מדגם עם המטרה 63x, השתמש תחילה במטרה 40x או 20x לפני המעבר ל- 63x. - הפעל את הלייזרים, לחץ על Liveומצא את ה- GSC עם המיקום והמצב האופטימליים. הימנע אשכים שיש להם אות פלואורסצנטיות נמוכה או יש את הרכזת (נישה) הרחק מפני השטח.
הערה: באשכים Drosophila, GSCs מחוברים לרכזת.
- פתח את תוכנת ההדמיה, הפעל את האור המועבר והשתמש במטרה 63x כדי להתמקד ברקמת האשכים עם ידית המיקוד.
- התאם את המוקד עבור GSCs וזיהה את ההגדרות הנכונות עבור המדגם, כולל כוח לייזר, רווח הכפלת אלקטרונים (EM), ממוצע וזום עבור מצב Airyscan. השתמש בהגדרות הבאות כדוגמה עבור אשכים Drosophila מבטאים EGFP מתויג α-טובולין בתאי נבט בשלב מוקדם.
- הגדר את גודל המסגרת בין 512 x 512 פיקסלים ל- 1024 x 1024 פיקסלים על-ידי לחיצה על גודל מסגרת.
- הגדר את ממוצע המסגרת ל- 1 או 2 על-ידי לחיצהעל ממוצע .
הערה: הגדלת גודל המסגרת (>1024 x 1024 פיקסלים) וביצוע ממוצע גדול יותר (כלומר, יותר מ- 2) עלולים לגרום להלבנה או פוטוטוקסיות. - הגדר את כוח הלייזר ל- 1%-2% על-ידי לחיצה על לייזרים.
הערה: הגברת כוח הלייזר עלולה גם להוביל להלבנה או פוטוטוקסיות. - הגדר את הרווח EM מתחת לרמה המומלצת (< 800) על-ידי לחיצה על רווח מאסטר.
הערה: רווח EM גבוה יותר עשוי ליצור חפצים. - התקרב לאזור או לתא העניין כדי לקצר את זמן רכישת התמונות ולהפחית את ההלבנה לתמונות. זה גם מאפשר לדגימה לשרוד זמן רב יותר.
- התחל את לכידת התמונה בזמן התפוגה באמצעות מצב Airyscan על-ידי לחיצה על התחל ניסוי.
- לפני לחיצה על התחל ניסוי, ודא שהרכישה מוגדרת בצורה אופטימלית.
- אם הוא מציג אזהרה עם ההודעה "רכישת Airyscan אינה מוגדרת בצורה אופטימלית", ולאחר מכן לחץ על אופטימלי בסעיף גודל מסגרת, לחץ על אופטימלי במקטע z-stack ולחץ על אופטימלי עבור אזור סריקה (מינימום של 1.3 זום נדרש עבור הדמיה ברזולוציית סופר).
- מטב את מרווח הזמן, מספר פרוסות z ומשך הדמיית זמן לשגות על פי העיצוב הניסיוני וסוג הדגימה, כך שאיכות התמונה לא תיפגע והתאים לא ייעצרו בשלבים מסוימים של מחזור התא.
- כדוגמה, הפרמטרים עבור הדמיה בזמן לשגות של האשכים Drosophila מבטא EGFP מתויג α טובולין ב germline מוקדם מוצגים בשלבים הבאים.
- להדמיה של יותר מ-5 שעות, התמונה במרווח של 10 דקות עם עוצמה של 1% לייזר ולוקחות עד 30 פרוסות z בכל נקודת זמן.
- לתהליכים תאיים דינמיים ביותר, כגון דינמיקת מיקרוטובול, קבע מרווח של 2 דקות בין נקודות זמן, בצע הדמיה של 1-2 שעות בהפסקת זמן בעוצמה של 1% לייזר, וקח עד 30 פרוסות z בכל נקודת זמן.
- לאירועים תאיים נדירים, כגון אנאפאזה לדינמיקת כרומטין מוקדמת של טלופז (אירועים של 2-3 דקות), קבעו הדמיית תאים חיים עם מרווח של דקה אחת בין נקודות זמן, בצעו הדמיה של 30 דקות בזמן ב-1% כוח לייזר, וקח עד 30 פרוסות z בכל נקודת זמן.
הערה: פרמטרים אלה עשויים להשתנות עבור דגימות שונות, ולכן יהיה צורך בשינוי לשימוש אופטימלי עבור המדגם הספציפי.
- בצע הדמיה בזמן או הדמיית תמונה חיה, בהתאם לרגישות המדגם ולעיצוב הניסיוני.
הערה: סרט קצר הוא 15-30 דקות, וסרט ארוך הוא יותר מ 5 שעות. - אם המדגם רגיש מאוד ולא ניתן ללמוד אותו על ידי הדמיה בזמן-לשגות עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כפי שקורה לעתים קרובות עם GSCs זכר Drosophila, לבצע תמונה חיה ברזולוציה סופר (SRLS) של המדגם בשלבי מחזור תאים שונים (כפי שמוצג באיור 2, איור 3, איור 4).
- אם אירוע ביולוגי נדיר של תאים נלכד או חלבון העניין יש רמת ביטוי נמוכה, אז לבצע SRLS.
- עבור SRLS, מצא תא בשלב מחזור התא הספציפי שבו אתה מעוניין. לדוגמה, אם מתמקדים בכריכה מיקרוטובולות-קינטוצ'ורה, יש להשתמש בתא בפרומטפאזה או במטפאזה.
הערה: זה יעזור להבטיח כי אתה מקבל תמונה באיכות גבוהה של תא העניין בזמן הנכון מבלי להסתכן phototoxicity המדגם או להלבנה של פלואורופורים, אשר עשוי להתרחש במהלך סרט ארוך יותר. - אם אתם משתמשים ב-SRLS, צלם שלבי עניין שונים של מחזור התאים בתאים מרובים וסדר תמונות אלה בסדר כרונולוגי.
הערה: זה יכול לשמש כדי לבנות סדר זמני של אירועים תוך מקסום בריאות האות והרקמות, כדי לקבל רזולוציה זמנית מצוינת של האירוע עבור דגימות רגישות במיוחד או דגימות עם אות נמוך.
5. עיבוד Airyscan של תמונות התא החי
- לאחר רכישת תמונה באמצעות תוכנת ההדמיה, בחר עיבוד, לחץ על אצווהולאחר מכן בחר עיבוד Airyscan.
- בחר את התמונות לעיבוד ולאחר מכן לחץ על הפעל/תהליך כדי להשיג את התמונות ברזולוציית-על.
- בצע את העיבוד באמצעות הגדרת ברירת המחדל.
הערה: עיבוד Airyscan יפעל רק אם הגדרות ההדמיה נקבעו כראוי עבור הדמיה Airyscan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיית תאים חיים מעבר למגבלת עקיפה ברקמת Drosophila, במיוחד עבור GSCs, מספק הזדמנות לחקור את הדינמיקה של אירועים תת-תאיים בהקשר של התקדמות מחזור התא. לאחרונה, מחקר המשתמש בפרוטוקול זה הראה כי פעילויות microtubule במרכז האם לעומת הבת centrosome הם אסימטריים זמנית ב- GSCs10. האם צנטרוזום נובעת microtubules כ 4 שעות לפני הכניסה המיטוטית, בעוד centrosome הבת רק נובע microtubules בתחילת מיטוזה. המיקרוטובולות הפעילות ביותר מהמרכז האם מתקשרות עם הממברנה הגרעינית ומעוררות פירוק מעטפת גרעינית מקוטבת (NEBD). ה- NEBD המקומי הוא קרבי לרכזת ומאפשר למיקרוטובולים ממרכז האם להיכנס לגרעין ולהיצמד באופן מועדף לאחות החזקה יותר קינטוצ'ורה ולאחות סנטרומרה כדי להבטיח שהם יתפרקו לתא הגזע העתידי. תצפיות אלה מצביעות על כך שקיים ציר מיטוטי אסימטרי שבו קיימים המיקרוטובולות, הממברנה הגרעינית, הקינטוצ'ור והצנטרומרים מתקשרים באופן מבוקר מרחבי, על מנת להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה ללא גולגולת בסופו של דבר10,11,12.
כל אחת מתוצאות אלה נתמכה באמצעות גישת SRLS המתוארת כאן. על ידי ביצוע הדמיה תאית חיה של אשכי Drosophila המבטאים α-טובולין-GFP בתאי נבט בשלב מוקדם, הצלחנו לזהות אסימטריה זמנית בפעילות microtubule ב- GSCs (איור 2). הצלחנו גם לראות את העוצמה האסימטרית של אותות GFP בשני המרכזים כאות בהיר יותר במרכז האם ואות חלש יחסית בצד המרכז של הבת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב(איור 2A). ההבדל בבהירות משתקף ככל הנראה על ידי הא-סימטריה הזמנית של התגרענות המיקרו-קוטביות, אך לא ניתן היה לפתור את המורפולוגיה המפורטת ואת כמות המיקרוטובולות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב(איור 2A). לעומת זאת, הדמיה ברזולוציית-על של תאים חיים אפשרה לנו לדמיין את המורפולוגיה ולכומת את מספר המיקרוטובולות(איור 2B). הרזולוציה המשופרת שלו חשפה דפוסים של התגרענות מיקרוטובולית אסימטרית, התארכות ואינטראקציה מוגברת עם הממברנה הגרעינית (איור 2B). כדוגמאות, הסרטים לשגות זמן של α-טובולין-GFP מבטא GSCs פורסמו במאמר מחקר ראשי (קטעי וידאו S3 ווידאו S5)10.
לאחר מכן, ביצענו הדמיית תאים חיה על אשכים Drosophila שיתוף מבטא או α-טובולין-GFP עם Lamin-mCherry או α-טובולין-mCherry עם Lamin-GFP בתאי נבט בשלב מוקדם. התוצאות שלנו מראות שפעילות מיקרוטובלים אסימטרית חופפת ל-NEBD אסימטרי ב-GSCs(איור 3). באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב, יכולנו לדמיין את ההסתעפויות של הממברנה הגרעינית האסימטרית, אך לא את המיקרוטובולות הבודדות שנכנסו ישירות לגרעין (איור 3A). לעומת זאת, טכניקה זו של רזולוציית-על של תאים חיים אפשרה לנו להתבונן ישירות באירועים אלה על ידי הדמיית המיקרוטובולות והלמינה הגרעינית בו זמנית(איור 3B).
לאחר מכן, ביצענו הדמיה תאית חיה על אשכים Drosophila מבטא α-טובולין-mCherry ו CENP-A-Dendra2 או CENP-A-GFP (חלבון Centromere A) בתאי נבט בשלב מוקדם. כדי לדמיין טוב יותר את ההתקשרות microtubule ו centromere, אנו חיים דימוי אותם בטמפרטורה נמוכה יותר (~ 18 °C (~18 °F) כדי לייצב את הקובץ המצורף שלהם. במידת הצורך, ניתן לצנן את המדגם לזמן קצר עם קרח או תקשורת תאים חיים קרים כקרח למשך 4-5 דקות כדי לייצב את הקובץ המצורף למיקרוטובול-צנטרומר ולפרק את כל המיקרו-קוטביות הלא מחוברות. התוצאות שלנו מראות שהמיקרוטובולות הנובעות מהמרכזית האם הפעילה המוקדמת מתחברות באופן מועדף למרכז האחות החזק יותר(איור 4). באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב, אותות α-טובולין-mCherry הראו בהירות אסימטרית ליד שני הצנטרוזומים. יכולנו גם לזהות את שני צנטרומרים אחיות כאות אחד, כפי שמוצג באיור 4A (metaphase), אך לא הצלחנו לדמיין את הקובץ המצורף למיקרוטובולה-צנטרומר(איור 4A, metaphase). לעומת זאת, ההדמיה החיה ברזולוציית העל אפשרה לנו לדמיין את הקובץ המצורף למיקרוטובול-סנטרומר(איור 4B). התוצאות שלנו מראות שמיקרוטובולות שמקורן באמא מתחברות למרכז לפני המיקרוטובולות הנובעות מהמרכז של הבת(איור 4B,פרופאזה מוקדמת).
איור 1: תוכנית להכנה והרכבה של אשכי דראוזופילה. (A)מבט עליון: צלחת תרבית התא התחתון של הזכוכית (A-a), מעבירים את אשכי הדרוספילה למרכז המנה (A-b), מניחים קרום דיאליזה על החלק העליון של האשכים (A-c), מניחים שלוש משקולות פלסטיק על קרום הדיאליזה (A-d). (B)מבט לרוחב: מניחים את טבעת הפלסטיק בצד המוגבה של המנה (B-a), מניחים כיסוי 22 מ"מ × 22 מ"מ על טבעת הפלסטיק (B-b), מניחים מערבולת ונייר טישו רטוב על כיסוי (B-c), סוגרים את המנה עם המכסה (B-d). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיה ברזולוציה סופר-רזולוציה של דינמיקת מיקרוטובולה ברקמת Drosophila (האשכים) המבטאת α-טובולין-GFP (A)תמונת תאים חיים קונבנציונלית קונפוקלית המציגה דינמיקה של מיקרוטובולה באמצע שלב G2 למטפאזה. (B)תמונת תא חי של מיקרוסקופ Airyscan המציגה מיקרוטובולת אסימטרית הנובעת ממרכזי אם לעומת בת בשלב ה- G2 באמצע G2 ועד מטפאזה, עם מידע מבני מפורט. קריקטורה מתארת את תא גזע נבט זכר Drosophila. סרגל קנה מידה: 5μm; כוכבית: hub (נישה); חץ ירוק: אמא צנטרוזום (צד תא גזע [M]); חץ אדום: בת צנטרוזום (הבחנה בצד תא הבת [D]); חץ צהוב: צנטרוזום בתא זרע (תא נבט שאינו גזע של אבות); חץ מגנטה: מיקרוטובולה מציצה בגרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה ברזולוציית-על של פעילות דוקר-דלוק-אין של מיקרוטובולה והתמוטטות מעטפת גרעינית אסימטרית ברקמת דרוסופילה (אשכים) המבטאת במשותף את לאמין-משרי ואת α-טובולין-GFP. (A)תמונת תא חי קונבנציונלית של מיקרוסקופיה קונפוקלית המציגה דינמיקה של מיקרוטובול משלב G2-M ועד מיטוזה. תמונה המציגה עוצמת α-טובולין-GFP גבוהה יותר בצד תאי הגזע והאינטראקציה שלה עם הממברנה הגרעינית. (B)תמונת תא חי של מיקרוסקופ Airyscan המציגה מיקרוטובולת דוחפת פנימה ו- NEBD אסימטרי בצד תא הגזע. סרגל קנה מידה: 5μm; כוכבית: hub (נישה); חץ כתום: אתר של microtubule דוקר בממברנה גרעינית; חץ מגנטה: מיקרוטובולים שדוקרים בצד תאי הגזע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה של מיקרוטובולה וצנטרומרה ברקמת דרוזופילה (האשכים) המבטאת α-טובולין-מאצ'רי ו-CENP-A-Dendra2. (A)תמונת תאים חיים קונבנציונלית של מיקרוסקופיה קונפוקלית המציגה אינטראקציה בין מיקרוטובולת וצנטרומרה מפרופאזה מוקדמת למטפאזה. תמונה המציגה עוצמת α-טובולין-mCherry גבוהה יותר בצד תאי הגזע ואות CENP-A-GFP. (B)תמונת תא חי של מיקרוסקופ Airyscan המציגה מיקרוטובולות הנובעות מהמרכז האם וחיבור לצנטרומרים החזקים יותר בפרופאזה מוקדמת. במטפאזה, צנטרומרים מחוברים לקוטב הנגדי (דו-אוריינטציה). סרגל קנה מידה: 5μm; כוכבית: hub (נישה); חץ מגנטה: סיבי קינטוצ'ורה או סיבי K (microtubules המחוברים למרכז). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר לספק רזולוציה מרחבית גבוה ככל 10s של ננומטר4,5,6. שיטות המיקרוסקופיה STORM ו- PALM מאפשרות רזולוציה של עד 20 עד 50 ננומטר (רזולוציית XY), בעוד שמיקרוסקופיית STED מציעה רזולוציה של 20 עד 100 ננומטר (רזולוציית XY). הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיית SIM מוגבלת ל- 100 עד 130 ננומטר15. עם זאת, בשל צפיפות פוטון גבוהה וזמן רכישה ממושך, זה מאוד מאתגר להשתמש בטכניקות אלה עבור הדמיה תא חי.
מבנים תת-תאיים הדמיה, כגון ציטוסקלטון, כרומוזומים, אברונים בתאים חיים בתוך רקמות, דורש את הטכניקה להיות גם רגיש ולא פולשני תוך עדיין בעל רזולוציה מרחבית גבוהה. טכניקת רזולוציית העל של Airyscan המוצגת כאן משלבת הדמיה קונפוקלית עם חור סיכה של יחידה אוורירית 0.2, יחד עם הצבה מחדש של פיקסלים ודא-וולבולציה. טכניקה זו יכולה להשיג רזולוציה גבוהה פי 1.7 מזו של מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית7. רזולוציית ~ 220-230 ננומטר של מיקרוסקופיה קונבנציונלית קונדוקלי מוגבלת על ידי מגבלת עקיפה של אור, אך טכניקת הדמיה זו מסוגלת להשיג רזולוציית XY של כ- 140 ננומטר, הדומה לטכניקות סופר-רזולוציה אחרות הנמצאות בשימוש נרחב, כגון SIM (רזולוציה ב- 110-120 ננומטר)16.
יכולת ההסתגלות והוורסטיליות של מיקרוסקופיה קונפוקלית Airyscan יאפשרו לפרוטוקול זה להיות ישים לסוגים שונים אחרים שלרקמותותאים כדי לחקור מספר מגוון של תהליכי ביולוגיה של התא 7,16. באמצעות טכניקה זו, חוקרים יכולים להשיג תמונות בזמן לשגות ברמה סופר רזולוציה לדמיין דינמיקה תאית עם פרטים spatiotemporal חסר תקדים.
השלב הקריטי בטכניקה זו הוא הרכבת המדגם על המנה כך שהיא לא תזוז או תצוף במהלך הדמיה בזמן. שמירה על הדגימה קרובה או תקועה למשטח ההדמיה (כלומר, תחתית הזכוכית של המנה) היא קריטית לרכישת תמונות ברזולוציה סופר ושמירה על המיקרו-סביבה האופטימלית לדגימה. זה מבטיח כי המדגם אינו לחוץ בשל תנאים כגון היפוקסיה ושינויים בטמפרטורה או בלחות.
למרות התועלת של פרוטוקול זה, יש כמה אזהרות. הדמיה בזמן לשגות עם מצב Airyscan הוא תהליך איטי יחסית בהשוואה הדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי. לכן, אפילו השינוי הפיזי הקל ביותר של המדגם עלול לגרום לרזולוציה גרועה. מצב זה ניתן למנוע באמצעות שיטת immobilization לדבוק דגימות על משטח ההדמיה (למשל, ציפוי פולי L-ליסין או ציפוי אחר תואם המדגם). כמו כן, הצבת קרום דיאליזה על גבי הרקמה והוספת כמה משקולות קטנות כמתואר בפרוטוקול זה מסייעת במניעת תנועת רקמות או צף תוך מתן אפשרות לחילופי גזים. תאי הדמיה של זמן לשגות הממוקמים עמוק ברקמה עם מצב רזולוציית-על דורשים תאורה גבוהה ויכולים לגרום להלבנה. ניתן למזער זאת על-ידי התאמת מספר פרוסות z, עוצמת התאורה ואלגוריתם ממוצע כדי להשיג את ההגדרות האופטימליות עבור הדגימה. אם התא או הרקמה רגישים לרעילות לייזר, היפוקסיה או כל מתח אחר במהלך ההדמיה, אז מעצר מחזור התא עלול להתרחש. כמו כן, אם חלבון יש ביטוי נמוך מאוד, זמן מחצית חיים קצר, או אות פלואורסצנטיות נמוכה, אז ליבנה פוטו עלולה להתרחש אשר יגרום תמונה עם איכות גרועה. ניתן להימנע מכך על ידי לקיחת SRLS, עשיית סרט קצר או צילום עם מרווחי זמן ארוכים בין נקודות זמן רצופות. בנוסף, יש למטב את הגדרת המיקרוסקופ ואת פרמטר הדמיית הזמן -לשגות (כמתואר בפרוטוקול זה) כדי להתאים לדגימה.
מכיוון שזה חיוני כי המדגם לא זז או להתנוון במהלך התהליך, הדמיה ממושכת זמן לשגות שנמשך לילה או יותר מיום מבלי להתפשר על רזולוציית התמונה עשוי להיות מאתגר.
השיטות הקיימות מתמקדות בעיקר באופטימיזציה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה ופרמטרים הדמיה לשגות זמן בנפרד1,9. עם זאת, שיטות אלה אינן מספקות פרטים לגבי הכנת מדגם או פרמטרים הרכבה, אשר קריטיים כדי להבטיח את הכדאיות של המדגם ואת יכולת ההתאמה של המיקרוסקופ כדי להשיג את הרזולוציה העליונה הרצויה במהלך הדמיה בזמן לשגות. בשיטה זו, מיטבנו את פרמטרי ההדמיה, הכנת המדגם ופרמטרים הרכבה כך הדמיה זמן לשגות יכול להתבצע במשך תקופה ממושכת של זמן כדי לרכוש תמונות ברזולוציה סופר מבלי להסתכן הן ניוון של המדגם ואת הרזולוציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות למתקן הליבה המשולבת של הדמיה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס על מיקרוסקופים ותוכנות לניתוח נתונים. אנו מודים לג'יי סנדקר ול-Q. E. Yu על הגהה והצעות, ולחברי המעבדה של X.C על דיונים והצעות מועילים. נתמך על ידי NIGMS / NIH R35GM127075, המכון הרפואי הווארד יוז, קרן דוד ולוסיל פקרד, וקרנות ההפעלה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (X.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. - 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. - 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
References
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al.
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
