Summary
Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.
Abstract
Durante mucho tiempo ha habido un equilibrio crucial entre la resolución espacial y temporal en las imágenes. Las imágenes más allá del límite de difracción de la luz se han restringido tradicionalmente para ser utilizadas solo en muestras fijas o células vivas fuera del tejido etiquetado con señal fluorescente fuerte. Las técnicas actuales de imagen de células vivas de súper resolución requieren el uso de sondas especiales de fluorescencia, alta iluminación, múltiples adquisiciones de imágenes con procesamiento posterior a la adquisición o, a menudo, una combinación de estos procesos. Estos requisitos previos limitan significativamente las muestras biológicas y los contextos a los que se puede aplicar esta técnica.
Aquí describimos un método para realizar super-resolución (~ 140 nm XY-resolución) tiempo de fluorescencia imágenes de células vivas in situ. Esta técnica también es compatible con baja intensidad fluorescente, por ejemplo, EGFP o mCherry endógenamente etiquetados en genes expresados humildemente. Como prueba de principio, hemos utilizado este método para visualizar múltiples estructuras subcelulares en el testículo de Drosophila. Durante la preparación del tejido, tanto la estructura celular como la morfología tisular se mantienen dentro del testículo diseccionado. Aquí, utilizamos esta técnica para obtener imágenes de la dinámica de los microtúbulos, las interacciones entre los microtúbulos y la membrana nuclear, así como la unión de los microtúbulos a los centrómeros.
Esta técnica requiere procedimientos especiales en la preparación de muestras, montaje de muestras e inmovilización de muestras. Además, los especímenes se deben mantener por varias horas después de la disección sin comprometer la función y la actividad celulares. Si bien hemos optimizado las condiciones para la obtención de imágenes de súper resolución en vivo específicamente en las células madre de la línea germinal masculina de Drosophila (GSCs) y las células germinales progenitoras en el tejido de testículo diseccionado, esta técnica es ampliamente aplicable a una variedad de diferentes tipos de células. La capacidad de observar las células bajo sus condiciones fisiológicas sin sacrificar la resolución espacial o temporal servirá como una herramienta invaluable para los investigadores que buscan abordar preguntas cruciales en biología celular.
Introduction
Visualizar las estructuras subcelulares y la dinámica de proteínas en células vivas con resolución más allá del límite de difracción de la luz es típicamente muy difícil1-3. Mientras que se han desarrollado múltiples técnicas de súper resolución como microscopía estocástica-óptica-reconstrucción-microscopía (STORM), foto-activada-localización-microscopía (PALM) y estimulada-emisión-agotamiento (STED)4,5,6 microscopía, las complicaciones en la preparación de muestras, así como la necesidad de mantener la viabilidad y la actividad ex vivo, limitan el uso de la microscopía convencional de súper resolución para obtener imágenes de muestras vivas. La microscopía confocal convencional no puede alcanzar una resolución espacial más allá de ~ 230 nm de resolución XY y a menudo es insuficiente para observar subestructuras celulares intrincadas5,6. Sin embargo, un desarrollo reciente en microscopía confocal, airyscan super-resolución de imagen, es capaz de lograr aproximadamente 140 nm (resolución XY)7,8 y tiene una preparación de muestra relativamente simple que es compatible con imágenes en vivo. Dado que este sistema de detección de imágenes requiere un largo tiempo de adquisición, su alta resolución espacial viene a costa de la resolución temporal9. Por lo tanto, se necesita un método para garantizar que las imágenes de células vivas se amplíen con alta resolución espacial.
Aquí, hemos desarrollado un método para la observación de células vivas en tejido intacto en su resolución óptima para descifrar las estructuras subcelulares con información espacial detallada. Este método está diseñado como tal para que las muestras se puedan montar de forma estable durante un largo período de tiempo (~ 10 h) sin moverse ni degenerar. Los medios celulares vivos utilizados en esta técnica pueden apoyar la función celular y evitar el fotoblanqueo durante un hasta 10 horas bajo un microscopio de súper resolución. Finalmente, este protocolo minimiza la mayoría de las tensiones causadas por la iluminación constante de los láseres durante largos períodos de tiempo como la hipoxia, los cambios en la humedad y la temperatura, así como el agotamiento de nutrientes.
Utilizando este protocolo para obtener imágenes de células madre de línea germinal masculinas de Drosophila (GSCs), pudimos observar cómo la actividad asimétrica de los microtúbulos permite la interacción preferencial con cromátidas hermanas epigenéticamente distintas10,11,12,13. Estos tipos de eventos celulares son altamente dinámicos y son muy difíciles de visualizar en células vivas utilizando otros métodos de imágenes de súper resolución como STORM, PALM o STED. Anticipamos que este método llegará a ser altamente útil para los biólogos celulares, ya que tienen como objetivo comprender las estructuras subcelulares dinámicas de las células vivas que residen en los tejidos. Hay muchas áreas en las que se puede aplicar este método, como el estudio de la dinámica de las proteínas; comprender el movimiento de las células; y procesos de trazado de linaje y diferenciación celular, entre otras posibles aplicaciones.
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Protocol
1. Preparación de cóctel de imágenes de células vivas (medios celulares vivos)
- Complemente el medio Drosophila de Schneider con suero fetal bovino al 15% (FBS) y 0,6 veces penicilina/estreptomicina. Ajuste el pH a aproximadamente 7.0.
- Justo antes de usar el medio, agregue insulina a una concentración final de 200 μg/mL.
NOTA: Este medio es crítico para mantener la división celular normal y el desarrollo del testículo de Drosophila durante las imágenes de lapso de tiempo10,14.
2. Preparación del plato de cultivo celular con fondo de vidrio
- Utilice un plato de cultivo celular con fondo de vidrio recubierto de L-lisina de poli con un diámetro de 35 mm para el testículo de Drosophila. El pozo interior del plato tiene un fondo de vidrio con un diámetro de 23 mm y un lado con una elevación de 1 mm (Figura 1A-a).
NOTA: Elija un plato con fondo de vidrio que permita una distancia de trabajo más corta, una apertura numérica más grande y un objetivo de aumento más alto; estas características son cruciales para obtener una imagen de súper resolución. - Utilice una membrana de diálisis (MWCO: 12–14kD) que permita el intercambio gaseoso. Corte la membrana en trozos pequeños.
NOTA: Las piezas de membrana deben ser más pequeñas que el área de vidrio del plato, pero lo suficientemente grandes como para cubrir la muestra. - Remoje la membrana con 100 μL de medios celulares vivos durante ~ 5 min. No utilice una membrana seca en la muestra, ya que puede dañarla. La membrana ayuda a prevenir el estrés hipóxico.
- Prepare de 2 a 3 piezas ligeras de vidrio o plástico para colocar en la membrana para que el tejido no flote. Para hacer esto, primero tome el anillo exterior del tubo de centrífuga de 50 mL y córtelo en trozos pequeños. Luego, esterilice las piezas con etanol al 70% antes de su uso.
NOTA: Este paso garantiza que la muestra permanezca en la superficie durante la toma de imágenes y no flote, lo que es crucial para obtener resultados óptimos. - Prepare un anillo de ~ 25 mm de diámetro y colómelo en el lado elevado del plato. Póngase un cubrebocas en él para generar dos cámaras. La cámara inferior contendrá la muestra, mientras que la cámara superior servirá como una cámara de humedad para evitar que la muestra se seque.
- Para hacer este anillo, corte el anillo exterior de un tubo de centrífuga de 50 mL, lo que le permitirá encajar de forma segura en el lado elevado de la antena parabólica de 35 mm. Un anillo similar se puede hacer de otras maneras, por ejemplo, mediante el uso de una banda elástica o una corbata de torsión de plástico para caber en el lado elevado del plato para sostener correctamente el cubrebocas sin interferir con la muestra.
NOTA: Este paso es crítico, especialmente para muestras sensibles a tensiones como las condiciones hipóxicas y los cambios en la temperatura y la humedad.
- Para hacer este anillo, corte el anillo exterior de un tubo de centrífuga de 50 mL, lo que le permitirá encajar de forma segura en el lado elevado de la antena parabólica de 35 mm. Un anillo similar se puede hacer de otras maneras, por ejemplo, mediante el uso de una banda elástica o una corbata de torsión de plástico para caber en el lado elevado del plato para sostener correctamente el cubrebocas sin interferir con la muestra.
3. Disección de testículos de moscas macho y montaje
- Tome ~ 10 moscas macho jóvenes (2-3 días de edad) y diseccionar los testículos en el medio celular vivo para obtener ~ 10 pares de testículos adultos Drosophila.
- Diseccione las moscas bajo un microscopio de disección en un plato de disección usando pórceps finos.
NOTA: La cepa Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) lleva uas-α-tubulina-GFP transgén impulsado por un controlador de células germinales temprana nanos-Gal4. - Genere las siguientes cepas knock-in de Drosophila melanogaster utilizando la tecnología CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (etiqueta C-terminal) y CENP-A-Dendra2-CENP-A [etiqueta en el sitio interno (entre el codón 118 - 119)].
NOTA: Si bien solo se necesita un testículo de excelente calidad para cada experimento, el montaje de un número suficiente de tejidos (15-20) o células garantizará que haya al menos una muestra sana con excelentes señales de fluorescencia para obtener imágenes de lapso de tiempo.
- Diseccione las moscas bajo un microscopio de disección en un plato de disección usando pórceps finos.
- Lave los testículos dos veces en medios celulares vivos en el plato de disección.
- Use una pipeta para agregar medios seguidos de la extracción de los medios celulares vivos como paso de lavado.
- Elimine el exceso de tejido con fórceps. Cualquier tejido adicional interferirá con las imágenes.
NOTA: No utilice solución salina tamponada con fosfato (PBS) para el lavado, ya que puede afectar la dinámica de ciertos componentes celulares.
- Añadir de 100 a 150 μL de medio celular vivo en el plato (preparado en el paso 2.1) y extenderlo sobre la superficie del vidrio con una punta de pipeta. La dispersión de los medios en la superficie permitirá que el tejido se adhiera correctamente al plato.
- Transferir los testículos al plato usando fórceps finos y llevarlos al centro del plato (Figura 1A-b).
NOTA: Evite la transferencia de escombros porque interferirá con las imágenes y podría reducir la calidad de la imagen. - Retire el exceso de medios celulares vivos (deje aproximadamente 10 μL de medios) para permitir que el tejido se aplane y se adhiera correctamente al plato. Realice este paso rápidamente para evitar secar la muestra.
- Colocar la membrana pre-húmeda (preparada en los pasos 2.2 y 2.3) sobre los testículos (Figura 1A-c).
- Ponga de 2 a 3 pesos de plástico pequeños (preparados en el Paso 2.4) en la membrana para que la muestra no flote y agregue rápidamente 100–150 μL de medios celulares vivos (Figura 1A-d).
NOTA: La adición de medios de forma rápida y suave garantiza que la muestra no se seque ni se desplace. - Colocar el anillo de plástico (preparado en el paso 2.5) en el lado elevado del plato (Figura 1B-a).
- Coloque una tapa de 22 mm x 22 mm en la parte superior del anillo (Figura 1B-b). Esto genera dos cámaras.
- Tome un pedazo de papel de seda, humedezca con agua, luego gire y colóle en el cubrebocas, para crear una cámara húmeda (Figura 1B-c). Cierre la tapa del plato(Figura 1B-d)y comience la toma de imágenes de células vivas.
Nota : si el ejemplo es sensible a la luz, realice la sección 3 en la oscuridad.
4. Imágenes de células vivas de células madre de la línea germinal masculina de Drosophila (GSC) in situ
- Coloque el plato bajo el microscopio de súper resolución y apriete con las abrazaderas del escenario.
- Abra el software de imágenes, encienda la luz transmitida y use el objetivo 63x para enfocar el tejido del testículo con la perilla de enfoque.
NOTA: Si hay una dificultad en la localización de una muestra con el objetivo 63x, a continuación, utilice primero el objetivo 40x o 20x antes de cambiar al 63x. - Encienda los láseres, haga clic en En vivoy busque el GSC con la posición y el estado óptimos. Evite los testículos que tienen una señal de fluorescencia baja o tienen el cubo (nicho) lejos de la superficie.
NOTA: En los testículos de Drosophila, los GSC están unidos al concentrador.
- Abra el software de imágenes, encienda la luz transmitida y use el objetivo 63x para enfocar el tejido del testículo con la perilla de enfoque.
- Ajuste el enfoque para los GSC e identifique los ajustes correctos para la muestra, incluida la potencia del láser, la ganancia de multiplicación de electrones (EM), el promedio y el zoom para el modo Airyscan. Utilice los siguientes ajustes como ejemplo para los testículos de Drosophila que expresan EGFP etiquetado α-tubulina en células germinales en etapa temprana.
- Establezca el tamaño de fotograma entre 512 x 512 píxeles y 1024 x 1024 píxeles haciendo clic en Tamaño de fotograma.
- Establezca el promedio de fotogramas en 1 o 2 haciendo clic en Promediación.
NOTA: Aumentar el tamaño del fotograma (>1024 x 1024 píxeles) y realizar un promedio más (es decir, más de 2) podría dar lugar a fotoblanqueo o fototoxicidad. - Establezca la potencia del láser en 1%-2% haciendo clic en Láseres.
NOTA: Aumentar la potencia del láser también puede conducir a la fotoblanqueo o fototoxicidad. - Establezca la ganancia EM por debajo del nivel recomendado (< 800) haciendo clic en Ganancia maestra.
Nota : una ganancia em mayor puede generar artefactos. - Acerque la región o celda de interés para reducir el tiempo de adquisición de la imagen y reducir el fotoblanqueo. Esto también permite que el espécimen sobreviva por más tiempo.
- Inicie la captura de imagen de lapso de tiempo utilizando el modo Airyscan haciendo clic en Iniciar experimento.
- Antes de hacer clic en Iniciar experimento, asegúrese de que la adquisición está configurada de forma óptima.
- Si muestra una advertencia con el aviso "La adquisición de Airyscan no está configurada de forma óptima", haga clic en Óptimo en la sección de tamaño de fotograma, haga clic en Óptimo en la sección z-stack y haga clic en Óptimo para la sección de área de escaneo (se requiere un zoom mínimo de 1,3 para obtener imágenes de súper resolución).
- Optimice el intervalo de tiempo, el número de z-slices y la duración de la imagen de lapso de tiempo de acuerdo con el diseño experimental y el tipo de muestra, para que la calidad de la imagen no se vea comprometida y las células no se detendrán en etapas particulares del ciclo celular.
- Como ejemplo, los parámetros para la proyección de imagen del lapso de tiempo de los testículos de Drosophila que expresan egfp-marcado α-tubulina en germline temprano se muestran en los pasos siguientes.
- Para más de 5 h de imágenes de lapso de tiempo, la imagen en un intervalo de 10 minutos con 1% de potencia láser y tomar hasta 30 z-slices en cada punto de tiempo.
- Para procesos celulares altamente dinámicos, como la dinámica de microtúbulos, establezca un intervalo de 2 minutos entre los puntos de tiempo, realice imágenes de lapso de tiempo de 1 a 2 h al 1% de potencia del láser y tome hasta 30 cortes z en cada punto de tiempo.
- Para eventos celulares raros, como la dinámica de la cromatina de anafase a la telofasa temprana (eventos de 2-3 min), establezca imágenes de células vivas con un intervalo de 1 minuto entre los puntos de tiempo, realice imágenes de lapso de tiempo de 30 minutos al 1% de potencia del láser y tome hasta 30 z-slices en cada punto de tiempo.
NOTA: Estos parámetros pueden variar para diferentes muestras, por lo que la alteración será necesaria para un uso óptimo para la muestra específica.
- Realice la proyección de imagen del lapso de tiempo o la proyección de imagen viva de la instantánea, dependiendo de la sensibilidad de la muestra y del diseño experimental.
NOTA: Una película corta es de 15-30 minutos, y una película larga es más de 5 h. - Si la muestra es muy sensible y no puede ser estudiada por imágenes de lapso de tiempo con un microscopio de súper resolución, como suele ser el caso con drosophila macho GSCs, realizar una instantánea en vivo de super-resolución (SRLS) de la muestra en diferentes etapas del ciclo celular (como se muestra en la Figura 2, Figura 3, Figura 4).
- Si se está capturando un evento biológico celular raro o la proteína de interés tiene un bajo nivel de expresión, realice SRLS.
- Para SRLS, encuentre una célula en la etapa específica del ciclo celular en la que está interesado. Por ejemplo, si se centra en la unión de microtúbulos-kinetochore, a continuación, utilizar una célula en prometaphase o metafase.
NOTA: Esto ayudará a garantizar que obtenga una imagen de alta calidad de la célula de interés en el momento adecuado sin arriesgar la fototoxicidad de la muestra o el blanqueo de los fluoróforos, que puede ocurrir durante una película más larga. - Si utiliza SRLS, irrajure diferentes etapas del ciclo celular de interés en varias celdas y organice estas imágenes en orden cronológico.
NOTA: Esto se puede utilizar para construir un orden temporal de eventos mientras se maximiza la salud de la señal y el tejido, para obtener una excelente resolución temporal del evento para muestras particularmente sensibles o muestras con señal baja.
5. Procesamiento airyscan de las imágenes de células vivas
- Después de la adquisición de imágenes con el software de creación de imágenes, seleccione Procesamiento, haga clic en Lotey, a continuación, seleccione Procesamiento de Airyscan.
- Seleccione las imágenes que se van a procesar y, a continuación, haga clic en Ejecutar/Procesar para obtener las imágenes de supersecha.
- Realice el procesamiento con la configuración predeterminada.
NOTA: El procesamiento de Airyscan solo funcionará si la configuración de imágenes está establecida correctamente para las imágenes de Airyscan.
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Representative Results
La proyección de imagen viva de la célula más allá del límite de la difracción en tejido de Drosophila, especialmente para GSCs, proporciona una oportunidad de investigar la dinámica de eventos subcelulares en el contexto de la progresión del ciclo celular. Recientemente, un estudio que utiliza este protocolo ha mostrado que las actividades de los microtúbulos en el centrosoma de la madre contra el centrosoma de la hija son temporal asimétricas en GSCs10. El centrosoma de la madre emana microtúbulos aproximadamente 4 horas antes de la entrada mitotic, mientras que el centrosoma de la hija emana solamente microtúbulos en el inicio de la mitosis. Los microtúbulos altamente activos del centrosoma madre interactúan con la membrana nuclear e inducen la desintegración polarizada de la envoltura nuclear (NEBD). El NEBD local es próximo al cubo y permite que los microtúbulos del centrosoma de la madre entren en el núcleo y se adhieran preferentemente a la hermana más fuerte kinetochore y al centrómero de la hermana para asegurarse de que se segregan a la célula madre futura. Estas observaciones sugieren que exista un eje mitótico asimétrico en el que los microtúbulos, la membrana nuclear, el kinetochore, y los centrómeros obran recíprocamente de una manera espaciotemporal controlada, para asegurar la segregación no ucranial apropiada del cromosoma en última instancia10,11,12.
Cada uno de estos resultados fue apoyado usando el acercamiento SRLS descrito aquí. Mediante la realización de imágenes de células vivas de los testículos de Drosophila que expresan α-tubulina-GFP en células germinales en estadio temprano, pudimos identificar la asimetría temporal en la actividad de los microtúbulos en las GSCs(Figura 2). También pudimos ver la intensidad asimétrica de las señales de GFP en los dos centrosomas como una señal más brillante en el centrosoma madre y una señal relativamente más débil en el lado del centrosoma hijo utilizando un microscopio confocal de disco giratorio(Figura 2A). La diferencia de brillo es probablemente reflejada por la asimetría temporal de la nucleación de microtúbulos, pero la morfología detallada y la cantidad de microtúbulos no se pudieron resolver utilizando microscopía confocal de disco giratorio (Figura 2A). Por el contrario, las imágenes de super-resolución de células vivas nos permitieron, visualizar la morfología y cuantificar el número de microtúbulos (Figura 2B). Su resolución mejorada reveló patrones de nucleación asimétrica de microtúbulos, elongación y aumento de la interacción con la membrana nuclear(Figura 2B). Como ejemplos, las películas de lapso de tiempo de α-tubulina-GFP-que expresan GSCs se han publicado en un artículo de investigación primaria (Videos S3 y Video S5)10.
A continuación, se realizaron imágenes de células vivas en los testículos de Drosophila co-expresando ya sea α-Tubulina-GFP con Lamin-mCherry o α-Tubulina-mCherry con Lamin-GFP en células germinales en etapa temprana. Nuestros resultados muestran que la actividad asimétrica de los microtúbulos coincidió con la NEBD asimétrica en las GSCs(Figura 3). Usando el microscopio confocal de disco giratorio, pudimos visualizar la invaginación asimétrica de la membrana nuclear, pero no los microtúbulos individuales que entraron directamente en el núcleo(Figura 3A). Por el contrario, esta técnica de super-resolución de células vivas nos permitió observar directamente estos eventos mediante la obtención de imágenes tanto de los microtúbulos como de la lámina nuclear simultáneamente(Figura 3B).
A continuación, se realizaron imágenes de células vivas en los testículos de Drosophila que expresan α-Tubulina-mCherry y CENP-A-Dendra2 o CENP-A-GFP (Proteína Centromere A) en células germinales en etapa temprana. Para visualizar mejor el accesorio de microtúbulos y centrómeros, los imaginamos en vivo a una temperatura más baja (~ 18 ° C) para estabilizar su fijación. Si es necesario, la muestra se puede enfriar brevemente con hielo o medios de células vivas heladas durante 4-5 minutos para estabilizar la unión microtúbulo-centrómero y despolimerizar cualquier microtúbulo no unido. Nuestros resultados muestran que los microtúbulos que emanan del centrosoma madre activo temprano se unen preferentemente al centrómero hermano más fuerte(Figura 4). Usando el microscopio confocal de disco giratorio, las señales α-Tubulin-mCherry mostraban un brillo asimétrico cerca de los dos centrosomas. También pudimos detectar ambos centrómeros hermanos como una sola señal, como se muestra en la Figura 4A (metafase), pero no pudimos visualizar la unión microtúbulo-centrómero(Figura 4A, metafase). Por el contrario, la super-resolución de imágenes en vivo nos permitió visualizar la unión microtúbulo-centrómero (Figura 4B). Nuestros resultados muestran que los microtúbulos madre que emanan del centrosoma se unen al centrómero antes de los microtúbulos que emanan del centrosoma hijo(Figura 4B,profase temprana).
Figura 1: Esquema para la preparación y montaje del testículo de Drosophila. (A)Vista superior: el plato de cultivo celular con fondo de vidrio (A-a), transferir el testículo de Drosophila hacia el centro del plato (A-b), colocar una membrana de diálisis en la parte superior del testículo (A-c), colocar tres pesos plásticos en la membrana de diálisis (A-d). (B)Vista lateral: coloque el anillo de plástico en el lado elevado del plato (B-a), coloque un cubrebocas de 22 mm × 22 mm en el anillo de plástico (B-b), coloque un remolino y papel de seda húmedo en la tapa (B-c), cierre el plato con la tapa (B-d). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Imágenes de lapso de tiempo de super-resolución de la dinámica de microtúbulos en el tejido de Drosophila (testículos) que expresan α-tubulina-GFP (A)Microscopía confocal convencional imagen de células vivas que muestra la dinámica de los microtúbulos a mediados de la fase G2 a metafase. (B)Imagen de células vivas del microscopio airyscano que muestra microtúbulos asimétricos que emanan de los centrosomas madre contra hija a mediados de la fase G2 a la metafase, con información estructural detallada. Una caricatura representa la célula madre de la línea germinal masculina de Drosophila. Barra de escala: 5μm; asterisco: hub (nicho); flecha verde: madre centrosoma (lado de células madre [M]); flecha roja: centrosoma de la hija (diferenciando el lado de la célula de la hija [D]); flecha amarilla: centrosoma en células de espermatogonia (progenitores no madre de células germinales); flecha magenta: microtúbulos que se asoman en el núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Imágenes de lapso de tiempo de súper resolución de la actividad de poking-in de microtúbulos y la ruptura asimétrica de la envoltura nuclear en el tejido de Drosophila (testículos) co-expresando Lamin-mCherry y α-Tubulina-GFP. (A)Microscopía confocal convencional imagen de células vivas que muestra la dinámica de microtúbulos desde la fase G2-M hasta la mitosis. Imagen que muestra una mayor intensidad de α-tubulina-GFP en el lado de las células madre y su interacción con la membrana nuclear. (B)Imagen de células vivas del microscopio airyscano que muestra microtúbulos que se meten y nebd asimétrico en el lado de la célula madre. Barra de escala: 5μm; asterisco: hub (nicho); flecha naranja: sitio de los microtúbulos que asoman en la membrana nuclear; flecha magenta: microtúbulos que se asotran en el lado de las células madre. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Imágenes de lapso de tiempo de super resolución de microtúbulos y centrómeros en el tejido de Drosophila (testículos) que expresa α-Tubulina-mCherry y CENP-A-Dendra2. (A)Microscopía confocal convencional imagen de células vivas que muestra la interacción de microtúbulos y centrómeros desde la profase temprana a la metafase. Imagen que muestra una mayor intensidad de α-tubulina-mCherry en el lado de las células madre y la señal CENP-A-GFP. (B)Imagen de células vivas del microscopio airyscano que muestra microtúbulos que emanan del centrosoma madre y se une a los centrómeros más fuertes en la profase temprana. En la metafase, los centrómeros están unidos al polo opuesto (bi-orientación). Barra de escala: 5μm; asterisco: hub (nicho); flecha magenta: fibra de kinetochore o fibra K (microtúbulos unidos al centrómero). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Los métodos de microscopía de súper resolución proporcionan una resolución espacial tan alta como 10s de nanómetros4,5,6. Los métodos de microscopía STORM y PALM permiten una resolución de hasta 20 a 50 nm (resolución XY), mientras que la microscopía STED ofrece una resolución de 20 a 100 nm (resolución XY). La resolución espacial de la microscopía SIM está limitada a 100 a 130 nm15. Sin embargo, debido a su alta densidad de fotones y largo tiempo de adquisición, es extremadamente difícil utilizar estas técnicas para la obtención de imágenes de células vivas.
Las estructuras subcelulares de la proyección de imagen, tales como el citoesqueleto, los cromosomas, y los orgánulos en células vivas dentro de tejidos, requieren que la técnica sea ultrasensible y no invasor mientras que todavía tiene una alta resolución espacial. La técnica de super-resolución Airyscan presentada aquí combina imágenes confocales con un agujero de alfiler de unidad airy 0.2, junto con la reasignación y deconvolución de píxeles. Esta técnica puede alcanzar una resolución 1,7 veces mayor que la de la microscopía confocal convencional7. La resolución ~ 220-230 nm de la microscopía confocal convencional está restringida por el límite de difracción de la luz, pero esta técnica de imagen es capaz de lograr aproximadamente 140 nm de resolución XY, que es comparable a otras técnicas de súper resolución ampliamente utilizadas, como SIM (resolución a 110-120 nm)16.
La adaptabilidad y versatilidad de la microscopía confocal airyscana permitirá que este protocolo sea aplicable a varios otros tipos de tejidos y células para estudiar un número diverso de procesos de biología celular7,16. Utilizando esta técnica, los investigadores pueden obtener imágenes de lapso de tiempo a un nivel de súper resolución para visualizar la dinámica celular con un detalle espaciotemporal sin precedentes.
El paso crítico en esta técnica es montar la muestra en el plato para que no se mueva ni flote durante las imágenes de lapso de tiempo. Mantener la muestra cerca o pegada a la superficie de la imagen (es decir, el fondo de vidrio del plato) es fundamental para adquirir imágenes de súper resolución y mantener el microambiente óptimo para la muestra. Esto asegura que la muestra no esté estresada debido a condiciones como la hipoxia y los cambios de temperatura o humedad.
A pesar de la utilidad de este protocolo, hay algunas advertencias. La proyección de imagen del lapso de tiempo con el modo de Airyscan es un proceso relativamente lento comparado a la proyección de imagen confocal convencional del microscopio. Por lo tanto, incluso el más mínimo desplazamiento físico de la muestra podría resultar en una resolución deficiente. Esta situación se puede prevenir mediante el uso de un método de inmovilización para adherir las muestras a la superficie de la imagen (por ejemplo, recubrimiento de L-lisina de poli u otro recubrimiento compatible con la muestra). Además, colocar una membrana de diálisis en la parte superior del tejido y agregar algunos pesos pequeños como se describe en este protocolo ayuda a prevenir el movimiento del tejido o la flotación, al tiempo que permite el intercambio gaseoso. Las células de imágenes de lapso de tiempo que se encuentran en lo profundo del tejido con el modo de súper resolución requieren una alta iluminación y pueden causar fotoblanqueo. Esto se puede minimizar ajustando el número de sectores z, la potencia de iluminación y el algoritmo de promediación para lograr la configuración óptima para la muestra. Si la célula o el tejido es sensible a la toxicidad del láser, la hipoxia o cualquier otro estrés durante las imágenes, entonces puede ocurrir una detención del ciclo celular. Además, si una proteína tiene una expresión extremadamente baja, vida media corta o baja señal de fluorescencia, entonces puede ocurrir fotoblanqueamiento que resultará en una imagen con mala calidad. Esto se puede evitar tomando un SRLS, haciendo una película corta o disparando con intervalos largos entre puntos de tiempo consecutivos. Además, la configuración del microscopio y el parámetro de imágenes time-lapse (como se describe en este protocolo) deben optimizarse para ajustarse a la muestra.
Dado que es esencial que la muestra no se mueva ni degenere durante el proceso, las imágenes de lapso de tiempo prolongadas que duran durante la noche o más de un día sin comprometer la resolución de la imagen pueden ser un desafío.
Los métodos existentes se centran principalmente en la optimización de la microscopía de super-resolución y los parámetros de imagen de lapso de tiempo por separado1,9. Sin embargo, estos métodos no proporcionan detalles sobre la preparación de la muestra o los parámetros de montaje, que son fundamentales para garantizar la viabilidad de la muestra y la adaptabilidad del microscopio para lograr la super-resolución deseada durante la toma de imágenes de lapso de tiempo. En este método, hemos optimizado los parámetros de imagen, preparación de la muestra y parámetros de montaje para que las imágenes de lapso de tiempo se puedan realizar durante un período prolongado de tiempo para adquirir imágenes de súper resolución sin arriesgar tanto la degeneración de la muestra como la resolución.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.
Acknowledgments
A los autores les gustaría agradecer a las instalaciones de Integrated Imaging Core de la Universidad Johns Hopkins por los microscopios y el software de análisis de datos. Agradecemos a J. Snedeker y Q. E. Yu por la corrección de pruebas y sugerencias, y a los miembros del laboratorio X.C. por sus útiles discusiones y sugerencias. Con el apoyo de NIGMS/NIH R35GM127075, el Instituto Médico Howard Hughes, la Fundación David y Lucile Packard y los fondos de inicio de la Universidad Johns Hopkins (X.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. - 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. - 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
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