Summary
Un protocole pour la culture du parasite microsporidien Edhazardia aedis. Le parasite est transmis d’une génération de moustiques Aedes aegypti à l’autre par transfert horizontal au stade larvaire suivi d’une transmission verticale au stade adulte. Les sporoplasmes vivants survivent à long terme dans les œufs infectés.
Abstract
Edhazardia aedis est un parasite microsporidien des moustiques Aedes aegypti, un vecteur de la maladie qui transmet de multiples arbovirus qui causent des millions de cas de maladie chaque année. E. aedis provoque la mortalité et réduit la condition reproductive chez le moustique vecteur et a été exploré pour son potentiel en tant qu’agent de lutte biologique. Le protocole que nous présentons pour la culture d’E. aedis est basé sur son cycle d’infection naturel, qui implique à la fois la transmission horizontale et verticale à différents stades de vie de l’hôte moustique. Les moustiques Ae. aegypti sont exposés aux spores au stade larvaire. Ces larves infectées se développent ensuite en adultes et transmettent le parasite verticalement à leur progéniture. Les descendants infectés sont ensuite utilisés comme source de spores pour la transmission horizontale future. La culture d’E. aedis peut être difficile pour les non-initiés étant donné la complexité du cycle de vie du parasite, et ce protocole fournit des conseils détaillés et des aides visuelles pour la clarification.
Introduction
Aedes aegypti est le moustique vecteur de multiples arbovirus (dengue, Zika, fièvre jaune) qui, ensemble, sont estimés à des centaines de millions de cas de maladie chaque année et plus de 30.000 décès1,2. Le traitement des maladies causées par ces agents pathogènes se limite aux soins de soutien et il est probable que d’autres arbovirus émergeront àl’avenir 3. La lutte contre le moustique vecteur est donc d’une importance primordiale, car elle empêche efficacement la transmission d’agents pathogènes actuels etémergents 4. Traditionnellement, les stratégies de lutte antivectorielle utilisent principalement des insecticides chimiques, mais la résistance à de nombreux insecticides couramment utilisés a stimulé la demande de nouvelles méthodes de lutte antivectorielle. Un agent potentiel qui a été exploré pour ses propriétés de lutte biologique contre Ae. aegypti est le parasite Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, identifié pour la première fois comme Nosema aedis par Kudo en 1930, est un parasite microsporidien des moustiques Ae. aegypti 7. Le développement et la reproduction d’E. aedis est relativement complexe et son cycle de vie peut sedérouler de multiples façons 7,8,9. Un cycle de développement commun est décrit en profondeur dans Becnel et coll., 19897 et est utilisé pour la propagation en laboratoire (figure 1)8. Brièvement, le cycle commence lorsque les œufs d’Ae. aegypti infectés verticalement par E. aedis éclosent en larves infectées qui développent des spores uninucléaires dans le corps gras, et meurent habituellement sous forme de larves ou de pupes. Les spores uninucléaires libérées par les larves mortes contaminent l’habitat et sont ingérées par des larves saines d’Ae. aegypti. Ces spores germent principalement dans le tube digestif, infectant le tissu digestif des larves exposées, entraînant une transmission horizontale. Les larves infectées horizontalement se développent en adultes (génération parentale) où des spores de binucléate sont formées. Chez la femelle, ces spores de binucléate envahissent l’appareil reproducteur et leur sporoplasme associé infecte le développement des ovocytes. Ces œufs éclosent ensuite en larves infectées (génération filiale), ce qui entraîne la transmission verticale du parasite et la poursuite du cycle tel que décrit ci-dessus.
Plusieurs études ont étudié le potentiel de E. aedis pour la lutte biologique. L’infection par E. aedis a été démontrée pour avoir comme conséquence la capacité reproductrice diminuée des femelles d’Ae. aegypti 10. En outre, dans une expérience semi-champ, la libération inondante d’E. aedis a eu comme conséquence l’éradication totale d’une population d’Ae. aegypti d’essai maintenue dans un encloscriblé 6. Bien qu’il puisse subir certains stades de développement chez un ensemble diversifié d’espèces de moustiques, E. aedis n’est transmis verticalement qu’à Ae. aegypti,ce qui indique un degré élevé de spécificitéde l’hôte 11,12. De même, dans une évaluation en laboratoire du risque environnemental potentiel associé à E. aedis, le parasite microsporidien n’a pas infecté la faune aquatique non cible, y compris les prédateurs qui ont ingéré les larves d’Ae. aegypti infectées par E. aedis13. Ces résultats mettent en évidence le potentiel d’e. aedis à utiliser dans les stratégies de lutte biologique ciblant les populations naturelles d’Ae. aegypti.
Malgré le fait qu’E. aedis se montre prometteur pour une utilisation dans la lutte antivectorielle, il y a des défis à relever pour la culture et son déploiement à grande échelle. Les spores d’É. aedis perdent leur infectiosité en moins d’une journée à des températures froides (c.-à-d. 5 °C). Même à des températures plus chaudes (c.-à-d. 25 °C), les spores perdent rapidement leur infectiosité au cours de troissemaines 14. En outre, E. aedis doit être cultivé dans les moustiques Ae. aegypti vivants et le dosage contrôlé des moustiques larvaires sains est nécessaire pour assurer l’achèvement du cycle de vie et pour empêcher l’effondrement de la population utilisée pour la culture8. L’exigence de la culture in vivo présente un défi; toutefois, les progrès récents dans l’élevage de masse des moustiques et la robotique (p. ex., Massaro et coll.15)pourraient permettre la production à grande échelle de spores d’E. aedis. Nous prévoyons que la visualisation de cette méthodologie augmentera l’accessibilité au protocole d’élevage e. aedis et permettra à un plus grand nombre de chercheurs d’étudier la biologie de base et le potentiel appliqué de ce système. Nous prévoyons également qu’il facilitera les collaborations accrues avec les ingénieurs, les roboticiens et le secteur technologique en général, ce qui pourrait améliorer l’élevage de masse d’E. aedis.
Figure 1: E. aedis propagation dans Ae. aegypti. La propagation de l’édis commence par l’éclosion d’œufs infectés par E. aedis. Les larves infectées sont élevés à 4e stade, les spores d’E. aedis sont isolées de ces larves, et les spores sont utilisées pour infecter oralement les larves saines de 2nd/3rd instar élevés à partir d’une couvée non infectée d’œufs (transmission horizontale). Ces larves infectées par voie orale sont ensuite élevés à l’âge adulte (génération parentale) et pondent des œufs infectés par E. aedis (transmission verticale). Les œufs infectés (génération filiale) sont ensuite éclos pour poursuivre le cycle d’infection et la culture des parasites. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Protocol
1. Jour 0
- Hatch Ae. aegypti oeufs infectés par E. aedis en plaçant dans le plateau d’élevage larvaire avec 1 L d’eau déionisée (DI). Ajouter 50 mg de nourriture pour poissons.
REMARQUE : Au moment de la publication, une souche de laboratoire d’E. aedis n’est disponible que dans les laboratoires qui recherchent activement le parasite, car E. aedis n’est pas utilisable pour le stockage à long terme et les œufs infectés ne sont pas actuellement stockés dans des dépôts. Les chercheurs intéressés à travailler avec E. aedis peuvent contacter l’auteur correspondant pour demander des œufs infectés.
REMARQUE : L’éclosion d’un grand nombre d’œufs infectés n’est généralement pas nécessaire; dix larves d’E. aedis infectées par Ae. aegypti sont suffisantes pour ≥ 1000 larves en bonne santé.
REMARQUE : Pour toutes les parties de ce protocole, nous avons hébergé des moustiques aux conditions suivantes : 14 h/10 h de cycle clair/sombre, 27 °C de température et 80 % d’humidité relative.
2. Jour 1
- Après l’éclosion, réduire la densité des larves à ~ 100 larves par plateau, ce qui rend de nouveaux plateaux au besoin (également avec 1 L d’eau DI).
- Ajouter un morceau de nourriture sèche pour chats à chaque plateau. Reconstituer les aliments lorsqu’ils sont épuisés, mais ne pas fournir un excès de nourriture. Un morceau de nourriture pour chats (~200 mg) tous les trois jours suffit.
REMARQUE : Ajustez la quantité alimentaire en fonction des conditions d’élevage spécifiques (c.-à-d. réduisez la nourriture si l’eau devient trouble ou si les larves meurent, augmentez la nourriture si les larves sont gravement retardées dans leur développement). D’autres régimes d’alimentation et/ou conditions d’élevage que ceux suggérés ici peuvent être utilisés, mais des ajustements au calendrier de ce protocole standard peuvent être nécessaires.
3. Jours 4\u20125
- Lorsque les larves infectées sont3e à4 e stades, éclosez des œufs Ae. aegypti sains ou non infectés dans un nouveau plateau.
- Arrière à densités telles que sain Ae. aegypti atteindre 2nd - 3ème instar en 48-72 h. Dans nos mains, cela peut être réalisé en utilisant des densités de 200\u2012300 larves par 1 L d’eau avec accès ad libitum à la nourriture. L’éclosion de lots d’œufs sains sur plusieurs jours peut garantir que les larves sont au bon stade au besoin.
4. Jours 7\u20128: Transmission horizontale
REMARQUE : Le dosage de larves saines avec E. aedis ne peut être effectué tant que les spores de uninucléate ne sont pas très nombreuses chez les larves infectées (1 x 104 – 1 x 106 par larve). Cela se produit tard dans la phase4 e instar (Figure 2).
- Récolter et quantifier les spores de uninucléate.
- Utilisez une pipette de transfert (il se peut qu’il soit temps de couper la pointe à un diamètre plus large) pour déplacer 10 larves infectées vers un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
- Retirer l’eau de reproduction avec un pipet de transfert et laver une fois en ajoutant ~ 1 mL d’eau propre DI. Retirer l’eau de lavage à l’aide d’un pipet, ajouter 500 μL d’eau propre di aux 10 larves et homogénéiser à l’aide d’un pilon et d’un homogénéisateur mécanique.
- Quantifier les spores à l’aide d’un hémocytomètre à 400 x grossissement.
REMARQUE : Les spores uninucléaires peuvent être identifiées par leur forme pyriforme distincte (c.-à-d. forme de poire; Figure 2A).
- Dose saine larves d’Ae. aegypti avec E. aedis.
- Faire du lisier frais en mélangeant 1,2 g de poudre de foie, 0,8 g de levure de bière et 100 mL d’eau.
REMARQUE : Les aliments n’ont pas besoin d’être frais s’ils sont autoclavés et conservés à 4 °C jusqu’à utilisation. - Transférer 100 2nd – 3rd instar en bonne santé larves d’Ae. aegypti en beakers ou tasses à spécimens de 150 mL.
- Dosez chaque bécher de 100 larves de 5 x 104 à 1 x 105 spores.
- Ajouter 2 mL de boue alimentaire larvaire et d’eau DI à un volume final de 100 mL.
- Faire du lisier frais en mélangeant 1,2 g de poudre de foie, 0,8 g de levure de bière et 100 mL d’eau.
- Après 12 à 24 h d’exposition, transférer les larves exposées dans des plateaux d’élevage et les élever à l’âge adulte selon un protocole d’élevage standard16.
5. Surveillance et transmission verticale
- Surveillez les larves dosées pour la pupaation et transférez les pupes au fur et à mesure qu’elles se développent vers une tasse d’émergence dans une cage. Sucre nourrir les adultes ad libitum (selon16,17). Les adultes qui s’enferment seront infectés par E. aedis.
- Les adultes nourris au sang (selon16,17) et recueillir des œufs. La transmission verticale d’E. aedis se produit à cette étape.
REMARQUE : Si des repas sanguins supplémentaires sont fournis dès que l’oviposition est terminée, les femelles peuvent pondre au moins une couvée supplémentaire d’œufs avant que les adultes ne souffrent de taux de mortalité (souvent soudains) élevés. - Utilisez ces oeufs Ae. aegypti infectés par E. aedis pour continuer la propagation en commençant par l’étape 1 de ce protocole.
REMARQUE : Les œufs peuvent être conservés pendant 2 à 3 mois dans des conditionsappropriées 16. - Nettoyez tous les matériaux qui sont entrés en contact avec E. aedis avec 10% d’eau de Javel et d’autoclaving (si possible) pour prévenir la contamination.
Representative Results
E. aedis infecté Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12) oeufs ont été éclos comme décrit dans le protocole ci-dessus. Au stade du4e stade, des signes visuels d’infection ont pu être observés, y compris des kystes de spores blanches dans tout le corps gras des larves infectées (un exemple de ce phénotype est montré dans la figure 2B). Les spores uninucléaires ont été récoltées à partirde 4 larves de stade en homogénéisant 10 larves dans 500 μL d’eau DI. Ces spores étaient pyriformes (en forme de poire) et facilement visibles à 400x (Figure 2A). À l’aide d’un hémocytomètre, un nombre de spores de 4,05 x10 3 spores/μL a été calculé. Cent larves saines d’Ae. aegypti ont ensuite été infectées horizontalement par ~50 000 spores dans de l’eau de 100 mL pour une dose finale d’environ 500 spores/larves. Les larves ont été élevés à l’âge adulte (génération parentale) et le sang nourri à l’aide de sang de lapin défibriné plus 1 % (v/v) 100 mM de triphosphate d’adénosine. Des oeufs infectés verticalement ont été recueillis (génération filiale) et éclos pour continuer la propagation d’E. aedis et pour quantifier le succès d’infection.
À sept jours après l’éclosion, 25 larves de génération filiale ont été transférées dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 mL et lavées une fois avec de l’eau DI. Les larves individuelles ont été homogénéisées dans 250 μL d’eau DI et l’état d’infection et les charges d’E. aedis ont été évaluées à l’aide d’un hémocytomètre. Le taux d’infection verticale d’E. aedis dans la génération filiale s’est révélé être de 96 % et la charge moyenne de spores des personnes infectées à sept jours après l’éclosion était de 3,31 x 105 (plage : 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Figure 3).
Figure 2 : Visualisation de l’infection à E. aedis chez les moustiques Ae. aegypti. (A) E. aedis uninucléate spores pyriformes. Dix larves infectées par E. aedis 4 e stade ont été homogénéisées dans 500 μL d’eau DI environ sept jours après l’éclosion. 10 μL de l’homogénéate ont été chargés sur un hémcytomètre et vus à 400X. Les flèches rouges indiquent des spores représentatives de l’uninucléate E. aedis. (B) E. aedis infectés 4e larves de instar développent des kystes distinctifs spore blanche dans tout leur corps gras18. Ils ont également généralement malformé et distendu segments abdominaux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le protocole de culture mène à l’infection efficace d’E. aedis dans la génération filiale. Les larves d’aegypti (n = 25) de la génération filiale ont été homogénéisées individuellement dans 250 μL d’eau DI et 10 μL de l’homogénéate ont été chargés sur un hémocytomètre. La présence de spores uninucléaires a indiqué une infection positive et les spores ont été quantifiées pour tous les échantillons positifs. (A) Prévalence de l’infection chez les larves filiales. Le gris correspond aux larves non infectées, et le noir à infecté. Les nombres affichés sur chaque segment donnent le nombre absolu d’individus dans chaque groupe. (B) Charge de spores pour chaque individu infecté. Les points noirs représentent le nombre de spores uninucléaires transformées de10 billots pour chaque larve. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Nous présentons ici la méthode décrite à l’origine dans Hembree et Ryan, 19828 pour élever E. aedis microsporidia chez les moustiques Ae. aegypti. La souche d’E. aedis utilisée dans cette étude a été dérivée de la collection originale sur le terrain par Stephen Hembree en Thaïlande en 197919. La méthode capitalise sur la transmission horizontale, qui se produit naturellement dans le cycle de transmission de E. aedis7, pour propager le parasite d’une manière contrôlée. Cette méthode peut être difficile pour les nouveaux arrivants qui ne sont pas familiers avec l’apparence des spores, les symptômes de l’infection chez les larves, ou la coordination nécessaire pour terminer avec succès le protocole d’élevage et de dosage à plusieurs étapes. Nous espérons que les aides visuelles qui accompagnent ce protocole réduiront les obstacles à l’entrée pour les chercheurs qui souhaitent faire de la culture E. aedis.
Nous avons propagé E. aedis dans Ae. aegypti tel que décrit ci-dessus et quantifié le succès du parasitisme dans la génération filiale. En bref, nous avons éclos des œufs D’Ae. aegypti infectés par E. aedis, les avonsélevés à 4 e stade et avons recueilli des spores uninucléées d’E. aedis provenant des larves infectées. Nous avons ensuite infecté horizontalement des larves saines avec ces spores par ingestion orale, et élevé les larves infectées horizontalement à l’âge adulte. Nous avons nourri les adultes infectés (génération parentale) et recueilli des ovules (génération filiale), que nous avons supposé être infectés verticalement par le parasite E. aedis. Nous avons éclos des œufs de la génération filiale et recueilli et homogénéisé un sous-ensemble de larves quandils étaient 4 e instars. Nous avons quantifié le pourcentage de larves infectées par e. aedis et le nombre total de spores chez toutes les personnes infectées. Nous avons constaté que la grande majorité (96 %) des individus ont été infectés et la charge moyenne de spores des larves infectées était d’environ 105. Nous concluons que notre protocole d’élevage a eu comme conséquence la propagation fortement réussie d’E. aedis dans les moustiques d’Ae. aegypti.
Il y a plusieurs aspects de ce protocole qui peuvent être particulièrement difficiles pour l’utilisateur non initié. Nous offrons ci-dessous quelques informations supplémentaires qui peuvent être utiles. Pour les questions concernant l’élevage général des moustiques, un guide complet de l’entretien de la colonie d’Ae. aegypti dépasse le cadre de ce protocole. Toutefois, de nombreuses questions courantes peuvent être abordées par les ressources du dépôt de ressources de recherche sur les biodéfenses et les infections émergentes16,17, y compris l’éclosion d’œufs, les besoins alimentaires généraux, le logement et les conditions environnementales, et l’alimentation sanguine. En ce qui concerne la chronologie de l’infection, les larves écloses à partir d’œufs infectés ne montrent aucun signe d’infection avant la fin dustade du 4e stade. Les spores uninucléaires apparaissent rapidement, en l’état de 1 à 2 jours. Les larves peuvent sembler pratiquement inchangées à 6 jours après l’éclosion, mais fortement infectées au jour 7 ou 8 après l’éclosion. En outre, il peut être difficile de visualiser les spores dans des échantillons homogénéisés parce qu’il existe de nombreux autres microbes présents dans les homogénéités des moustiques entiers, y compris d’autres organismes eucaryotes unicellulaires (p. ex., levure) de taille similaire à celle des spores uninucléaires E. aedis. La forme distinctive des spores d’E. aedis (figure 2A) est une méthode très fiable pour l’identification et aidera à différencier E. aedis des autres microbes de l’homogénéité. Bien qu’il ne soit pas nécessaire pour l’identification ou la quantification, si la purification des spores est souhaitée, elle peut être obtenue par centrifugation colloïdale de gradient de densité de silice qui permettra la séparation des spores d’E. aedis d’autres éléments contaminants dans l’homogénéité. Ce processus est décrit en détail dans Solter et coll.20.
La température et l’alimentation utilisées dans les pratiques d’élevage diffèrent généralement d’un laboratoire à l’autre, mais les variations donneront probablement encore lieu à une propagation réussie des parasites. Les différences mineures dans le type d’aliment larvaire n’interfèrent pas avec l’infection réussie, bien que nous n’avons pas explicitement testé différents types d’aliments dans ce protocole. L’effet de la température sur l’infection a été testé et l’infection à E. aedis s’est révélé robuste à un large éventail detempératures 21. La production maximale de spores s’est produite à 30,8 °C, mais elle était toujours robuste à des températures d’élevage aussi basses que 20 °C. Le nombre de spores a été considérablement réduit à des températures d’élevage plus élevées (36 °C), c’est pourquoi ces températures devraient être évitées pour ce protocole.
La contamination est toujours une préoccupation lorsque l’on travaille avec des parasites. E. aedis est un parasite réussi d’Ae. aegypti et doit donc être séparé des colonies de laboratoire non infectées pour éviter la contamination. Nous recommandons le stockage des moustiques infectés dans un incubateur séparé si possible. Nous avons également recommandé que les matériaux utilisés pour les travaux de microsporidie (p. ex., plateaux larvaires, pipets de transfert, cages, tasses de collecte d’œufs) soient désignés pour les travaux de microsporidie et ne soient pas utilisés plus largement dans l’insecte. Tous les matériaux d’élevage doivent être stérilisés avec 10% d’eau de Javel après utilisation et autoclaving peut être utilisé pour compléter la stérilisation de l’eau de Javel.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Spencer Blankenship pour son aide dans l’élevage des moustiques. Nous remercions également James N. Radl et M. Dominique Magistrado pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
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