Summary
여기에 제시된 전분 과립 크기 분포의 재현 가능하고 통계적으로 유효한 측정을 위한 절차이며, 2파라미터 곱셈 형태를 사용하여 결정된 과립 로그노멀 크기 분포를 지정하는 절차이다. 식물 및 식품 과학 연구를 위한 그램 스케일 전분 샘플의 모든 과립 크기 조정 분석에 적용됩니다.
Abstract
모든 식물 원에서 전분은 크기와 모양의 범위가 다른 발생 주파수, 즉 크기와 모양 분포를 나타내는 다양한 크기 및 모양의 과립으로구성됩니다. 여러 유형의 입자 크기 조정 기술을 사용하여 결정된 전분 과립 크기 데이터는 과립 모양에 대한 민감도 및 과립 샘플 크기의 한계를 포함하여 일부 극복 할 수없는 체계적인 오류로 인한 일부 극복 할 수없는 체계적인 오류로 인한 통계적 유의부족으로 인해 종종 문제가됩니다. 전기 감지 영역 기술을 사용하여 전분 과립 크기 분포의 재현 가능하고 통계적으로 유효한 측정 절차를 설명하고, 향상된 정확도와 비교성을 갖춘 채택된 2파라미터 곱셈 형태를 사용하여 결정된 과립 로그노멀 크기 분포를 지정하는 절차를 설명했습니다. 그것은 그람 규모 전분 견본의 모든 과립 크기 분석에 적용되고, 그러므로, 전분 과립 크기가 전분 생합성 장치 및 기계장치에 의해 성형되는 방법에 대한 연구를 용이하게 할 수 있었습니다; 그리고 식품 및 산업 용도에 대한 전분의 특성과 기능에 미치는 영향. 대표적인 결과는 설명된 절차를 사용하여 고구마 전분 샘플의 과립 크기 분포의 복제 분석에서 제시됩니다. 우리는 또한 절차의 몇 가지 주요 기술적 측면, 특히 과립 로그노어 크기 분포의 곱셈 사양과 과립 골재에 의해 빈번한 조리개 막힘을 극복하기위한 몇 가지 기술적 수단에 대해 논의했습니다.
Introduction
전분 과립은 식물 광합성 및 저장 조직에서 두 개의 주요 예비 호모글루칸 폴리머, 선형 또는 희소하게 분진 아밀로오스 및 고분진 아밀요펙틴이 지질 및 단백질을 포함한 일부 사소한 구성 요소와 함께 질서 있게 포장되는 물리적 구조입니다. 다양한 식물 종의 전분 과립은 구체, 타원, 다발성발, 혈소판, 큐브, 큐비드 및 불규칙한 튜블러를 포함하여 많은 3차원 (3D) 모양 (ref.1,2에서검토됨)을 나타낸다. 같은 조직이나 동일한 식물 종의 다른 조직에서도 다양한 발생 주파수를 가진 모양의 집합이있을 수 있습니다. 즉, 식물 종으로부터의 전분 과립은 특정 형상이 아닌 특성통계 적 형상 분포를 가질 수 있다. 비 균일하고 구형이 아닌 과립 모양으로 전분 과립 크기를 올바르게 측정하고 정의하기가 어렵습니다. 또한 식물 종의 동일한 조직에서 전분 과립은 특성 크기 분포를 나타내는 다른 비율, 즉 다양한 크기의 크기입니다. 이 크기 분포는 전분 과립 크기의 분석 및 설명을 더욱 복잡하게 만듭니다.
전분 과립 크기는 현미경, 침전/스테릭 필드 흐름 분획(Sd/StFFF), 레이저 회절 및 전기 감지 영역(ESZ)을 포함하여 여러 범주의 입자 크기 조정 기술(참조3에서검토됨)을 사용하여 분석되었습니다. 그러나, 이러한 기술은 과립 모양과 크기 분포가 있는 전분 과립 크기의 결정에 똑같이 적합하지 않다. 빛, 공초점 및 스캐닝 전자 현미경 검사를 포함한 현미경검사는 형태4,5,6,7,구조8,9 및 개발10,11의 전분 과립의 연구에 우수하지만 일부 내재된 단점으로 인해 크기 분포를 정의하는 데 거의 적합하지 않습니다. 여러 종에서 전분의 과립 크기의 측정에 사용 된 광학 현미경 데이터 (IAOM)의 미세화 과립 이미지 또는 소프트웨어 지원 이미지 분석의 직접 측정,옥수수(12),밀13,14,감자15, 보리16을포함하여 전분 과립 이미지의 매우 제한된 수(수만~몇 천)의 1D(보통 최대 길이) 또는 2D(표면적) 크기만 측정할 수 있다. 기술에 의해 본질적으로 제약받는 작은 과립 샘플링 크기는 전분의 단위 중량당 엄청난 과립 수를 고려하면 통계적으로 대표될 수 없으며(1.5 g/cm³ 밀도에서 10 μm 구체를 모두 가정함). Sd/StFFF 기술은 전분과립(17)의고속 및 해상도, 좁은 크기 분획을 가질 수 있지만, 그 정확도가 전분 과립의 손상, 다양한 모양 및 밀도에 의해 심각하게 영향을 받을 수 있기 때문에 거의 사용되지 않았습니다. 레이저 회절 기술은 가장 널리 사용되고 있으며, 모든 주요 작물 종3,14,16에대한 전분 과립 크기 분석을 위해 적용되었다. 이 기술은 많은 장점을 가지고 있지만, 실제로 과립 모양 분포의 존재전세 과립 크기의 결정에 적합하지 않습니다. 동시 레이저 회절 기기의 대부분은 균일한 구형 입자에 대한 Mie 빛 산란 이론18에 의존하고 균일성의 다른 모양에 대한 수정 된 Mie 이론18. 따라서 이 기술은 본질적으로 입자 모양에 매우 민감하며, 다양한 비율의 모양 세트를 갖는 전분 과립은 물론 균일성19의특정 모양에도 완전히 적합하지 않습니다. ESZ 기술은 조리개를 통과하는 입자의 부피에 비례하여 전기장 교란을 측정합니다. 그것은 높은 해상도에서 과립 볼륨 크기뿐만 아니라 수 및 볼륨 분포 정보 등을 제공합니다. ESZ 기술은 색상, 모양, 조성 또는 굴절률을 포함한 입자의 광학 적 특성과 독립적이므로 결과가 매우 재현 가능하기 때문에 모양 집합을 갖는 전분 과립의 크기 분포를 결정하는 데 특히 적합합니다.
전분 과립 크기는 또한 많은 매개 변수를 사용하여 정의되었습니다. 그(것)들은 수시로 평균 직경에 의해 심플리스트로 기술되었다, 어떤 경우에는 2D 심상12의현미경 측정 최대 길이의 산술 수단이었다12,20,또는 동등한 구직경3의평균. 다른 경우에는, 과립 크기 분포는크기범위(21, 22),분포 평균 부피 또는 평균 직경(구, 수, 부피 또는 표면적)을 정상분포(14,23,24,25, 26)를가정하여 지정하였다. 다양한 분석에서 전분 과립 크기의 이러한 설명은 매우 다른 성격의, 엄격하게 비교할 수 없습니다. 다른 종에서 전분 과립의 이러한 "크기"또는 같은 종의 동일한 조직이 직접 비교된 경우 매우 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 더욱이, 가정된 정상 분포의 확산(또는 형상) 매개변수, 즉, 분포의 폭(즉, 크기의 확산)을 측정하는 표준 편차 σ(또는 그래픽 표준 편차 σg)의확산(또는 형상) 파라미터는 대부분의 연구에서 무시되고 있다.
전술한 전분 과립 크기 분석이 직면한 중요한 문제를 해결하기 위해 ESZ 기술을 사용하여 전분 샘플의 과립 크기 분포에 대한 재현 가능하고 통계적으로 유효한 측정 절차를 설명하고, 정확도향상과 비교성을 갖춘 채택된 2-파라미터 곱셈 조형27을 사용하여 결정된 과립 로그노편 크기 분포를 적절히 지정했습니다. 유효성 검사 및 데모를 위해 절차를 사용하여 고구마 전분 샘플의 복제 과립 크기 조정 분석을 수행하고 그래픽 기하학적 수단 및 곱셈 표준 편차를 사용하여 lognormal 차동 볼륨 백분율 -볼륨 -동등한 구 직경 분포를 
x/ (곱하고 분할) s* 형태로 지정했습니다.
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Protocol
1. 전분 샘플 준비
- 확립된 절차에 따라 다양한 식물종의 전분 축적 조직으로부터 전분 시료 2개(또는 3개) 복제(예: 감자15개,고구마28개,밀알13,29,옥수수 커널30등)를 준비한다.
- 아세톤 또는 톨루엔 3-4x로 전분 샘플을 철저히 세척하여 과립 응고를 최소화하고 완전히 건조시합니다.
참고: 준비당 전분 1g 이상을 산출하는 추출 절차를 사용합니다. 각각 3개 또는 2개의 복제 추출물에서 각각 0.5g 의 알리쿼트 중 하나 또는 2개의 알리쿼트가 1개의 전분 추출물의 과립 크기 조정 분석을 위해 샘플링된다.
2. 전해질 준비
- 복제 전분 샘플 (실행 당 100 mL 플러스 추가 100 mL)에 대한 네 가지 크기 실행에 대한 메탄올에 50g / L 리튬 염화물의 500 mL을 준비합니다. 바람직하게는, 농도 변동을 최소화하기 위해, 예를 들어, 한 번에 4~8L의 대용량 배치로 전해질을 만든다.
- 얼음 이나 4 °C 캐비닛에 용기를 냉각 하 고 리튬 염화물의 용해 속도를.
3. 분석기 설정
- 분석할 전분 샘플의 공지(문헌 또는 예심 실행을 통해) 과립 크기 범위(예: 고구마 전분용 100 μm 조리개)를 포함하는 입자 직경 범위의 조리개 튜브를 선택하십시오. 알 수 없는 과립 크기 범위의 전분 샘플의 경우 입자 직경 범위가 겹치는 여러 개 조리개 튜브를 사용하여 시험 실행을 통해 적절한 조리개를 선택합니다.
참고: 조리개 튜브의 입자 직경 범위는 2~60%의 정확한 크기 조정 범위이며, 크기 조정 범위가 오리피스 직경의 80%까지 확장됩니다. 표 1에는 주요 작물 전분의 과립을 크기 조정하기 위한 세 개의 가장 유용한 조리개 튜브의 특성이 나열되어 있습니다. 전분 샘플의 과립 크기 범위가 단일 조리개 튜브의 크기 범위보다 넓으면, 다른 크기의 조리개와 측정된 최대 5개의 입자 크기 분포를 결합한 다중 튜브 중첩 해석을 수행한다. 각 조리개는 튜브에 표지된 직경과 부품 번호로 식별할 수 있습니다. 튜브의 바코드에 포함된 직경 및 일련 번호는 분석기의 제어판에 있는 바코드 리더를 사용하여 분석기 소프트웨어로 스캔할 수 있습니다. - 전분 과립 크기의 측정을 위해 100 mL 또는 200 mL 분석 비커 (오버 큐벳)를 선택하고 측정 중에 양호한 과립 현탁액을 유지하기 위해 자동 교반 (아래)을 설정합니다.
- 실행 설정 및 결과를 분석, 보기 및 인쇄하기 위한 기본 설정 파일을 지정하는 표준 운영 방법(SOM)을 만듭니다. SOM 및 기본 설정 파일을 필요에 따라 표준 운영 절차(SOP)로 결합합니다.
참고: 표준화할 수 없는 해석의 경우 SOM을 사용하여 분석을 실행하고 필요에 따라 SOM 창 편집(아래 참조)을 통해 실행 간에 SOM 설정을 조정합니다. 실행 완료 후 원하는 대로 환경 설정을 변경하여 실행 결과를 분석하고 보고 인쇄합니다. 표준화 가능한 과립 크기 조정 해석의 경우 SOP를 사용하여 분석을 실행합니다.- 분석기 소프트웨어를 시작합니다. 메인 마누에서 SOP | 클릭하십시오. SOM 마법사를 만들거나 SOM을 편집하거나상태 패널에서 SOM 편집을 클릭합니다. 마법사 또는 SOM 창 편집을 사용하여 SOM에 대한 설정을 선택합니다. 일반적으로 고구마 전분 샘플의 과립 을 크기 조정하는 데 사용되는 설정은 표 2에요약됩니다.
- 생성된 SOM을 SOM 마법사-설정 요약 창또는 SOM 편집 창에 파일에 저장합니다.
- 메인 마누에서 SOP | 클릭하십시오. 기본 설정 마법사를 만들거나 환경 설정 편집. 환경 설정 편집 창에서 마법사 또는 탭을 사용하여 표 3 또는 원하는 대로 기본 설정으로 기본 설정을 선택합니다.
- 선택한 기본 설정을 환경 설정 만들기 창 또는 환경 설정 편집 창에 파일에 저장합니다.
- 메인 메뉴에서 SOP | 클릭합니다. SOP 마법사를 만듭니다. 마법사의 단계별 가이드에 따라 설명을 입력하고 SOM 및 기본 설정 파일을 선택하여 SOP를 만들고저장합니다.
4. 전분 샘플의 과립 크기 조정 분석
- 분석기 준비
- 분석기를 켜고 컴퓨터에서 소프트웨어를 열고 분석기에 자동 연결한 후 상태 패널 상단의 준비 상태를 확인합니다.
- 전해질 항아리를 전해질로 채우고 필요한 경우 폐기물 항아리를 비웁니다.
- 사용자 설명서에서 가이드에 따라 선택한 조리개 튜브를 올바르게 설치하고 고정합니다. 보정되지 않은 새 조리개 튜브의 경우 교정 | 아래 단계별 가이드에 따라 교정합니다. 메인 메뉴에서 조리개를 보정합니다. 보정된 조리개 튜브의 경우 실행 또는 교정 | 아래 의 변경 조리개 튜브 마법사의 단계별 가이드에 따라 교정을 확인합니다. 메인 메뉴에서 조리개 교정을 확인합니다.
- 잠금 릴리스 클립(왼쪽 샘플 컴파트먼트 벽의 중간 전면)을 밀어 서 수동으로 플랫폼을 아래쪽으로 낮춥니다. 플랫폼에 전해질 100mL를 함유한 분석 비커를 배치하고 교반기를 교반 위치로 이동하고, 수동으로 플랫폼을 자체 잠금 상부 위치로 올려 조리개 튜브와 전해질의 교반기를 침전시합니다.
- 하단 계측기 도구 모음을 입력하여 분석기를 자동으로 전해질로 시스템을 채우고 플러시를 클릭하여 분석기를 자동으로 시스템을 플러시하도록 합니다.
- SOP| 주메뉴에서 SOM로드를 클릭하여 SOM을 로드하고 SOM을 사용하여 환경 설정 파일 없이 분석을 실행합니다. 또는 SOP | 클릭하여 SOP를 로드합니다. 상태 패널에서 메인 메뉴 또는 로드 SOP에 SOP를 로드하고 SOP를 사용하여 분석을 실행합니다.
- SOP를 사용하는 경우 메인 메뉴에서 SOP | SOM 정보 또는 기본 설정 정보를 클릭하여 SOM 및 기본 설정 설정을 확인합니다. 샘플 | 클릭 메인 메뉴에 샘플 정보를 입력하거나 상태 패널의 정보 편집을 통해 실행에 대한 샘플 정보를 입력합니다.
- 전분 메탄올 샘플 및 크기 조정 현탁액 준비
- 각각 2개 또는 3개의 복제 전분 추출물에서 각각 2개 또는 1개의 0.5g 샘플의 무게를 측정한다.
- 각각 0.5g의 전분 알리쿼트를 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 초음파 프로세서로부터 여러 펄스의 저강도 초음파(12-24 W/cm2)를사용하여 전분 과립을 완전히 분산시한다.
- 일회용 이송 파이펫을 사용하여, 전분 메탄올 서스펜션(~0.2mL)의 작은 한 방울을 50g/L LiCl 메탄올 전해질의 100mL에 비커에서 일정한 교반하에 적용한다. 샘플 구획 도어를 닫습니다.
- 크기 조정 실행 수행
- 하단 악기 도구 모음에서 미리 보기를 클릭하여 미리 보기 실행을 시작합니다. 상태 패널에서 동적으로 표시된 농도 막대가 녹색인지 확인하고 서스펜션에 대해 5 내지 8%의 명목 농도 범위를 나타낸다.
- 아래쪽 도구 모음에서 중지를 클릭하여 미리 보기 실행을 중지합니다. 필요한 경우 서스펜션의 알리쿼트를 전해질로 교체하여 전분-전해질 서스펜션을 희석한 다음 미리 보기 실행을 반복합니다.
참고: 현탁액의 5% 내지 8%의 명목 농도 범위는 응집된 과립에 의한 조리개 막힘으로 인한 중단 없이 달리기를 완료하는 데 매우 중요합니다. 필요한 경우, 낙하 시료 크기 및/또는 전분 메탄올 현탁액의 농도를 조정하여 최적의 범위에서 명목 농도를 갖는 새로운 전분-전해질 현탁액을 만듭니다. - 확인 후 하단 도구 모음에서 시작하여 실행을 시작합니다. 분석기는 실행 중인 상태 패널의 실행 시간과 함께 표시되는 크기의 과립의 총 수가 SOM의 제어 모드에 의해 설정된 총 카운트(125,000 또는 250,000)에 도달하면 자동으로 실행을 완료합니다. 서스펜션 농도(5~8% 범위 이하) 내에 따라 한 번의 실행이 2~5분 이상 걸립니다.
참고: 분석기가 SOM의 막힘 감지 설정당 조리개 차단을 자동으로 감지하면 실행을 중단하고 플러시하여 조리개를 차단 해제하고 새 실행을 시작합니다. 이 막힘 작업은 분석기에서 실행 작업을 취소하기 전에 4회 최대반복되도록 설정됩니다. 이 실행 중단 방해 문제는 표 2에 언급된 두 가지 기술적 방법을 사용하여 토론에 자세히 설명하여 극복할 수 있습니다. - 필요한 경우 하단 도구 모음에서 시작 또는 반복을 클릭하여 동일한 전분 전해질 서스펜션을 사용하여 기술 반복 실행(표 2 및 토론에서 자세히 설명 참조)을 수행합니다.
- 실행 또는 반복 실행이 완료된 후 비커를 비우고 메탄올로 헹구고 다음 실행을 위해 100mL의 신선한 전해질 용액으로 리필합니다.
- 실행 중에 확장 크기 범위 알림 대화 상자가 60 μm보다 큰 과립 수가 총 수의 0.1%를 초과할 때(SOM 설정당)가 나타나면 조리개 직경의 80%까지 확장된 동적 크기 조정 범위를 실행하기 위해 실행 60%에서 80%를 클릭합니다.
참고: 확장 크기 범위 설정은 조리개 직경의 60% 보다 큰 과립에 대한 동작을 제어합니다(이 경우 100 μm). SOM의 설정은 총 수의 0.1% 이상에 도달하면 60 μm보다 큰 전분 과립을 포함시합니다. 실행완료는 여전히 총 수에 의해 제어되며 총 개수의 0.1%(정적으로 미미한 양으로 추정)를 합산하지 않고 는 그렇지 않으면 보다 약간 적은 시간이 소요될 수 있습니다.
- 실행 결과 분석
- SOM이 실행을 제어하는 데 사용된 경우 기본 설정 만들기 마법사 또는 메인 메뉴의 SOP에서 환경 설정 편집을 사용하여 결과의 보기, 인쇄 및 통계 분석을 위해 원하는 대로 기본 설정 설정을 선택합니다.
- 오버레이는 비교를 위해 단일 그래프에서 여러 실행의 결과를 생성합니다.
- 메인 도구 모음 또는 파일 | 오버레이를 클릭합니다. 메인 메뉴에서 오버레이를 사용하여 오버레이 창에 액세스할 수 있습니다. 파일 상자에서 원하는 여러 결과 파일을 탐색하고 선택하고 추가를 클릭하여 선택한 파일 상자로 이동하고 확인을 클릭하여 선택한 결과를 단일 그래프에 오버레이합니다.
- 열려 있는 오버레이에 파일을 추가하려면 RunFile을 클릭| 실행 메뉴에서 오버레이를 위해 열려 오버레이 창에 액세스하고 원하는 파일로 이동한 다음 클릭하여 추가합니다.
- 복제 해석(2 추출물 x 2 전분 샘플링 또는 3추출물 x 1 전분 샘플링)의 평균 결과및 목록 또는 그래프에서 평균 과립 크기 분포 및 통계를 보거나 인쇄합니다.
- 메인 메뉴에서 파일 | FileTool | 클릭합니다. 평균 창을 열 수 있습니다. 파일 상자에서 원하는 여러 결과 파일을 탐색하고 선택하고 추가를 클릭하여 선택한 파일 상자로 이동하고 확인을 클릭하여 선택한 결과를 평균하고 단일 그래프에 평균을 표시합니다.
- 평균 배포판에 추가 결과 파일을 포함하려면 RunFile | 열고 평균에 추가하여 평균 창에 추가를 열고 파일을 탐색하고 추가합니다. 새 평균은 실행(결과) 창 또는 목록의 그래프에 나타납니다.
5. 평균 분포 지정
- 평균 분포를 표시하는 런 메뉴 창에서 | 계산을 클릭합니다. 실행 메뉴의 평균 통계는 행의 평균 통계를 표시하는 통계 요약 창과 열의 평균 분포에 대한 그래프 통계를 엽니다.
- 그래프 통계 열에서 그래픽 기하학적
평균() 및 S.D.(s*)를사용하여 x/s*양식의 평균 분포를 지정합니다. 평균 통계 행에 나열된 평균 S.D. (σ)와 평균 분포의 평균 (μ, 평균 분포의 동일)를 분할하여 평균 복제 분포 사이의 CV 측정 변형을 계산합니다.
참고: 복제 분포 의 수단 간의 변형을 평가하는 평균 S.D.(μ)는 평균 분포의 확산을 측정하는 그래픽 기하학적 S.D.(용)와 다릅니다.
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Representative Results
시술을 검증하고 결정된 과립 크기 분포의 재현성을 입증하기 위해 고구마 전분 샘플의 복제 크기 조정 분석을 수행했습니다. 앞서 설명한시술(28)을이용하여 유사한 발달연령에 사육라인 SC1149-19의 야전성 고구마로부터 의전시(S1 및 S2)를 제조하였다. 각 전분 추출물에서, 20.5 g 알리쿼트 (a 및 b)는 샘플링, 메탄올의 5 mL에 일시 중단 및 골재를 깰 저에너지 초음파의 여러 펄스로 초음파 처리. 전분 메탄올 서스펜션의 두 쌍의 각각은 전분 전해질 서스펜션을 만들기 위해 드롭 샘플링되었으며, 이는 상기 설명된 SOM을 사용하여 각각 125,000개의 과립을 사용하여 두 번(기술적 반복 실행)을 조정하였다. 각 단일 크기 조정 실행에 대해, 총 카운트가 ~65,000 및 ~125,000 이상에 도달하면, 표시된 차동 볼륨 크기 분포의 그래픽 기하학적 S.D.(s*)및 기하학적 평균()은 더 이상 크게 변하지 않는다. 한 쌍의 전분 메탄올 서스펜션을 사용하여 각 반복 실행은 완료 후 병합되어 총 크기 크기 가250,000개에 대한 것입니다.
도 1은 고구마 전분 샘플의 4개의 복제 크기 조정 분석 및 평균 분포에 대한 차동 부피 비율-부피-동량-구형 분포(S1a, S1b, S2a 및 S2b)를 나타낸다. 4개의 복제 분포의 기하학적 수단의 평균에 대한 CV는 3.75%였으며, 크기 조정 결과의 우수한 재현성을 입증했다. 4개의 복제 분포는 250,000개의 과립의 매우 큰 샘플링 크기로부터 결정되었으며, 이는 그래픽 기하학적 S.D.(s*)및 기하학적 평균() 위의 최소 개수(~65,000 및 ~125,000)를 훨씬 초과하여 단일 사이징 실행에 표시된 차동 볼륨 크기 분포의 더 이상 크게 변경되지 않습니다. 따라서 결정된 복제 볼륨 크기 분포는 모두 통계적으로 유효했습니다. 결정된 로그노이트 과립 크기 분포의 사양의 정확도와 비교성(아래 설명)을 위해 이러한 모든 분포는 그래프에 나열된 바와 같이 x/(곱한 분할) s* 형태로 그래픽 기하학적 수단() 및 S.D.(s*)를 사용하여지정하였다. 고구마 전분의 과립 크기 분포는 이전에 설명한 대로 로그노멀(lognormal)으로 엄격하게 장착되어있습니다(28).
그림 1: 고구마 전분 샘플의 복제 크기 분석에서 Lognormal 차동 볼륨 백분율 볼륨-동등한 구체 크기 분포. 그 결과 4개의 복제 크기 조정 해석에 대한 샘플링 방식이 상세했습니다. 복제 분석에서 4개의 분포(S1a, S1b, S2a 및 S2b)는 해당 평균이 x/(곱하고 분할) s*양식을 사용하여 오버레이되고 지정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2는 4개의 복제 크기 조정 분석의 평균(또는 평균) 누적(&) 수 및 볼륨 백분율 크기 분포를 나타내며, 이는 평균 차동 볼륨 백분율 크기 분포의 변환 뷰였습니다. 전분 과립의 누적 수와 볼륨 백분율을 비교한 결과, 부피-동등한 구지름이 더 작은 과립이 총 부피보다 훨씬 더 큰 비율을 차지하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 부피-동등한 구지름이 9.976 μm에 작거나 같을 수록 전체 수의 48.53%를 차지하지만 총 부피의 5.854%에 불과합니다.
그림 2: 고구마 전분 샘플의 4개의 복제 크기 분석에서 전분 과립의 평균 누적(<) 수 및 볼륨 백분율 크기 분포. 두 분포는 그림 1의 평균 크기 분포의 변환 보기입니다. 그래프는 볼륨-동등한 구 크기가 특정 크기 저장소와 같거나 동일한 전분 과립의 누적(&) 수(왼쪽 Y축)와 비교합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 조리개 직경(μm) | 입자 직경 범위(μm) | 입자 체적 범위(μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
표 1: 작물 종에서 전분의 과립을 크기 조정에 대 한 세 가지 가장 유용한 조리개 튜브.
| SOM 설정 | 선택 | |
| 설명 | SOM 설명 | 크기 조정 전분 과립 |
| SOM 작성자 | - | |
| 샘플 설명 | 고구마 전분 샘플 | |
| 전해질 | L-1 리튬 염화물 50g | |
| 분산 | 아니요 | |
| 조리개 | 100 μm | |
| 제어 모드 | 제어 모드 | 총 카운트 [250,000] 또는 [125,000] |
| 폐기물 탱크 | 80% 완전 | |
| 실행 설정 | 샘플 정보 입력 | 예 |
| 실행 횟수 | 1 (또는 2, 반복 실행용) | |
| 실행하기 전에 조리개 튜브를 플러시 | 예 | |
| 실행 후 조리개 튜브를 플러시 | 예 | |
| 파일 저장 | 예, 펄스 데이터 포함 | |
| 데이터 내보내기 | 예 | |
| 인쇄 보고서 | 예 | |
| 샘플 사양과 비교 | 아니요 | |
| 보기 | 크기 | |
| 교반기 설정 | 샘플 비커 | 100ml 멀티라이저 4 ST |
| 교반기 사용 | 예 | |
| 속도 | 【15】, CW(시계 와이즈) | |
| 교반기 위치 | 자동 번역 | |
| 임계값, 현재 및 게인 | 크기 조정 임계값 | 2 μm |
| 조리개 전류 | 1600 mA | |
| 프리앰프 게인 | 2 | |
| 확장 된 크기 범위 b | 총 카운트의 [> 0.1%] 계산시 | |
| 크기 설정에 대한 펄스 | 크기 저장소 | 400 |
| 크기 범위 | 2 ~60 μm | |
| 빈 간격 | 로그 직경 | |
| 우연의 일치 수정 | 예 | |
| 펄스 편집 | 아니요 | |
| 농도 | 샘플 금액 | 0.2 ml |
| 밀도 | - | |
| 사전 희석 계수 사용 | - | |
| 분석 볼륨 | - | |
| 전해질 부피 | 100 ml | |
| 희석 계수 사용 | 아니요 | |
| 막힘 | 막힘 감지 | 자동(실행 시작부터) |
| 기본 막힘 감지: 카운트 레이트 & 20%, 조리개 비율 >40%, 또는 농도 스파이크 >40%입니다. | ||
| 막힘 작업 | 취소, 차단 해제 및 다시 시작,[4] 시간까지 | |
| 아이콘 표시 | 예 | |
| 막힘 모니터 | 카운트 비율 | |
| a: 반복 차단 해제 및 다시 시작이 더 큰 카운트 실행을 완료할 수 없는 경우 동일한 전분 전해질 서스펜션에서 각각 125,000개의 낮은 총 수를크기 조정하는 두 개의 반복 실행을 만들고 메인 메뉴에서[FileTools] [FileTools]아래[FileTools]를사용하여 반복 실행 결과를 병합합니다. 또는, 전분 전해질 현탁액을 낮은 명목 농도(2-5%)를 갖는 새로운 현수액으로 교체한다. 새로운 드롭 샘플 전해질 서스펜션을 준비할 때, 맥박-메탄올 서스펜션을 다시 초음파처리하여 더 많은 응집체를 분해합니다. | ||
| b: 확장 크기 범위는 조리개 직경의 60 % 보다 큰 과립에 대한 동작을 제어합니다 (이 SOM의 100 μm). 이 설정은 총 카운트의 0.1% 보다 큰 경우 60 μm보다 큰 전분 과립을 포함한다고 지정합니다. | ||
표 2: 고구마 전분 샘플의 크기 조정 실행을 제어하기 위한 일반적인 SOM 설정입니다.
| 기본 설정 | 선택 | |
| 인쇄된 보고서 | 샘플 정보 | 샘플, 실행 번호, 크기 저장소, 총 개수 |
| 크기 그래프 | 차동 볼륨 %, 로그 X 축, 7명으로 구성된 그룹별 부드러운 | |
| 크기 통계 | 볼륨, 볼륨 % | |
| 평균 통계 | 총 금액, 평균, S.D. | |
| 오버레이 통계 | 총 금액, 평균, S.D. | |
| 목록 | 열: 빈 번호, 빈 직경(가운데), Diff. Number, diff. Number %, diff. 볼륨 %. | |
| 빈 그룹: 빈 그룹 크기 7, 모든 빈, 그룹 내 의 합계 빈. | ||
| 통계 | 형식 | 기하학적 |
| 범위 | 모든 | |
| 인쇄할 결과 | 범위, 총 금액, 평균, S.D., 95% 신뢰도 | |
| 그래프의 결과 | 범위: 모든, 총 금액, 평균, S.D. | |
| 평균 및 추세 | 평균 가중치b | 볼륨 % |
| 배포c | 차등 | |
| 제한 | 2 S.D. | |
| 펄스 평균화 | 펄스 변환을 크기 범위로 사용 | |
| 내보내기 | 데이터 항목 | 샘플 정보, 통계, 평균 통계, 크기 목록 |
| 내보내기 확장 | .xls | |
| 번호 형식 | 123456.78 | |
| 데이터 형식 | 탭 구분 | |
| 폴더 내보내기 | 현재 폴더 | |
| 페이지 설정 | 사용자 지정 제목 포함, 화면 색상을 사용한 인쇄 그래프 포함 날짜 포함 | |
| 그래프 크기: | 하프 페이지 | |
| 그래프 옵션 | 표시: | 화면 및 색상 프린터 |
| 라인 색상 | (기본값) | |
| 라인 스타일 | (기본값) | |
| 범례 | 오른쪽 상단 | |
| 크기 | (기본값) | |
| 그래프 스타일 | 단계 | |
| 제한 스타일 | 곡선 | |
| 글꼴 및 색상 | 기본 글꼴 및 기본 색상 또는 원하는 대로. | |
| 옵션 보기 | 기본 보기 | 크기, 그래프 |
| 크기 X 축 | 직경 | |
| 측정 | 입자 | |
| 리터 심볼 | L (mL, μL, fL) | |
| 다중라이저 펄스 데이터 | 그래프 는 5010 펄스, 대부분의 5010 펄스목록 | |
| 볼륨 단위 | μm3 | |
| 숫자 | 123456.78 | |
| a: 여기에 지정된 기하학적 평균 및 S.D. 통계는 결정된 차동 볼륨 백분율 등가 구 분포의 축척과 모양을 정의하는 그래픽 통계입니다. x ̅* x/s* 양식에서 로그노이트 분포를 지정하는 데 사용됩니다. | ||
| b: 평균 가중치는 여러 실행의 결과가 다른 가중치 옵션에 의해 평균되는 방식을 나타냅니다. 다른 평균 및 보기 옵션에 대 한 실행 메뉴에서 이러한 설정을 변경 합니다. | ||
| c:[선택] [선택]열기 [평균 통계][실행 메뉴]행의 평균 통계를 볼 수, "평균"열의 평균 분포에 대한 그래프 통계. | ||
표 3: 고구마 전분 샘플의 크기 조정 실행에서 결과의 보기, 분석 및 인쇄를 위한 일반적인 기본 설정입니다.
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Discussion
설명된 절차는 전분 과립 크기 분석을 위한 몇 가지 기존 방법에서 몇 가지 중요한 문제를 해결했습니다. 3D 과립의 부적절한 1D 또는 2D 크기 조정, 균일한 과립 모양으로 인한 크기 조정 측정의 왜곡, 제한된 과립 샘플 크기로 인한 재현성과 모호한 통계적 타당성, 부정확하거나 부적절한 사양(특히 평균 크기의 사용)을 포함하였습니다. 전분 과립의 3D 크기(볼륨)를 측정하고 과립 모양에 반응하지 않는 ESZ 기술을 사용합니다. 매우 큰 과립 샘플 크기(4 x 250,000)를 갖는 복제 분석에서 평균 과립 크기 분포를 도출하는 설계는 결과를 통계적으로 유효하고 재현할 수 있게 할 뿐만 아니라, 또한 기술적으로 크기 조정 정확도를 향상시키기 위해 집계및 손상된 과립에 의한 측정 왜곡을 완화합니다(아래 설명). 대표적인 결과에서 설명한 바와 같이, 절차를 사용하여 결정된 복제 분포의 평균에 대한 CV는 일반적으로 5% 미만으로 결과의 만족스러운 재현성을 나타낸다. 더욱이, 로그노멀 과립 부피-동등한 구체 분포의 배율() 및형상(s*)의곱셈 사양은 전분 샘플에서 분산 과립 크기의 실제 특성을 보다 정확하게 묘사하고, 동일하거나 다른 소스에서 전분의 과립 크기 분석 중의 사용 및 보편적으로 비교하기 간단하다. 따라서 이 절차는 전분 과립 크기의 보다 정확하고 재현 가능하며 통계적으로 유효한 측정을 가능하게 하며, 결정된 과립 로그노멀 크기 분포의 적절한 사양을 가능하게 합니다. 그것은 그람 규모 전분 견본의 모든 과립 크기 분석에 적용되며, 전분 전분 축적 조직에 있는 전분 생합성 장치 및 기계장치에 의해 전분 과립 치수가 성형되는 방법 및 음식 및 산업 용도를 위한 전분의 속성 그리고 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 연구를 위한 필수적인 공구가 될 수 있었습니다.
전분 과립은 크기가 3D 용어로 정의되고 측정되어야 하므로 대부분 구형이 아닌 모양이 있는 스테레오 입자입니다. 따라서, 전분 과립의 부피는 그들의 크기를 가장 잘 정의하며, 부피-동등한 구지름은 구 이외의 스테레오 객체가 단일 1D 크기 매개변수로 정의될 수 없기 때문에 과립 3D 크기를 적절하게 설명하는 데 사용할 수 있는 유일한 단일 1D 크기 파라미터이다. 또한, 모든 식물 종에서 전분 과립은 다양한 발생 주파수모양세트를 가지고 있다. 이러한 형상 분포가 존재함에 따라, 레이저 회절 기술은 이러한 기술에 내재된 시스템 오차가 형상 계수로 쉽게 교정될 수 없기 때문에 입자 형상에 반응하는 입자 크기 조정 기술,예를 들어, 전분 과립 크기 분포의 재현 가능하고 통계적으로 유효한 결정에 적합하지 않다. 실제로 레이저 회절 기술을 사용하여 동일한 고구마 전분 샘플에서 과립 크기의 과립 크기를 복제하는 오류율(CV)은 15-20%28까지도달할 수 있어 재현 가능한 크기 조정 결과가 매우 나쁨을 나타낸다. 불행히도, 과립 모양이 크기 조정 전분 과립에 미치는 영향은 대부분 간과되어 왔으며, 그 결과 문헌에서 모양 반응성 입자 크기 조정 기술을 사용하여 획득한 모호한 전분 과립 크기 데이터의 큰 바디가 발생했습니다.
2파라미터 곱셈 사양은 로그노멀 분포의 배율() 및형상(s*)을모두 정의하며, 지금까지 평균 크기 또는 크기범위(26)의단일 설명자보다 훨씬 더 정확하고 의미 있는 것이다. 곱셈 x/s*, x/(s*)2,x/(s*) 3간격, ± 
s,± 2s,± 3s 간격에 대응하여, 로그노멀 분포의 약 68.3%, 95.5%, 및 99.7% 신뢰 구간을 각각27로커버한다. 기하학적 적 과립 크기 분포의 기하학적 평균 () 및 S.D. (s*)는분석기 소프트웨어에 의해 계산되고 결과의 크기 조정 또는 분석 중에 화면 크기 그래프에 표시하도록 선택할 수있는 크기 분포 곡선의 그래픽 기하학적 평균 및 S.D.에 해당한다. 따라서 곱셈 사양을 사용하는 것이 오히려 편리하고 간단합니다. 또한, 상기 및 s*는전분 생합성장치(28)와관련된 상이한 생리적 의미를 갖는 것으로 입증되었다. 식물 전분 축적 조직에서 전분 과립의 형성이 제약이 없는 복합시스템(31) 또는 세포내 촉매 반응네트워크(32)로 나빠지기 때문에 다양한 식물 종으로부터 전분의 과립 크기 분포는 모든 로그노멀일 수 있다. 밀13,14와같은 일부 식물 종에서 전분의 이중 모달 과립 크기 분포는 두 개의 로그노멀 분포로 간주 될 수 있습니다. 따라서, 과립 로그정규 볼륨-동등한 구체 분포의 곱셈 사양은 또한 다양한 식물 원의 전분및 상이한 측정에 의해 결정된 과립 크기의 통계적으로 유효한 보편적 비교를 허용할 수 있으며, 이는 부피-동등한 구지름 및 s*의형태이기 때문에 탈원이 없는 것이다.
과립 샘플 크기를 나타내는 전분(메탄올 내) 샘플의 분석을 위한 적절한 총 과립 크기 측정 수는 전분 시료에 대한 통계적 유의의의 과립 크기 분포를 성공적으로 결정하는 데 가장 중요합니다. 고구마 전분 샘플의 경우, 한 번의 실행에서 총 카운트가 ~65,000 및 ~125,000 이상에 도달하면, 표시된 차동 볼륨 크기 분포 곡선의 그래픽 기하학적 S.D. (s*)및 기하학적 평균()은 더 이상 크게 변하지 않으며, s*와통계적 유의의에 대한 최소한의 수를 나타낸다. 시술에서 전분 메탄올 샘플에 대한 250,000과립을 크기 조정하는 샘플링 중복성은 크기의 과립 풀에서 골재 및 손상된 과립을 할인하기 위한 것입니다. 집계되거나 손상되거나 부서진 과립이 완료된 실행 또는 두 개의 병합 된 반복 실행에서 총 250,000 과립의 50 %를 차지한다고 가정하더라도, 그래픽 기하학적 S.D.와 결정 된 분포의 평균은 전체 카운트의 절반의 그대로 과립에 의해 고정되었기 때문에 크게 영향을받지 않았을 것입니다. 또한 손상되거나 부서진 과립의 볼륨 크기 감소가 많을수록 분포에 미치는 영향이 줄어듭니다. 이는 더 작은 과립이 더 많은 수의 백분율을 차지하지만 총 크기의 과립의 볼륨 비율이 작기 때문입니다. 도 2에서동일한 평균 분포에 대한 수와 부피 누적 분포의 비교에 의해 입증된 바와 같이, 9.967 μm에 비해 동일구 직경이 작거나 동일한 전분 과립은 전체 수의 약 48.53%를 차지하지만 전체 부피의 5.854%에 불과합니다. 따라서 10μm 미만의 손상되거나 세분화된 과립은 차동 부피 백분율 크기 분포에 매우 작은 영향을 미칩니다. 다른 식물 원의 전분 샘플의 경우, 크기 조정 해석에 적합한 총 수는 시험 실행에서 표시된 크기 분포의 그래픽 기하학적 평균()이 더 이상 크게 변경되지 않는 최소 카운트를 두 배로 늘릴 수 있습니다.
기술적으로, 크기 조정 실행에 대한 가장 중요한 단계는 전분 -전해질 서스펜션에 대한 5 ~ 8 %의 공칭 농도의 최적의 범위에 대한 전해질에 전분 메탄올 서스펜션의 적절한 양을 떨어뜨리는 것입니다. 목표에 도달하기 위해, 전분 메탄올 서스펜션의 낙하 크기와 농도는 시험 실행을 통해 조정될 수 있습니다. 전분 전해질 현탁액의 농도는 최적의 범위보다 높은 크기 조정 정밀도 감소의 위험을 증가시키고, 빈번한 조리개 막힘은 낙태를 실행하도록 이끌어 주어 실행을 완료하는 것을 매우 어렵게 만들 수 있습니다. 그러나 농도가 너무 낮습니다(예: &2%) 전분 전해질 서스펜션은 너무 많은 실행을 연장할 수 있으며, 과립의 비무작위 샘플링으로 인해 다양한 크기 쓰레기통에서 과립주파수를 왜곡하여 허용할 수 없는 오차율(평균 CV > 5%)으로 이어질 수 있습니다. 복제 해석의 경우 크기 조정 실행에 대한 총 카운트는 또한 전분 전해질 서스펜션의 최적의 농도에 큰 영향을 미치므로 전분 메탄올의 양과 농도에 추가됩니다. 실행에 대한 총 카운트가 클수록 실행 완료 시간이 길어지므로 낙태가 실행되는 조리개 막힘에 대한 위험이 증가합니다. 작은 크기의 전분 과립에 사용되는 작은 직경의 조리개 튜브가 작은 전분 과립 (&2 μm)에 사용될 때 골재에 의한 조리개 막힘의 문제가 악화됩니다. 이것은 실제로 절차의 주요 단점 또는 제한입니다. 조리개 막힘 문제는 몇 가지 기술적 수단을 사용하여 어느 정도 완화될 수 있습니다. 전분 메탄올 서스펜션에서 골재(필연적으로 더 손상된 과립)를 분해하기 위해 더 많은 초음파 처리를 사용할 수 있으며, 2-5%의 명목 농도에서 희석된 전분 전해질 현탁액을 분해할 수 있습니다. 또는 동일한 전분 전해질 서스펜션에서 전분 유형에 대한 안정적인 s*와 크기 분포(예: 고구마 전분의 경우 약 125,000개 수)에 대한 최소 총 수를 크기 조정하는 기술적 반복 실행을 사용하고 반복 실행 결과를 병합할 수 있습니다. 도 1에 표시된 4개의 복제 분포(S1a, S1b, S2a 및 S2b)는 동일한 전분 전해질 서스펜션에서 각각 125,000개의 과립을 크기 조정하는 두 개의 병합된 기술 반복 실행으로부터 각각 이었다. 복제 오류 율을 받아 들일 수없는 수준 (즉, 평균 CV > 5 %)으로 증가시킬 수 있기 때문에 두 방법 모두 잘 테스트해야합니다.
유사한 생리적 조건하에서 식물 원에서 전분 샘플의 기술 및 생물학적 복제 크기 조정 분석은 결정된 평균 과립 크기 분포의 재현성과 정확도를 향상시킵니다. 실질적으로, 전분 견본의 3 개 또는 4개의 생물학 복제는 특정 조건의 밑에 동일 조직에서 독립적으로 추출될 수 있습니다. 그러나 이전에는 4개의 생물학적 복제(즉, 1개의 크기 조정 x 1개의 서스펜션 x 4 추출물)의 분포에서 파생된 평균 과립 크기 분포와 두 개의 생물학적 복제물(즉, 1x 2)의 두 가지 기술적 샘플링에서 각각 의 오차율(평균에 대한 CV 및 표준 오류)과 s*에큰 차이가 없음을 발견했습니다. 따라서, 생물학적 복제 샘플은 적어도 고구마 전분의 경우 2개로 감소될 수 있다. 수정하거나 조정할 수 있는 다른 단계 및 기술 매개 변수는 각 단계 또는 절차의 특정 매개 변수 아래에 구체적으로 언급되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 협동 농업 연구 센터에 의해 지원, 농업 및 인간 과학 대학의 통합 식품 보안 연구 센터, 프레리 뷰 A&M 대학. 그의 기술 지원에 대한 Hua Tian에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
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