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Biochemistry

タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61580
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

Summary

タンパク質の高速光化学酸化は、タンパク質の構造特性を示す新たな手法です。異なる溶媒添加剤およびリガンドは、ヒドロキシルラジカル清掃特性を多様に有している。異なる条件でタンパク質構造を比較するために、反応で生成されたヒドロキシルラジカルのリアルタイム補償が反応条件を正常化するために必要である。

Abstract

タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、タンパク質の溶媒にアクセス可能な表面積をプローブする質量分析ベースの構造生物学技術です。この技術は、溶液中で自由に拡散するヒドロキシルラジカルとのアミノ酸側鎖の反応に依存する。FPOPは過酸化水素のレーザー光分解によってその際にこれらのラジカルを生成し、マイクロ秒のオーダーで枯渇するヒドロキシルラジカルのバーストを作り出す。これらのヒドロキシルラジカルが溶媒にアクセス可能なアミノ酸側鎖と反応する場合、反応生成物は質量分析法により測定および定量することができるマスシフトを示す。アミノ酸の反応速度はそのアミノ酸の平均溶媒アクセス可能な表面に部分的に依存するため、タンパク質の所定の領域の酸化量の測定された変化は、異なる立体間のその領域の溶媒アクセシビリティの変化(例えば、リガンド結合対リガンドフリー、モノマー対集合体)に直接相関することができる。FPOPは、タンパク質とタンパク質の相互作用、タンパク質の立体構造変化、タンパクリガンド結合など、生物学における多くの問題に適用されてきました。ヒドロキシルラジカルの利用可能な濃度は、FPOP実験における多くの実験条件に基づいて変化するので、タンパク質検体が暴露される有効なラジカル用量を監視することが重要である。このモニタリングは、FPOP反応からの信号を測定するためにインライン線量計を組み込むことによって効率的に達成され、レーザーフルエンスはリアルタイムで調整され、所望の酸化量を達成する。この補正により、コンフォメーション変化、リガンド結合面、タンパク質間相互作用界面を反映したタンパク質トポグラフィーの変化を、比較的低いサンプル量を用いて異種サンプルで決定することができます。

Introduction

タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、溶媒曝露されたタンパク質の表面積の超高速共有修飾によるタンパク質地形変化の測定に新たな技術であり、続いてLC-MS1による検出を行う。FPOPは、過酸化水素のUVレーザーフラッシュ光分解により、その一部に高濃度のヒドロキシルラジカルを生成する。これらのヒドロキシルラジカルは、非常に反応性と短命であり、FPOP条件2の下でおよそマイクロ秒のタイムスケールで消費される。これらのヒドロキシルラジカルは、水を介して拡散し、一般に高速(〜106M-1 s6 -1)から拡散制御3に至るまで、運動速度で溶液中の様々な有機成分を酸化する。ヒドロキシルラジカルがタンパク質表面に遭遇すると、ラジカルはタンパク質表面上のアミノ酸側鎖を酸化し、そのアミノ酸(最も一般的には1つの酸素原子の純加量)の質量シフトを生じる4。任意のアミノ酸における酸化反応の速度は、そのアミノ酸の固有反応性(側鎖および配列コンテキストに依存する)4、5,5およびその側鎖の拡散ヒドロキシルラジカルへのアクセス可能性の2つの要因に依存し、これは平均溶媒アクセス可能な表面積6,77と6密接に相関する。グリシンを除くすべての標準的なアミノ酸は、FPOP実験でこれらの反応性の高いヒドロキシルラジカルによって標識されているように観察されています, 大きく異なる収率ではあるが;実際には、Ser、Thr、Asn、およびAlaは、高ラジカル用量の下で、慎重かつ敏感な標的ETDフラグメンテーション88、99によって同定される以外、ほとんどのサンプルで酸化されると見られることはほとんどありません。酸化後、試料を消光して過酸化水素および二次酸化剤(スーパーオキシド、一酸化酸素、ペプチジルヒドロペルオキシドなど)を除去する。次いで、クエンチされたサンプルをタンパク質分解して酸化ペプチドの混合物を生成し、構造情報は、様々なペプチドの酸化生成物のパターンにおいて化学的「スナップショット」として凍結される(図1)。質量分析(LC-MS)に結合された液体クロマトグラフィーは、そのペプチドの酸化および非酸化バージョンの相対的な強度に基づいて、所定のタンパク質分解ペプチドにおけるアミノ酸の酸化量を測定するために使用されます。異なる立体構造条件下で得られた同じタンパク質のこの酸化足跡を比較することにより(例えば、リガンド結合対リガンドフリー)、タンパク質の所定の領域の酸化量の差は、その領域66,77の溶媒アクセス可能表面積の違いと直接相関することができる。タンパク質の地形情報を提供する能力は、FPOPタンパク質の高次構造決定のための魅力的な技術を作ります, タンパク質の治療の発見と開発中を含みます10,,11.

Figure 1
図 1: FPOP の概要タンパク質の表面は、高反応性ヒドロキシルラジカルによって共有結合的に修飾される。ヒドロキシルラジカルは、側鎖の溶媒のアクセス性に強く影響される速度でタンパク質のアミノ酸側鎖と反応する。地形変化(例えば、上に示したリガンドの結合に起因する)は、相互作用の領域におけるアミノ酸をヒドロキシルラジカルと反応することから保護し、LC-MSシグナルにおける修飾ペプチドの強度の低下をもたらす。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

FPOP溶液中に存在する異なる成分(例えば、リガンド、賦形剤、緩衝剤)は、過酸化水素3のレーザー光分解に際して発生するヒドロキシルラジカルに対して異なる清掃活性を有する。同様に、過酸化物濃度、レーザーフルエンス、および緩衝剤組成のわずかな変化は、効果的なラジカル用量を変更し、サンプル間および異なる実験室間でFPOPデータの再生を困難にする可能性があります。したがって、利用可能なヒドロキシルラジカル線量,を、12、13、14、15、16,13の利用可能なヒドロキシルラジカル線量の1つを用いて、各サンプル中のタンパク質と反応させることができるヒドロキシルラジカル用量15を16比較できることが重要である。,14ヒドロキシルラジカル線量計は、ヒドロキシルラジカルのプールのための(そして溶液中のすべてのスカベンジャーと)アナライトと競合することによって作用します。ヒドロキシルラジカルの有効用量は、線量計の酸化量を測定することによって測定される。なお、「有効ヒドロキシルラジカル用量」は、発生したヒドロキシルラジカルの初期濃度とラジカルの半減期の両方の機能である。これら2つのパラメータは、部分的に相互に依存しており、理論運動モデリングはやや複雑になる(図2)。2つのサンプルは、形成されたヒドロキシルラジカルの初期濃度を変更することによって同じ効果的なラジカル用量を維持しながら、最初のラジカル半減期を大きく異なることができる。彼らはまだ同じフットプリント17を生成します。アデニン13およびTris12は、酸化のレベルをリアルタイムでUV分光法で測定できるため、効果的なヒドロキシルラジカル用量に問題がある場合に研究者が迅速に特定し、その問題をトラブルシューティングすることができるため、便利なヒドロキシルラジカル線量計です。この問題を解決するためには、リアルタイムでアデニン吸光度変化からの信号を監視できる照射部位の直後にフローシステムに位置するインライン線量計が重要である。これは、ヒドロキシルラジカル清掃能力17の広く異なるレベルを有するバッファーまたは他の賦形剤でFPOP実験を行うのに役立つ。このラジカル投与量補償はリアルタイムで行うことができるが、有効ラジカル用量を調節することによって同じコンフォーマーに対して統計的に区別できない結果をもたらす。

本プロトコルでは、内部光学ラジカルドシメータとしてアデニンを用いたラジカル投与量補償を用いた典型的なFPOP実験を行うための詳細な手順を有する。この方法により、調査員はリアルタイムで補正を実行することにより、異なる清掃能力を有するFPOP条件全体のフットプリントを比較することができます。

Figure 2
図2:ドシメトリー報酬の運動シミュレーション1 mM アデニン線量計応答は、5 μM リソザイム分析物で 1 mM 初期ヒドロキシルラジカル濃度 (▪OH t1/2=53 ns)で測定し、対象線量計応答(黒)として設定した。スカベンジャー賦形ヒスチジンの1mMを添加すると、量濃度応答(青色)は比例的にタンパク質酸化量(シアン)と共に減少する。ヒドロキシルラジカルの半減期も減少する(▪OH t1/2=39ns)。生成されたヒドロキシルラジカルの量が増加すると、スカベンジャー(赤色)の不在時に1mMヒスチルラジカル(赤)で達成した1mMヒスチジンスカベンジャーを用いてサンプル中の酸化された線量計の同等の収量を得るために(▪tOH/29=29)、同様に起こるタンパク質酸化量(マゼンタ)が減少する一方で(tOH19/ns=29)。=シャープJ.S.、アムファーマセウトRev 22、50-55、2019の許可を得て適応。 22,この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Protocol

1. FPOP用のオプティカルベンチとキャピラリーを準備する

注意:KrFエキシマレーザーは極端な目の危険であり、直接または反射光は永久的な眼の損傷を引き起こす可能性があります。常に適切な目の保護を着用し、可能な場合はビームパスの近くに反射物の存在を避け、アクティブなレーザーへの不正アクセスを防ぎ、迷子の反射を抑制するためにエンジニアリングコントロールを使用します。

  1. FPOP オプティカルベンチを準備します。
    1. レーザーをオンにしてウォームアップします。レーザーを外部トリガー、一定エネルギー、ガス交換なしに設定します。パルスあたりのレーザーエネルギーを設定します(通常、80~120 mJ/パルス)。
    2. 図3Aに示すように、光を吸収するために、レーザービームの経路にプラノ凸レンズ(30mm Dia.x 120 mm FLアンコート)を直接設置し、反射しないバックストップを設置します。

Figure 3
図3:FPOP実験用の光学ベンチ(A)試料をH2O2、ア2デニンラジカルドシメータ、グルタミンスカベンジャーと混合し、注射器に装填する。試料はKrFエキシマUVレーザーの焦点を合わせるビームパスを通して融合シリカキャピラリーを通して押される。UV光はH2O2をヒドロ2キシルラジカルに光分解し、タンパク質とアデニン線量計を酸化する。シリンジの流れは、次のレーザーパルスの前にレーザーの経路から照らされたサンプルを押し出し、照らされた領域間の非照光排他体積を有する。酸化直後に、試料は265nmでアデニンのUV吸光度を測定するインラインUV分光光度計を通過する。次いで、試料をクエンチバッファーに沈着させ、残りのH2O2および二次酸化剤を除去する。2(B)スポットサイズは、248 nmでレーザーで毛細管の後ろに貼り付けられた色付き付箋を照射した後に測定されます。スポットの幅はサンプル流量の計算に使用され、スポットの中央の毛細血管のシルエットを使用して光学ベンチを揃えます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 融合したシリカキャピラリー(360μmの外径と100μmの内径)の適切な長さをカットし、スリーブを使用して、低いデッドボリュームコネクタを使用してガスタイトなシリンジに接続します。
  2. サンプルのレーザー露光後、265 nmの吸光度信号を読み取る場所で、ブタントーチで毛細管のポリイミドコーティングを静かに燃焼させます。糸くずのない拭き取りでメタノールを使用して、キャピラリーの破片を静かに拭きます。レーザー発生率の部位でのポリイミドコーティングは、同様にブタントーチで焼き払うか、低電力でエキシマレーザー焼成で焼き払うことができます。
    注:毛細血管が冷却されるのを待つのは、ホットキャピラリーのメタノールを使用する火災の危険です。
  3. この毛管をレーザーのビームパスを通り、インライン線量計に入れる。
    1. インライン線量計の上部にあるレバーを押して、ヒンジを開きます。磁気ホルダーを取り外します。キャピラリーを所定の位置に保つために磁気ホルダーを使用して、インライン線量計の機械加工された溝にキャピラリーを置きます。毛細管の上にドーシメータヒンジを閉じ、レバーが所定の位置にロックされるまで押します。
  4. ドシメトリーソフトウェアを使用して、[ スタートフラッシュ ]ボタンをクリックしてエキシマレーザーの発射を開始します。レーザー制御ソフトウェア自体で50~100 mJ/パルスの間にプリセットレーザーパワーを設定し、ドシメトリーソフトウェアの[設定]タブで10〜20 Hzの間でプリセットの繰り返しレートを設定します。
    1. 直線電動ステージに取り付けられたプラノ凸レンズを使用して、レーザービームを焦点を合わせます。図3Bに示すように、キャリパーを使用してキャピラリーの位置にあるレーザースポットの幅と高さを正確にキャリパーで測定し(mJ/mm2)を計算します。2
  5. レンズの動きやレーザー18のパルス当たりのエネルギー変化によるビームサイズの変化に関係なく、キャピラリーの一貫した照明幅を確保するために、毛細管の近くに不透明な開口部を配置する。
    1. レーザー焼成で、動きの範囲を通してモーターを備えた段階を動かします。ビームが開口部の中心に留まり、毛細管のシルエットが全体を通して観察できることを確認します。絞りの直径は、電動ステージの範囲内のすべての点で、衝突焦点を合わせるビームの幅よりも小さくなければなりません。
  6. キャピラリーを洗浄するために、20 μL/min で少なくとも 1 分間水を流します。
    1. 線量計ソフトウェアの [データ+オートゼロを開始 ]ボタンをクリックして、水に対する線量をゼロにしてデータ収集を開始します。
      注: FPOP のバッファー システムが 265 nm で大きな UV 吸光度を持つ場合、FPOP システムは水ではなくバッファーでゼロにする必要があります。
  7. シリンジポンプで計算された流量を設定します。
    1. タンパク質サンプルの流量は、1ショット当たりの照射体積(VIrr)、1秒当たりのレーザーショット数(R)、およびラミナル流れ効果とサンプル拡散(0.15-0.30推奨)2、19、2019,20に対する必要な未照射排除体積分率(FEx)に依存する。次の式Irrを使用して、キャピラリーの内径 (mm (d) と、毛管に衝突するレーザースポットの幅 (つまり、開口の幅) を mm(w)で計算します。
      VIrr = π(d/2)2w
    2. 次の式に基づいて、希望の流量(μL/min)を計算します。
      フロー = 60R[VIrr (1 + FEx)]

2. FPOP用タンパク質溶液の調製

  1. 比較される2つ以上の異なる条件(例えば、リガンド結合およびリガンドフリー;凝集体および単量体;単独およびタンパク質結合パートナーなど)でタンパク質を調製し、立体構造変化を検出する。
  2. 実験のニーズに合わせて、FPOP に使用する総ボリュームを設定します。最小制限は通常、照射毛細血管の体積と、堅牢な検出と相対定量に必要な材料に依存し、使用されるLC-MS/MSシステムとポストラベリングサンプル処理方法によって大きく異なります。当社グループで一般的に使用されるFPOPソリューションの総容積は、過酸化水素添加後20μLです。タンパク質の最終的な濃度は一般的に1〜10 μMであり、17 mMグルタミン(ヒドロキシルラジカルの寿命を制限するため)、1mMアデニン(ラジカル線量計として作用する)13、17および1710mMリン酸緩衝液(ヒドロキシルラジカルのスカベンジャーが乏しい緩衝液)である。サンプルは、結果の統計的なモデル化を可能にするために、一般的に複数の反復で準備されます。
    1. ほとんどの一般的な目的のために、両方の状態で三重にサンプルを調製し、バックグラウンド酸化を測定するためのレーザー制御として使用する少なくとも1つのサンプルを用意します。このFPOP溶液ミックスの18 μLを準備します。
      注:生化学で一般的に使用される多くのバッファーおよび添加剤は、ヒドロキシルラジカルスカベンジャーです。これらの添加剤とバッファーを使用できます。しかし、バッファーのヒドロキシルラジカル清掃による酸化の減少が起こり得る。一般に、タンパク質の酸化収率を最大化するために、生物学的システムで必要な最小限の添加剤を維持します。ジメチルスルホキシドは二次ラジカルを生成する傾向のために避けるべきです;ジメチルホルムアミドは、私たちの手の中で有用な代替手段となっています.強力なヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるバッファーを使用する場合, グルタミンは、多くの場合、FPOP溶液ミックスから除外することができます.
  3. FPOP実験の直前に1M過酸化水素を調製します。
    注:ベンダーが一般的に販売する過酸化水素30%には安定剤が含まれており、貯蔵寿命が向上します。一度希釈したら、過酸化水素は、間違いなく同じ日の中で、迅速に使用する必要があります。過酸化水素はまた、ヒドロキシルラジカル線量計を使用してFPOPによる分解について定期的に試験されるべきである。
  4. 0.5 μg/μLのメチオニンアミドと0.5 μG/μLカタラーゼのクエンチ溶液25 μLを含むマイクロ遠心チューブを用意します。FPOPに20μLを超えるサンプルボリュームを使用する場合は、クエンチ溶液の体積を比例的に増やします。

3. FPOP 実験を実行する

  1. FPOP溶液ミックスの18 μLに2μLの過酸化水素を加えます。内容物をピペットで軽く混ぜ、マイクロ遠心チューブの底まで溶液を素早く回転させます。すぐにガス密なシリンジで収集し、シリンジポンプにロードします。
  2. ステップ1.8.1(通常は8-16 μL/min)で決定された流量で、線量計ソフトウェアの ポンプ開始 ボタンをクリックして、シリンジポンプのフローを開始します。
  3. インライン線量計を使用してリアルタイムのアデニン読み取り( 材料表を参照)を監視し、サンプルを廃棄物に集めます。腹筋265 信号が安定するのを待ちます。
  4. 線量計ソフトウェアの スタートフラッシュ ボタンをクリックすると、あらかじめ設定された繰り返し速度とエネルギーでレーザーの発射を開始します。
  5. インライン線量計を使用してリアルタイムのアデニン読み取りを監視する( 材料表を参照)。レーザーをオフにして、レーザーをオンにした腹筋265 の違いはΔAbs265 の読み取り値です。
    注:過酸化水素の存在下でレーザーを発射したときの非常に不安定な腹筋265 の測定値の出現は、溶液中の気泡の発生によるものです。レーザーのフルエンスや過酸化水素の濃度を下げ、気泡を除去します。

4. 補償の実施

注:異なるリガンド、緩衝液などは、ヒドロキシルラジカルに対して異なる清掃能力を有する可能性があります。異なるサンプル間でタンパク質と反応するために、同等の有効なヒドロキシルラジカル用量が利用可能であることを確認することが重要です。これは、サンプル間の等しいヒドロキシルラジカル線量計応答を確保することによって達成される。アデニン線量測定を使用して、265 nm(ΔAbs265)におけるUV吸光度の変化は、有効なヒドロキシルラジカル用量を反映する。ΔAbs265が大きいほど、有効なヒドロキシルラジカル用量が高くなります。

  1. インライン線量計で得られたΔAbs265 の測定値を、事前の実験または制御によって得られた所望のΔAbs265 測定値と比較します。ΔAbs265 所望の読み取り値よりも低い読み取り値は、ヒドロキシルラジカルの不十分な有効用量を示す;ΔAbs265 の読み取り値は、高すぎる有効なラジカル用量を示す。ΔAbs265 の読み取り値が所望のレベルにある場合は、クエンチバッファ17にレーザー照射後すぐに試料を集める。
  2. 有効なラジカル用量を補償してΔAbs265を均等にする。この補正は、過酸化水素濃度の変化、パルス当たりのレーザーエネルギーの変化によるレーザーフルエンスの増加、または焦点レンズの焦点面の変更によるレーザーフルエンスの増加の3つの方法で行うことができます。
    1. ΔAbs265 の読み取り値で大きな変更 (>10 mAU) を行う場合は、多かれ少なかれ過酸化水素でサンプルを作り直し、セクション 3 に従ってサンプルを再実行します。
    2. ΔAbs265 の読み取り値をリアルタイムで小さく変更するには、50mm電動ステージを使用して集光レンズの位置を調整して、入射ビームの焦点面を調整します。焦点面を毛細血管の位置に近づけるとΔAbs265 の読み取り値が増加します。焦点面を毛細血管の位置から遠ざけると、ΔAbs265 の読み取り値が減少します。
  3. アデニンΔAbs265 をモニタして、レーザー照射後の試料中に存在するヒドロキシルラジカルの有効量を測定する。インラインUV毛管検出器によるリアルタイムモニタリングは、4.2.2に記載されているようにリアルタイムの補償を可能にします。ΔAbs265 の読み取り値が所望の読み取り値に等しくなるまで、電動ステージを使用してレンズ位置を調整します。UV分光光度計による実験後の吸光度測定も正確ですが、各効果的なラジカル線に新しいサンプルを使用する必要があります。

5. タンパク質サンプルを消化する

注:トリプシンはFPOPのタンパク質サンプルを消化するために最も一般的に使用され、このプロトコルで使用されるプロテアーゼです。N末語とC末語の両方で基本部位を有するペプチドを生成し、MSで増殖荷電ペプチドイオンを促進する信頼性の高いプロテアーゼです。さらに、リジンおよびアルギニンの後に切断し、ヒドロキシルラジカルに対して適度に反応性を有する2つのアミノ酸;したがって、検体酸化による消化パターンの変化はまれである。FPOP21では他のプロテアーゼがうまく使用されていますが、消化パターンが非酸化と酸化されたサンプルの間で比較可能であることを確認するために注意する必要があります。

  1. クエンチされたFPOPサンプルの最終容積を測定します。500 mM トリス、50 mM ジチオトレイトール (DTT) を含む 10 mM CaCl2 の pH 8.0 を、50 mM トリス、1 mM CaCl2、5 mM DTT の最終濃度まで吸い込んだ後のタンパク質溶液に加えます。
  2. タンパク質サンプルを95°Cで15分間加熱します。
  3. すぐに氷の上でサンプルを2分間冷却します。
  4. サンプルに1:20トリプシン/タンパク質量比を加えます。
  5. 混合で37°Cで一晩タンパク質を消化します。
  6. 0.1%のギ酸を加えて、10分間95°Cに加熱することにより、消化反応を停止します。
  7. サンプルに2 mM DTTを加え、LC-MS/MSの直前に15分間60°Cで加熱します。
    注:他のグループはFPOP実験でチオールのアルキル化を報告していますが、私たちの手では酸化タンパク質のアルキル化時に副産物を指摘しています(おそらくマイナーな酸化生成物として形成された求核カルボニルとの反応によるものです)。したがって、可能な場合はチオールのアルキル化を避けることを選択します。

6. 液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)を行う

  1. 0.1%のギ酸を含む水と0.1%のギ酸を含むアセトニトリルからなる移動相Bからなる移動相Aを調製する。
  2. サンプルを最初にC18トラップカラム(300 μm I.D.x 5 mm 100 Åの細孔サイズ、5 μmの粒子サイズ)に詰め込み、2%の溶媒Bで3分間洗浄し、塩や親水性の小分子を除去します。
  3. 次に、C18ナノカラム(0.75mm x 150mm、粒子径2μm、100Å孔サイズ)のペプチドを300nL/minの流量で分離します。勾配は、22分間で2〜35%の溶媒Bから線形増加し、5分間にわたって95%の溶媒Bに傾斜し、3分間保持して3分間保持し、3分間にわたって2%Bに戻し、9分間保持してカラムを再平衡化します。
    注: この勾配は、ペプチドレベルの定量を行おうとするほとんどの 1 タンパク質および 2 タンパク質 FPOP 混合物の LC-MS/MS に十分です。溶媒Bのパーセントは、ペプチドが同様の保持時間とm/z値のために互いに干渉する稀なケースでペプチド分解能を高めるために変更する必要があるかもしれません。プロテオームスケールFPOP22またはペプチド酸化生成異性体1、23、24、2523,を分離しようとする実験設計は、より長いLC勾配を必要とし24、25このレポートの範囲を超えている可能性があります。1
  4. 導電性ナノスプレーエミッタを用いて、ペプチドを高分解能質量分析計のナノスプレー源に直接溶出する。
  5. 正のイオンモードでデータを取得します。噴霧電圧を2400Vに設定し、イオン転写管の温度を300°Cに設定します。
  6. m/z 250から2000までの完全なMSスキャンをm/z 2000の公称解像度で60,000の m/z 200で取得し、その後、35%正規化されたエネルギーで衝突誘発解離を使用して最も豊富なペプチドイオンの上位8つのデータ依存性線形イオントラップMS/MSスキャンを行い、ペプチドを同定します。ペプチドを30s以内に5回までフラグメント化し、60sの除外リストに移します。

7. ペプチドの平均酸化のデータ処理と計算

  1. MS/MSプロテオミクス検索エンジンを使用して、タンパク質の配列カバレッジ 、m/z 値、非酸化ペプチドの保持時間を決定します。
  2. 前駆体質量許容範囲を10 ppmに設定し、標準的なトリプシン切断特異性を使用して、トリプシン消化サンプルの切断部位を最大2つまで可能にします。
  3. ペプチド質量フラグメント質量許容範囲を0.4ダルトンに設定します。
  4. 主要な酸化生成物の検出された未改変ペプチドのm/z比と既知の質量シフトに基づいて、各ペプチド4、26、27、28、2926,27の様々な理論酸化産物のm/z,28を29算出する。4
  5. これらのm/z値の抽出されたイオンクロマトグラムを、ソフトウェアを使用して質量分析の実行を表示します(図4)。m/z、その電荷状態、および未修飾ペプチドとの溶出時間の類似性に基づいてペプチド酸化生成物を同定する。我々の手では、ペプチド酸化生成物は、上記のLC勾配を用いて未改変ペプチドの後240秒〜180秒の間に溶出する。酸化は多発異性体酸化生成物をもたらすことが多いので、図4に示すように、ペプチド酸化産物の抽出されたイオンクロマトグラム中の複数の部分的に分解されたピークを観察することが一般的である。ペプチド酸化生成物は、抽出されたイオンクロマトグラムのピークの面積に基づいて定量されます。

Figure 4
図4:FPOP後のペプチド及びその酸化産物のイオンクロマトグラムを抽出した。ペプチド酸化生成物の m/z は、非酸化ペプチドおよび既知の酸化生成物の m/z に基づいて計算されます。これらのペプチド製品の領域が決定されます。次に、ペプチド生成物の面積を、ペプチド当たりの平均酸化事象の計算に使用します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. ペプチドの平均酸化を以下の式を用いて計算する。

Equation 1

ここでPはペプチド分子あたりの平均酸化事象数を示し、Iは非酸化ペプチド(Iunoxキシ化)とn酸化事象を有するペプチドのピーク面積を表す。I(単独酸化)は、単一の酸素原子の添加だけでなく、研究者が測定することを選択できる他のあまり一般的でない単一酸化事象(例えば、酸化脱炭酸、カルボニル形成など)を含むであろうことに注意してください。4,,26,27,28,29.

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Representative Results

リン酸緩衝液中のアダリムマブバイオシミラーの重鎖ペプチド足跡と55°Cで1時間加熱した場合の比較は、興味深い結果を示す。学生のt検定は、これら2つの条件で有意に変化するペプチドの同定に使用されます(p ≤ 0.05)。ペプチド20-38、99-125、215-222、223-252、260-278、376-413、および414-420は、タンパク質が熱されて凝集体を形成する際に溶媒から有意な保護を示す(図5)30。この実験では、加熱および凝集時に地形変化を経験するペプチド領域を同定した。

Figure 5
図5:アダリムマブの重鎖のペプチドレベルのフットプリント。ペプチドは、室温でのアダリムマブ(青)の平均酸化、および(オレンジ)アダリムマブの後に55°Cで1時間加熱し、次いで室温まで冷却した。誤差範囲は、三重測定値の標準偏差を表します。アスタリスクは、2つの条件で有意に変化したペプチドを表す(p ≤ 0.05)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ミオグロビンのFPOP実験は、10 mMリン酸および10 mM 2-(Nモルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)バッファーの存在下で行った。MES緩衝液は、試料がレーザー照射に曝された後の過酸化水素の光分解に際して発生するヒドロキシルラジカルの良好なスカベンジャーとして機能する。アデニンの吸光度の差は、インライン線量計を用いてリアルタイムで監視される。このレーザーフルエンスは、リン酸緩衝液(図6)17と比較してMES緩衝液中のアデニン吸光度レベルに17対して同等の変化を有する方法で調整される。ペプチドの平均酸化は、リン酸緩衝液と比較してMES緩衝液の存在下で低かった。しかしながら、レーザーフルエンスが等しいアデニンドシメトリー応答を有するように増加したほど、平均ペプチド酸化値はMES緩衝液およびリン酸緩衝液におけるFPOP後に有意に異ならなかった(図7)17。17この実験は、異なる清掃能力を有する2つのFPOP条件とフットプリントを比較することができる信号の補償の重要性を示す。同様の実験は、アダリムマブ製剤30における一般的な賦形剤の構造変化を調査するためにアデニンベースの補償をうまく使用している。

Figure 6
図6:アデニンドジメトリー測定値の補正レーザー照射前後のアデニン読み取り値を、265nmのリン酸緩衝液中のFPOPに対して、インライン線量計を用いて記録した。MESはヒドロキシルラジカルの良好なスカベンジャーであるため、アデニン測定値の差は低かった。MESバッファーを有するFPOP溶液のレーザーフルエンスを増加させ、「補償」し、リン酸緩衝液と同様のアデニン読み取り値を有するMES緩衝液の効果を克服した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:インラインアデニン線量測定によるミオグロビン酸化のリアルタイム補正ミオグロビンは(青色)10mMリン酸緩衝液および(オレンジ)10mM MES緩衝液(オレンジ)で酸化した。前述したように、ペプチドの酸化はMES緩衝液において低い。MESバッファー内のサンプルがリン酸緩衝液(灰色)と比較してほぼ類似したアデニンドシメトリーレベルを有するようにレーザーフルエンスが増加するにつれて、ペプチドレベル酸化はリン酸緩衝液を有するサンプルに見られる酸化レベルと同様である。この数字は、 分析化学 2018、90、21、12625-12630の許可を得て適応されています。著作権 2018 アメリカ化学会. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

水素重水素交換、化学架橋、共有標識、天然スプレー質量分析、イオン移動性など、質量分析ベースの構造技術は、その柔軟性、感度、複雑な混合物を処理する能力により急速に普及しています。FPOPは質量分析ベースの構造技術の分野での人気を高めているいくつかの利点を誇っています。ほとんどの共有標識戦略と同様に、ほとんどのポストラベリングプロセス(トリプシン消化、脱糖分解など)と互換性のあるタンパク質トポグラフィーの安定した化学的スナップショットを提供し、水素重水素交換を妨げる逆交換やスクランブルの問題を回避します。しかし、特定のアミノ酸を標的とする従来の共有ラベル技術とは異なり、FPOPは単一の実験で幅広いアミノ酸の標識を行うことができます。さらに、FPOPは、タンパク質が天然の立体構造14の化学的スナップショットを凍結するために展開することができるよりも速く一次ヒドロキシルラジカルタンパク質反応を完了することができるが、いくつかの二次反応は、遅いタイムスケール20、31、3231,32で起こり得る。20X線シンクロトロンビームラインを用いたヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントの以前の実験とは異なり、FPOPはベンチトップ形式33、34,34でこの超迅速な標識を可能にする。典型的なタンパク質量分析ラボが直面するFPOPの主要なハードルは、FPOP、レーザーベースの酸化、およびデータ分析のためのサンプルの取り扱いの経験です。このレポートの目標は、新しい調査官がこれらのハードルを克服し、貴重で再現可能な結果を生み出すことを支援することです。

タンパク質は、同定されたペプチドに対する酸化の程度を誤って提供する可能性のあるバックグラウンド酸化を受ける可能性があります。これをよりよく理解するために、コントロールサンプルは、レーザーを除くすべてのステップがトリガされないFPOPサンプルと一緒に複製で調製される(ステップ3.4)。ノーレーザー制御における酸化のレベルは、バックグラウンド酸化のレベルを明らかにします。ペプチドのインソース酸化は、観察されたペプチド酸化に寄与し得るが、そして、未修飾ペプチド及び改変物のLC溶出プロファイルによって容易に決定することができる。溶出プロファイルが同じで重なっている場合、酸化生成物はほぼ確実にポストカラムインソース酸化によるものです。インソース酸化は、イオン化電圧を下げたり、エミッタとイオン伝達チューブの間の距離を長くすることによって、一般に減少する可能性があります。他のバックグラウンド酸化は、FPOP処理の前にタンパク質中に存在するか、または過酸化水素への曝露によって誘発され得る。後者は、使用される過酸化水素の濃度を減少させるか、またはタンパク質が消光する前に過酸化水素中にある時間を減少させることによって最小限に抑えることができます。

初めてFPOPを試みる実験者がしばしば遭遇する重要な問題は、高いバックグラウンド酸化である。この高いバックグラウンド酸化は、通常、分析前に試料に過酸化水素を添加したためである。過酸化水素による2電子酸化はヒドロキシルラジカルによる一電子酸化よりもはるかに遅いが、過酸化水素は依然として特定のアミノ酸(特にメチオニンおよびシステイン)を数分のタイムスケールで酸化し易い。FPOP混合物中の他の成分ははるかに安定しているが、過酸化水素はFPOPによる酸化の前に直接加えられるべきです。経験則として、過酸化水素の添加と、試料のクエンチ溶液への完全な沈着までの間の時間は、5分以内に保つべきである。過酸化物曝露の長期化またはタンパク質の精製と保存に起因するサンプル酸化の問題を検出するには、常にノーレーザー制御(タンパク質はFPOPでは正常に処理されるが、レーザーは発火しない)を収集することが重要です。タンパク質が過酸化水素に特に感受性がある場合、エキシマレーザーで照射する前に過酸化水素とのオンライン混合は、31、35,35秒以下の暴露を制限することができる。しかし、ほとんどのタンパク質では、オンライン混合は不要です。

多くの初心者FPOP実験者にとって次の困難なハードルは、光路の設定です。過酸化水素の光分解を良好にするため、レーザーが毛細管に真正面から衝突することが重要です。UVレーザー光は見えないが、色紙に存在する多くの染料が可視範囲で蛍光を発する。したがって、バックストップに着色された作図紙を使用すると、レンズと毛細血管の位置合わせに役立ちます。このペーパーは、レーザーが焦点レンズの中心に正面から当たっていることを確認するために使用することができ、その後、レーザーバックストップの色紙は、毛細血管が焦点を当てたビームの中心に正常に配置されたときに、毛細管の回折がビームプロファイルにシルエットを引き起こすので、それを知るのに役立ちます(図3B)。

また、ビーム断面積がパルスエネルギーに基づいて変化することも、初心者の研究者によって理解されないことがよくあります。したがって、研究者が100mJ/パルスのレーザーエネルギーに基づいてシリンジポンプの流量を計算し、レーザーエネルギーを120mJ/パルスに増加させると、レーザービームの幅も同様に増加し、計算が不正確になります。この問題を防ぐために、不透明な絞りを使用することをお勧めします。私たちが取り組んできた市販のエキシマレーザーでは、パルス当たりのレーザーエネルギーが増加すると、レーザーフルエンスではなくビームの断面に最も大きな変化があります。ヒドロキシルラジカルの濃度は、入射UV光の流暢さに部分的に基づいているので、パルス当たりのレーザーエネルギーを変えるだけで、効果的なヒドロキシルラジカル投与量を増加させるのに非効率的であることが多い。

再現性は、初心者の研究者が克服するためのもう一つの共通のハードルです。最も一般的には、再現性の欠如は、異なる複製にわたって同等のヒドロキシルラジカル用量を生成する失敗によって引き起こされる。これは、不適切な光学ベンチアライメント、異なるレベルのヒドロキシルラジカル清掃剤の無意識の使用、または老化した過酸化水素の使用に起因する可能性があります。すべての場合に対して、内部線量計を使用することで、効果的なヒドロキシルラジカル用量の問題を迅速に特定することができます。ヒドロキシルラジカル線量計は、ヒドロキシルラジカルのプールのための(そして溶液中のすべてのスカベンジャーと)アナライトと競合することによって作用します。ヒドロキシルラジカルの有効用量は、線量計の酸化量を測定することによって測定される。なお、「有効ヒドロキシルラジカル用量」は、発生したヒドロキシルラジカルの初期濃度と、ラジカルの半減期の両方の機能である。これら2つのパラメータは、部分的に相互に依存しており、理論運動モデリングはやや複雑になる(図2)。2つのサンプルは、形成されたヒドロキシルラジカルの初期濃度を変更することによって同じ効果的なラジカル用量を維持しながら、最初のラジカル半減期を大きく異なることができる。彼らはまだ同じフットプリント17を生成します。アデニン13 およびTris12 は、酸化のレベルをリアルタイムでUV分光法で測定できるため、効果的なヒドロキシルラジカル用量に問題がある場合に研究者が迅速に特定し、その問題をトラブルシューティングすることができるため、便利なヒドロキシルラジカル線量計です。

データ分析は、FPOP実験の中で最も時間のかかる部分です。市販パッケージを用いて酸化生成物を定量化する報告が存在するが、これらの定量化アルゴリズムは、酸化異性体21のグループから生成される部分的に分解された非対称ピークのピーク領域を適切に定義するのに困難を有する。私たちの手の中では、現在利用可能な自動化されたソフトウェアパッケージは、通常、酸化の変化を正しく識別することができますが、多くの場合、それらの変更の大きさ(未公開のデータ)を正しく定量化せず、分析後の監査と修正を必要とします。FPOPデータによって提示される困難を考えると、FPOP定量化を全く処理できる利用可能なデータ分析ソフトウェアの現在の状態は顕著である。しかし、ソフトウェア開発の継続は、精度と信頼性を向上させることで、この分野に利益をもたらします。

ここで説明するプロトコルは、ヒドロキシルラジカルタンパク質のフットプリントのペプチドレベルの空間分解能を生成する。アミノ酸レベルまでの空間分解能を生成することが可能です。しかし、この高解像度FPOPデータを生成するさまざまな方法の絶対的な正確性に関しては、フィールド内の意見の相違が残っています。水素重水素交換とFPOPを比較した最近の研究では、FPOPデータがサブアミノ酸レベル36で溶媒のアクセシビリティをプローブできることを発見した。1つの方法は、HPLCを使用して酸化異性体を可能な限り解決し、次にピーク領域11、23、24、2523,24,25によって各異性体を定量する。しかし、この方法により合成ペプチド酸化異性体の単純混合物を定量した場合、絶対定量で誤差が見つかり、衝突誘発解離MS/MSが酸化37,38,38の部位を誤認する可能性が示されている。電子移動解離(ETD)による定量は、合成標準およびタンパク質において正確であることが示されているが、この方法の直接適用は、逆相HPLCを使用して達成することができないすべての酸化ペプチド異性体の共溶離を必要とし、一般的にサイズ排除クロマトグラフィー77、39、40、4139,40を41必要とする。それ以外の場合は、複雑で時間のかかる対象 ETD 分析を7、8、9を9使用する必要があります。この分野における現在のコンセンサスは、LCピーク領域ベースのアミノ酸レベル定量化は、変化する酸化部位を少なくとも正しく同定し、相対的な変化量を正しく識別しているように見える(すなわち、アミノ酸Xの酸化は立体構造AにおいてY%減少するBの場合)であるが、酸化量の定量の精度(すなわち、アミノXはY%が酸化された)が依然として残っている。

FPOPの1回の実験で多くの部位でタンパク質トポグラフィを調査するための柔軟なベンチトップ法としての強みは、初心者研究者の現在のハードルにもかかわらず、この技術への継続的な関心を高めています。FPOPを実行するための商業的オプションは、市場に出始めたばかりです。しかし、関心のある研究者が独自のFPOP光学ベンチを開発し、一般的に利用可能なデータ分析ソフトウェアを使用して実験を行う可能性は依然として高い。フィールドが拡大し、利用可能なツールの改善が続くにつれて、FPOP技術へのアクセスの容易さが増加します。

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Disclosures

ジョシュア・S・シャープは、ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントを含むタンパク質高次構造解析の技術を製品化しようとする小さな会社、GenNext Technologies, Inc.に大きな財政的関心を開示しています。

Acknowledgments

我々は、高エネルギーFPOPの標準化およびドージトリープロトコルの開発のためのベンチトップFPOP装置およびR01GM127267の商業開発を支援するために、国立一般医学研究所からの研究資金R43GM125420-01toを認める。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

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References

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生化学、問題163、タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)、タンパク質フットプリント、バイオシミラー、補償、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)
タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現
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Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling… More

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

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