Summary
培养微孢子寄生虫Edhazardia aedis的规程。寄生虫从一代伊蚊通过幼虫阶段的水平转移传递到下一代，随后在成人阶段垂直传播。活的精子在受感染的卵子中长期存活。
Abstract
Edhazardia aedis是伊蚊的微孢子寄生虫，伊蚊是一种传播多种病毒的病媒，每年导致数百万例疾病病例。E. aedis导致蚊媒的死亡和繁殖能力下降，并已被探索其作为生物控制剂的潜力。我们为培养E.aedis而呈现的协议基于其自然感染周期，它涉及蚊子宿主不同生命阶段的水平和垂直传播。ae. aegypti蚊子在幼虫阶段暴露在孢子中。这些受感染的幼虫然后成熟成成人，并将寄生虫垂直传至后代。然后，受感染的后代被用作孢子的来源，用于未来的水平传播。鉴于寄生虫的生命周期的复杂性，培养E.aedis对未启动者可能具有挑战性，该协议提供了详细的指导和视觉辅助工具，用于澄清。
Introduction
伊蚊是多种病毒（如登革热、寨卡、黄热病）的蚊媒，估计每年可导致数亿例疾病病例，12人死亡3万多人。这些病原体引起的疾病的治疗仅限于支持性护理，而且未来3日可能会出现更多的病毒。因此，控制蚊媒是首要的，因为它有效地防止了当前和新出现的病原体的传播。传统上，病媒控制战略主要使用化学杀虫剂，但对许多常用杀虫剂的抗药性推动了对病媒控制新方法的需求。一个潜在的代理，已被探索的生物控制性质对艾吉普提是寄生虫Edhazardia aedis5，6。
E.aedis，1930年由库多首次确定为诺塞玛伊迪斯，是一种微型寄生虫，是7种阿吉普提蚊子的微生物寄生虫。 E.aedis的开发和繁殖是比较复杂的，其生命周期可以以多种方式进行7、8、9。一个常见的发育周期在贝克内尔等人，1989年7日深入描述，并用于实验室传播（图1）8。简言之，当Ae.aegypti卵子垂直感染E.aedis孵化成受感染的幼虫时，这个周期就开始了，幼虫体内会形成单核孢子，通常以幼虫或幼虫死亡。从死幼虫中释放的核孢子污染了栖息地，并由健康的Ae. aegypti 幼虫摄入。这些孢子主要在消化道发芽，感染暴露的幼虫的消化组织，导致水平传播。水平感染的幼虫发育成成人（父母生成），在那里形成双核孢子。在女性中，这些双核糖孢子侵入生殖道，其相关的孢子体感染发育中的卵细胞。这些卵子然后孵化成受感染的幼虫（孝长），导致寄生虫的垂直传播和循环的延续，如上所述。
多项研究已经调查了E.aedis在生物控制方面的潜力。感染E.aedis已经证明会导致10岁女性繁殖能力下降。此外，在半场实验中，E.aedis的淹没释放导致完全消灭了保存在筛选的外壳6中的一个测试Ae. aegypti 种群。虽然E.aedis能够在多种蚊子中经历一些发展阶段，但只在E.aegypti中垂直传播，表明宿主特异性11，12。同样，在实验室评估与E.aedis相关的潜在环境风险时，微孢子寄生虫未能感染非目标水生动物，包括摄入感染E.aedis13的食肉动物。这些结果突出了E.aedis在针对自然Ae. aegypti 种群的生物控制策略中使用的潜力。
尽管E. aedis 在矢量控制中显示出了使用的希望，但大规模培养和部署它却面临挑战。E. aedis孢子在低温（即5°C）下不到一天就会失去感染性。即使在温暖的温度（即25°C）下，孢子在三周14日之间迅速失去感染力。此外，必须培养活的艾吉普提蚊子和控制给健康的幼虫蚊子给，以确保完成生命周期，并防止用于培养8的人口崩溃。体内培养的要求提出了挑战;然而，最近蚊子大规模饲养和机器人技术（如马萨罗等人15）的进步可能允许大规模生成E.aedis孢子。我们预计，这种方法的可视化将增加对E.aedis饲养协议的可访问性，并允许更多的研究人员研究该系统的基本生物学和应用潜力。我们还预计，这将促进与工程师、机器人学家和更广泛的技术部门加强合作，从而有助于改善E.aedis的大规模饲养。
图1：E.aedis在艾吉普提的传播。 E.aedis 的传播始于孵化E. aedis 感染的卵子。受感染的幼虫被饲养到第4个星，E.aedis孢子从这些幼虫中分离出来，孢子用于口头感染健康的2/3第三星幼虫，这些幼虫从未受感染的卵子（水平传输）中饲养。这些口头感染的幼虫然后被饲养到成年（父母一代），并产卵感染E.aedis（垂直传播）。受感染的卵子（孝生代）然后孵化，以继续感染周期和寄生虫培养。请单击此处查看此图的较大版本。
Protocol
1. 第 0 天
- 将 1升（DI） 水放入幼虫饲养托盘中，将蛋类蛋与 E.aedis 感染。加入50毫克的鱼食。
注：在出版时 ，E.aedis的实验室 菌株只能从积极研究寄生虫的实验室获得， 因为E.aedis 不能长期储存，受感染的卵子目前不储存在储存库中。有兴趣与 E.aedis合作的研究人员 可以联系相应的作者，请求受感染的卵子。
注：通常不需要孵化大量受感染的鸡蛋; 10个E.aedis 感染的 E.aegypti 幼虫足以给1000≥剂量。
注：对于本协议的所有部分，我们在以下条件下安置蚊子：14 小时/10 小时光/暗循环、27 °C 温度和 80% 相对湿度。
2. 第 1 天
- 孵化后，将幼虫密度降低至每托盘+100幼虫，必要时制作新托盘（也用1升DI水）。
- 在每个托盘中加入一块干猫粮。耗尽食物后补充食物，但不提供过量的食物。每三天一块猫粮（约200毫克）就足够了。
注：根据特定的饲养条件调整食物量（即，如果水变得浑浊或幼虫死亡，减少食物;如果幼虫发育严重延迟，则减少食物）。可以使用此处建议的其他喂养方案和/或饲养条件，但可能需要调整此标准协议的时间安排。
3. 第 4 天\u20125
- 当受感染的幼虫是3~4星时，在一个新的托盘中孵化出健康/未受感染的Ee.aegypti卵子。
- 后方的密度， 使健康的 Ae. aegypti 达到2 + 3第 三星在 48 - 72 小时。在我们手中，这可以通过密度200\u2012300幼虫每1升水与 副利比 图姆获得食物。多日孵化一批健康卵子可以保证幼虫在需要的时候处于正确的阶段。
4. 第 7 天\u20128： 水平传输
注：在感染幼虫中，在单核孢子数量高（1 x 104 = 1 x 106 6，每个幼虫）中，不能对健康的幼虫进行对健康的幼虫的给给。这发生在第4星阶段的后期（图2）。
- 收获和量化单核孢子。
- 使用转移移液器（可能需要将尖端切到更宽的直径）将 10 个受感染的幼虫移动到 1.5 mL 微离心管。
- 用转移移液去除育种水，加入±1 mL的清洁DI水洗一次。用移液去除洗涤水，在10个幼虫中加入500μL的清洁DI水，并使用害虫和机械均质器均质化。
- 使用血细胞计以 400 倍的放大倍率量化孢子。
注：核糖孢子可以通过其独特的火种形状（即梨形）来识别;图2A）。
- 剂量 健康 Ae. aegypti 幼虫与 E. aedis.
- 混合1.2克肝粉、0.8克啤酒酵母和100 mL水，制作新鲜的幼虫食品浆料。
注：如果食物被自动保存并储存在4°C，直到使用，就不需要新鲜。 - 将 1002 – 3第 3 个星健康 Ae. aegypti 幼虫转移到 150 mL 烧杯或标本杯中。
- 剂量每个烧杯100幼虫与5 x 104 × 1 x 105 孢子。
- 将 2 mL 的幼虫食物浆料和 DI 水加入到 100 mL 的最终体积中。
- 混合1.2克肝粉、0.8克啤酒酵母和100 mL水，制作新鲜的幼虫食品浆料。
- 在12~24小时暴露后，按照标准的饲养方案16将暴露的幼虫转移到饲养托盘和成年后。
5. 监测和垂直传输
- 监测被点幼虫的幼崽，并在它们发育到笼子里出现杯时，将幼虫转移到它们。糖饲料成人广告（根据16，17）。与成人接触的成人将被感染。
- 血液喂养成人（根据16，17）和收集鸡蛋。E. aedis 的垂直传输在此步骤中发生。
注：如果一旦卵巢完成就提供额外的血餐，女性在成人遭受（通常是突然）高死亡率之前，至少可以多产一组卵子。 - 使用这些 感染 E. aedis 的 Ae. aegypti 卵子 ，从本协议的第 1 步开始继续繁殖。
注：鸡蛋在适当条件下可储存2~3个月。 - 用 10% 漂白剂和高压灭灭（如果可能）清洁所有与 E. aedis 接触的材料，以防止污染。
Representative Results
E. aedis感染了Ae. aegypti利物浦 （LVP1b12） 鸡蛋孵化，如上述协议所述。在第4个星形阶段，可以观察到感染的视觉迹象，包括整个受感染幼虫的脂肪体中的白孢子囊肿（图2B所示）。核糖孢子是在500μL DI水中均质10幼虫，从第4个星体幼虫中收获的。这些孢子是火种（梨形），在400倍时很容易看到（图2A）。使用血细胞计计算孢子计数为4.05 x 103孢子/μL。100个健康的Ee.aegypti幼虫随后在100 mL水中水平感染50，000个孢子，最终剂量为500个孢子/幼虫。幼虫被饲养到成年（父母一代）和血液喂养使用除颤的兔血加上1%（v/v）100 mM腺苷三磷酸盐。垂直感染的卵子被收集（孝代）和孵化，以继续E.aedis繁殖和量化感染成功。
在孵化后7天，25个孝感代幼虫被转移到单独的1.5 mL微离心管中，用DI水洗涤一次。在250μL的DI水和感染状态中，个体幼虫均质化，使用血细胞计评估E.aedis负载。发现孝感代E.aedis的垂直感染率为96%，孵化后7天感染者平均孢子负荷为3.31×105（范围：3.25×104 ~1.47×106;图3.
图2：Ae.aegypti蚊子的E.aedis感染的可视化。（A ） E. aedis单核状孢子.10个E.aedis感染的第4个星幼虫在孵化后大约7天在500μL的DI水中均质化。10 μL 的均质被加载到血细胞计上，以 400 倍的速度查看。红色箭头表示具有代表性的单核E. aedis孢子。（B） E.aedis感染第4个星体幼虫在其脂肪体中形成独特的白色孢子囊肿18。他们通常也有畸形和扩张的腹部部分。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：文化协议导致孝感 代有效 感染。孝感代的 Ae. aegypti 幼虫 （n = 25） 在 250 μL DI 水中单独均质，10 μL 的均质被加载到血细胞计上。单核孢子的存在表明感染呈阳性，孢子被量化为所有阳性样本。（A） 孝感幼虫感染的流行率。灰色对应于未感染的幼虫，黑色对应于感染。每个段上显示的数字给出每个组中个人的绝对计数。（B） 每个感染者的孢子负载。黑点表示每个幼虫的日志 10 转化的单核孢子计数。 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
我们在这里介绍最初在亨布里和瑞安中描述的方法，1982年8月8日，在艾艾普提蚊子中饲养E.aedis微孢子。 本研究中使用的E.aedis菌株来源于1979年19月19日斯蒂芬·亨布里在泰国的原始现场收集。该方法利用水平传播，这自然发生在E.aedis7的传输周期，以受控的方式传播寄生虫。对于不熟悉孢子外观、幼虫感染症状或成功完成多阶段饲养/给法协议所需的协调的新人，此方法可能具有挑战性。我们希望，伴随该协议的视觉辅助工具将减少研究人员的进入障碍，他们希望培养E.aedis。
我们如上文所述在艾吉普提传播了E.aedis，并量化了孝顺一代寄生虫的成功。简言之，我们孵化了E.aedis感染的E.aegypti卵子，把它们饲养到第4个星，从受感染的幼虫中收集了单核E.aedis孢子。然后，我们通过口服摄入用这些孢子水平感染健康幼虫，并饲养水平感染的幼虫到成年。我们用血喂养受感染的成年人（父母一代），并采集卵子（孝生一代），我们假设这些卵子会垂直感染E.aedis寄生虫。我们从孝感一代孵化出卵子，在幼崽是第4个星时，采集并同化了一部分幼虫。我们量化了感染E.aedis的幼虫百分比和所有感染者的总孢子数。我们发现绝大多数（96%）被感染者，被感染幼虫平均孢子负荷为+105。我们的结论是，我们的饲养协议在艾吉普提蚊子中非常成功地传播了E.aedis。
此协议有多个方面对未启动的用户可能特别具有挑战性。我们提供以下一些可能提供帮助的其他信息。对于一般蚊子饲养的问题，Ae. aegypti菌落维护的完整指南超出了本协议的范围。然而，许多常见问题可以通过来自生物防御和新兴感染研究资源库16，17的资源可以解决，包括卵子孵化，一般饮食需求，住房和环境条件，以及血液喂养。关于感染的时间表，从受感染的卵子中孵化的幼虫直到4号星期后期才出现感染迹象。在1~2天中，核糖孢子迅速出现。幼虫在孵化后6天可能看起来几乎未感染，但在第7天或第8天孵化后感染高度。此外，在均质样品中可视化孢子可能具有挑战性，因为整个蚊子同质质中存在许多其他微生物，包括与E. aedis单核孢子大小相类似的其他真核单细胞生物（例如酵母）。E.aedis孢子的独特形状（图2A）是一种高度可靠的识别方法，有助于将E.aedis与同质质的其他微生物区分开来。虽然不需要进行鉴定或定量，但如果需要孢子纯化，可以通过胶体二氧化硅密度梯度离心实现，从而允许将E.aedis孢子与同质质的其他污染元素分离。这个过程在Salter等人20中详细描述了。
在饲养实践中使用的温度和饮食在实验室之间通常有所不同，但变异仍可能产生成功的寄生虫传播。幼虫食物类型的细微差异不会干扰成功感染，尽管我们没有明确测试此协议中不同的食物类型。温度对感染的影响已经过测试，在21日的广泛温度下，发现 E.aedis 感染是健壮的。最大孢子产量发生在30.8 °C，但在饲养温度低至20°C时仍然强劲。 孢子计数在较高的饲养温度（36°C）下显著减少，因此本协议应避免这些温度。
在使用寄生虫时，污染始终是一个问题。 E. aedis 是 Ae. aegypti 的一种成功的寄生虫 ，因此必须与未受感染的实验室菌落分开以防止污染。如果可能，我们建议将受感染的蚊子储存在单独的孵化器中。我们还建议，用于微孢子工作的材料（如幼虫托盘、转移移液管、笼子、鸡蛋收集杯）指定用于微孢子工作，而不是在整个昆虫中更广泛地使用。所有饲养材料应在使用后用 10% 漂白剂消毒，并可用于补充漂白剂灭菌。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢斯宾塞·布兰肯希普在蚊子饲养方面的帮助。我们还感谢詹姆斯·拉德尔和多米尼克·马吉斯特拉多对手稿的有益反馈。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
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