Summary
Présenté ici est une procédure pour les déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon, et pour spécifier les distributions déterminées de taille lognormal de granule utilisant une forme multiplicative à deux paramètres. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granulés d’échantillons d’amidon à l’échelle graminale pour la recherche en sciences végétales et alimentaires.
Abstract
L’amidon de toutes les sources végétales est composé de granulés dans une gamme de tailles et de formes ayant des fréquences d’occurrence différentes, c’est-à-dire présentant une taille et une répartition desformes. Les données sur la taille des granules d’amidon déterminées à l’aide de plusieurs types de techniques de dimensionnement des particules sont souvent problématiques en raison d’une faible reproductibilité ou d’un manque de signification statistique résultant de certaines erreurs systématiques insurmontables, y compris la sensibilité aux formes granuleuses et aux limites des tailles des échantillons de granules. Nous avons décrit une procédure pour les déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon utilisant la technique de zone de détection électrique, et pour spécifier les distributions déterminées de taille lognormal de granule utilisant une forme multiplicative adoptée à deux paramètres avec une précision et une comparabilité améliorées. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granuleux d’échantillons d’amidon à l’échelle graminée et, par conséquent, pourrait faciliter les études sur la façon dont la taille des granules d’amidon est moulée par l’appareil et les mécanismes de biosynthèse de l’amidon; et comment ils ont un impact sur les propriétés et la fonctionnalité des amidons pour les utilisations alimentaires et industrielles. Les résultats représentatifs sont présentés à partir d’analyses de reproduction des distributions granulées d’échantillons d’amidon de la patate douce à l’aide de la procédure décrite. Nous avons en outre discuté de plusieurs aspects techniques clés de la procédure, en particulier, la spécification multiplicative des distributions de taille lognormal granule et certains moyens techniques pour surmonter le blocage fréquent de l’ouverture par granulés.
Introduction
Les granules d’amidon sont la structure physique dans laquelle deux polymères homoglucanes de réserve principaux dans les tissus de photosynthèse et de stockage des plantes, l’amylose linéaire ou peu ram ram ramée et l’amylopectine fortement ram ramée, sont emballés de façon ordonnée avec quelques composants mineurs, y compris les lipides et les protéines. Les granules d’amidon de diverses espèces végétales présentent de nombreuses formes tridimensionnelles (3D) (examinées en réf.1,2),y compris des sphères, des ellipsoides, des polyèdres, des plaquettes, des cubes, des cuboïdes et des tubules irréguliers. Même ceux du même tissu ou de tissus différents d’une même espèce végétale pourraient avoir un ensemble de formes avec des fréquences d’occurrence variables. En d’autres termes, les granules d’amidon d’une espèce végétale peuvent avoir une répartition statistique caractéristique de la forme, plutôt qu’une forme spécifique. Les formes granuleuses non uniformes et non sphériques rendent difficile la mesure et la définition adéquates de la taille des granules d’amidon. En outre, les granules d’amidon provenant des mêmes tissus d’une espèce végétale sont d’une gamme de tailles avec des proportions différentes, c’est-à-dire présentant une répartition caractéristique de la taille. Cette distribution de taille complique encore l’analyse et la description des tailles de granules d’amidon.
La taille des granules d’amidon a été analysée à l’aide de plusieurs catégories de techniques de dimensionnement des particules (examinées àl’réf. 3),y compris la microscopie, la sédimentation/fractionnement du débit de champ stérique (Sd/StFFF), la diffraction laser et la zone de détection électrique (ESZ). Cependant, ces techniques ne sont pas également adaptées à la détermination des tailles de granules d’amidon en présence d’une forme granule et d’une distribution de taille. La microscopie, y compris la microscopie électronique légère, confoccale et à balayage, est excellente pour les études de morphologie4,5,6,7, structure8,9 et développement10,11 de granules d’amidon, mais à peine adapté pour définir leurs distributions de taille en raison de certaines lacunes inhérentes. Les mesures directes d’images microscopiques de granules ou d’analyses d’images assistées par logiciel de données de microscopie optique (IAOM), qui ont été utilisées pour la détermination de la taille des granules d’amidons de plusieurs espèces, dontle maïs 12,le blé 13,le 14,la pomme de terre 15 et l’orge 16,ne peuvent mesurer que des images 1D (généralement de longueur maximale) ou 2D (surface) de nombres très limités (de dizaines à quelques milliers) d’images de granule d’amidon. Les petites tailles d’échantillonnage de granules qui sont intrinsèquement limitées par les techniques pourraient rarement être statistiquement représentatives, compte tenu des énormes nombres de granules par unité de poids de l’amidon (~120 x10 6 par gramme, en supposant que les sphères de 10 μm à 1,5 g/cm³ de densité) et, par conséquent, pourraient conduire à une mauvaise reproductibilité des résultats. La technique Sd/StFFF peut avoir une vitesse et une résolution élevées, et des fractions de taille étroite de granules d’amidon17, mais a été rarement utilisé probablement parce que sa précision pourrait être gravement affectée par des dommages, des formes différentes, et la densité des granules d’amidon. La technique de diffraction laser est la plus largement utilisée, et a été appliquée pour des analyses de taille granule d’amidon pour toutes les grandes espècesde cultures 3,14,16. Bien que la technique présente de nombreux avantages, elle n’est en fait pas adaptée à la détermination de la taille des granules d’amidon en présence d’une distribution de forme granulée. La plupart des instruments simultanés de diffraction laser s’appuient sur la théorie mie de diffusion de lalumière 18 pour les particules sphériques uniformes et sur la théorie modifiée de Mie18 pour d’autres formes d’uniformité. La technique est donc intrinsèquement très sensible aux formes de particules, et n’est pas tout à fait adaptée, même pour certaines formes d’uniformité19, et encore moins pour les granules d’amidon ayant un ensemble de formes de proportions différentes. La technique ESZ mesure la perturbation du champ électrique proportionnelle au volume de la particule passant par une ouverture. Il fournit des tailles de volume granulés, ainsi que les informations de distribution de nombre et de volume, etc., à haute résolution. Étant donné que la technique ESZ est indépendante des propriétés optiques des particules, y compris la couleur, la forme, la composition ou l’indice réfractif, et que les résultats sont très reproductibles, elle est particulièrement adaptée pour déterminer les distributions de taille des granules d’amidon ayant un ensemble de formes.
La taille des granules d’amidon a également été définie à l’aide de nombreux paramètres. Ils ont souvent été décrits de façon simpliste par diamètres moyens, qui dans certains cas étaient les moyens arithmétiques des longueurs maximales microscopiquement mesurées des images 2D12,20, ou moyennes de diamètres de sphère équivalents3. Dans d’autres cas, les distributions de la taille du granule ont été spécifiées en utilisant des plagesde taille 21,22, le volume moyen de distribution ou le diamètre moyen (équivalent sphère, pondéré par nombre, volume ou surface) en supposant une distribution normale14,23,24,25,26. Ces descripteurs de granules d’amidon provenant de diverses analyses sont d’une nature très différente, et pas strictement comparables. Il pourrait être très trompeur si ces « tailles » de granules d’amidon de différentes espèces ou même les mêmes tissus de la même espèce ont été directement comparés. De plus, le paramètre de propagation (ou de forme) des distributions normales présumées, c’est-à-dire l’écart type σ (ou écart type graphique σg)mesurant la largeur de la distribution (c.-à-d. la propagation des tailles), a été ignoré dans la plupart des études.
Afin de résoudre les problèmes critiques susmentionnés liés aux analyses de dimensionnement du granule d’amidon, nous avons décrit une procédure de détermination reproductible et statistiquement valide des distributions de granules des échantillons d’amidon à l’aide de la technique ESZ, et pour bien spécifier les distributions de taillenormales de granules déterminées à l’aide d’une forme multiplicative à deux paramètresadoptée 27 avec une précision et une comparabilité améliorées. Pour la validation et la démonstration, nous avons effectué des analyses de dimensionnement de granules de réplication d’échantillons d’amidon de sweetpotato à l’aide de la procédure, et spécifié les distributions différentielles lognormal volume-pourcentage volume-équivalent-sphère diamètre en utilisant leurs moyens 
géométriques graphiques et multiplicatifs écarts types s* dans un x/ (multiplier et diviser) s* forme.
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Protocol
1. Préparation d’échantillons d’amidon
- Préparer deux (ou trois) échantillons d’amidon de reproduction à l’échelle du gramme provenant de tissus accumulant de l’amidon de diverses espèces végétales selon les procédures établies (p. ex., pommesde terre 15,patatesdouces 28,grainsde blé 13,29et grains demaïs 30,etc.).
- Lavez soigneusement les échantillons d’amidon avec de l’acétone ou du toluène 3-4x pour minimiser les granulés et les sécher complètement.
REMARQUE : Utilisez des procédures d’extraction qui produisent plus de 1 g d’amidon par préparation. Un ou deux aliquots de 0,5 g de chacun des trois ou deux extraits de reproduction, respectivement, sont échantillonnés pour l’analyse de dimensionnement de granule d’un extrait d’amidon.
2. Préparation d’électrolyte
- Préparer 500 mL de chlorure de lithium de 50 g/L dans le méthanol pour quatre séries de dimensionnement pour les échantillons d’amidon de réplication (100 mL par course plus 100 mL supplémentaires). De préférence, faire l’électrolyte en lots à grand volume, par exemple, 4 à 8 L à la fois, afin de minimiser la variation de concentration.
- Refroidir le récipient sur de la glace ou dans une armoire à 4 °C pour accélérer la dissolution du chlorure de lithium.
3. Mise en place de l’analyseur
- Choisissez un tube d’ouverture avec une plage de diamètre de particule couvrant la gamme connue (dans la littérature ou par des essais) de taille granule d’échantillons d’amidon à analyser, par exemple, une ouverture de 100 μm pour les amidons de la patate douce. Pour les échantillons d’amidon de taille granule inconnue, sélectionnez une ouverture appropriée par le biais de courses d’essai à l’aide de plusieurs tubes d’ouverture ayant des plages de diamètre de particules qui se chevauchent.
REMARQUE : La plage de diamètre des particules d’un tube d’ouverture est sa plage de dimensionnement précise entre 2 et 60 % et avec une plage de dimensionnement étendue à 80 % de son diamètre d’orifice. Le tableau 1 énumère les propriétés de trois tubes d’ouverture les plus utiles pour dimensionner les granules des amidons des grandes cultures. Si la gamme de taille granuleuse d’un échantillon d’amidon est plus large que la plage de dimensionnement d’un seul tube d’ouverture, effectuez une analyse de chevauchement multi-tube combinant jusqu’à cinq distributions de taille de particules mesurées avec des ouvertures de différentes tailles. Chaque ouverture est identifiable par son diamètre et son numéro de pièce étiqueté sur le tube. Son diamètre et son numéro de série contenus dans un code à barres sur le tube peuvent être numérisés dans le logiciel de l’analyseur à l’aide du lecteur de code à barres sur le panneau de contrôle de l’analyseur. - Choisissez un bécher analytique de 100 ou 200 mL (au-dessus des cuvettes) pour la détermination de la taille des granules d’amidon, et installez l’agitation automatique (ci-dessous) pour maintenir une bonne suspension granuleuse pendant la mesure.
- Créez une méthode d’exploitation standard (SOM) pour spécifier les paramètres d’exécuter et un fichier préférences pour analyser, visualiser et imprimer les résultats. Combinez le fichier SOM et Préférences dans une procédure d’exploitation standard (SOP) au besoin.
REMARQUE : Pour les analyses non standardisables, utilisez SOM pour exécuter les analyses et ajustez les paramètres SOM entre les courses via la fenêtre SOM (voir ci-dessous) au besoin. Après l’achèvement de l’exécuteur, analysez, visualisez et imprimez les résultats de l’exécuteur en changeant les préférences comme vous le souhaitez. Pour les analyses standardisables de dimensionnement des granulés, utilisez un SOP pour exécuter les analyses.- Démarrez le logiciel d’analyseur. Sur le Manu principal, cliquez sur SOP | Créez SOM Wizard ou Modifiez le SOM, ou sur le panneau d’état, cliquez sur Modifier SOM. Utilisez l’assistant ou la fenêtre Modifier la fenêtre SOM pour sélectionner les paramètres d’un SOM. Les paramètres généralement utilisés pour dimensionner les granules d’échantillons d’amidon de sweetpotato sont résumés dans le tableau 2.
- Enregistrez le SOM créé dans un fichier dans la fenêtre SOM Wizard-Summary of Settings ou dans la fenêtre Modifier la fenêtre SOM.
- Sur le Manu principal, cliquez sur SOP | Créer des préférences Assistant ou Modifier les préférences. Utilisez l’assistant ou les onglets de la fenêtre modifier les préférences pour sélectionner les paramètres de préférence comme ceux du tableau 3 ou d’autres comme vous le souhaitez.
- Enregistrez les préférences sélectionnées pour un fichier dans la fenêtre Créer des préférences Wizard-Summary of Settings ou dans la fenêtre Préférences d’édition.
- Sur le menu principal, cliquez sur SOP | Créer SOP Wizard. En suivant le guide étape par étape de l’assistant, entrez une description, sélectionnez le fichier SOM et Préférences pour créer et enregistrer un SOP.
4. Analyses de dimensionnement granule des échantillons d’amidon
- Préparer l’analyseur
- Allumez l’analyseur, ouvrez le logiciel dans l’ordinateur et vérifiez l’état Ready en haut du panneau d’état après sa connexion automatique à l’analyseur.
- Remplir le pot d’électrolyte d’électrolyte, vider le pot à déchets si nécessaire.
- Installez et fixez correctement le tube d’ouverture choisi en suivant le guide dans le manuel de l’utilisateur. Pour un nouveau tube d’ouverture non calibré, calibrez-le en suivant le guide étape par étape sous Calibration | Ouverture calibrée sur le menu principal. Pour un tube d’ouverture calibré, vérifiez l’étalonnage en suivant le guide étape par étape de l’assistant de tube d’ouverture de changement sous la course ou l’étalonnage | Vérifiez l’étalonnage d’ouverture sur le menu principal.
- Déverrouillez la plate-forme d’analyse en poussant le clip de verrouillage-libération (sur le devant central du mur gauche de compartiment d’échantillon) et abaissez manuellement la plate-forme vers le bas. Placez un bécher analytique contenant 100 mL d’électrolyte sur la plate-forme, déplacez l’agitateur à la position d’agitation et soulevez manuellement la plate-forme à la position supérieure auto-verrouillage pour immerger le tube d’ouverture et l’agitateur dans l’électrolyte.
- Cliquez sur Remplir sur la barre d’outils de l’instrument inférieur pour que l’analyseur remplisse automatiquement le système avec l’électrolyte et cliquez sur Flush pour que l’analyseur rince automatiquement le système.
- Chargez le SOM en cliquant sur SOP | chargez un SOM sur le menuprincipal, et utilisez le SOM pour exécuter une analyse sans fichier préférences. Alternativement, chargez un SOP en cliquant sur SOP | Chargez un SOP sur le menu principal ou chargez le SOP sur le panneau d’état, et utilisez le SOP pour exécuter une analyse.
- Si vous utilisez un SOP, cliquez sur SOP | som info ou des informations de préférence sur le menu principal pour vérifier les paramètres SOM et Préférence. Cliquez sur Exemple | Entrez des informations d’échantillon sur le menu principal ou modifiez des informations sur le panneau d’état pour saisir les informations de l’échantillon pour l’exécuter.
- Préparer l’échantillon d’amidon-méthanol et dimensionner les suspensions
- Pesez deux ou un échantillon de 0,5 g de chacun des deux ou trois extraits d’amidon répliqués, respectivement.
- Ajouter chacun des aliquots d’amidon de 0,5 g au méthanol de 5 mL dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL, et disperser complètement les granules d’amidon à l’aide de plusieurs impulsions d’ultrasons de faible intensité (12-24 W/cm2) à partir d’un processeur ultrasonique.
- À l’aide d’une pipette de transfert jetable, appliquer une petite goutte de suspension amidon-méthanol (~0,2 mL) sur les 100 mL d’électrolyte de méthanol LiCl de 50 g/L en remuant constamment dans le bécher. Fermez la porte du compartiment échantillonné.
- Effectuer une course de dimensionnement
- Cliquez sur Aperçu dans la barre d’outils de l’instrument en bas pour démarrer un aperçu. Sur le panneau d’état, vérifiez que la barre de concentration affichée dynamiquement est en vert et affiche une plage de concentration nominale de 5 à 8 % pour la suspension.
- Cliquez sur Arrêtez-vous sur la barre d’outils inférieure pour arrêter l’exécuter Preview. Si nécessaire, diluer la suspension amidon-électrolyte en remplaçant un aliquot de la suspension par l’électrolyte, puis répéter une course Preview.
REMARQUE : La plage de concentration nominale de 5 % à 8 % de la suspension est essentielle à l’achèvement d’une course sans arrêt en raison d’un blocage de l’ouverture par granules agrégés. Au besoin, ajustez la taille de l’échantillon de goutte et/ou la concentration de la suspension amidon-méthanol pour faire une nouvelle suspension amidon-électrolyte ayant la concentration nominale dans la plage optimale. - Après la vérification, cliquez sur Démarrer sur la barre d’outils inférieure pour démarrer l’exécuter. L’analyseur termine automatiquement la course une fois que le nombre total de granules de taille, qui est affiché avec le temps d’exécuteur sur le panneau d’état dans une course, atteint le nombre total défini (125.000 ou 250.000) par le mode de contrôle de la SOM. Selon la concentration de suspension (dans une plage de 5-8% ou moins), une seule course prend 2 à 5 min ou plus.
REMARQUE : Lorsque l’analyseur détecte automatiquement un blocage d’ouverture par zone de détection de blocage du SOM, il interrompt la course, rince pour débloquer l’ouverture et démarrer une nouvelle course. Cette action de blocage est réglée pour répéter au maximum pendant quatre fois avant que l’analyseur annule l’opération d’exécuter. Ce problème de blocage par interruption peut être surmonté en utilisant deux méthodes techniques, comme indiqué dans le tableau 2 et détaillé dans la discussion. - Si nécessaire, effectuez une répétition technique (voir tableau 2 et détaillée dans Discussion) à l’aide de la même suspension amidon-électrolyte en cliquant simplement sur Démarrer ou répéter sur la barre d’outils inférieure.
- Après l’achèvement d’une course ou d’une répétition, videz le bécher, rincez-le avec du méthanol et remplissez-le d’une solution d’électrolyte frais de 100 mL pour la prochaine course.
- Au cours d’une exécution, si un dialogue de notification de plage de taille étendue apparaît lorsque le nombre de granules de plus de 60 μm dépasse 0,1 % du nombre total (par paramètre SOM), cliquez sur Exécuter 60 % à 80 % pour exécuter une plage de dimensionnement dynamique étendue à 80 % du diamètre de l’ouverture.
REMARQUE : Le réglage de la plage de taille étendue contrôle les actions pour les granulés de plus de 60 % du diamètre de l’ouverture (100 μm, dans ce cas). Le réglage du SOM précise l’inclusion de granules d’amidon de plus de 60 μm lorsque leur dénombrement atteint plus de 0,1 % du nombre total. L’achèvement de la course est toujours contrôlé par le nombre total, et peut prendre un peu moins de temps qu’autrement sans l’inclusion des granules plus grands totalisant moins de 0,1% (quantité présumée statiquement insignifiante) du nombre total.
- Analyser les résultats de l’exécuter
- Si un SOM a été utilisé pour contrôler les tirages, sélectionnez les paramètres préférences comme vous le souhaitez pour la visualisation, l’impression et les analyses statistiques des résultats à l’aide de l’assistant Créer des préférences ou des préférences d’édition sous le SOP sur le menu principal.
- La superposition résulte de plusieurs séries sur un seul graphique à comparer.
- Cliquez sur Superposition sur la barre d’outils principale ou le fichier | Superposition sur le menu principal pour accéder à la fenêtre Superposition. Accédez et sélectionnez plusieurs fichiers de résultats souhaités dans la boîte Fichiers, cliquez sur Ajouter pour les déplacer vers la case Fichiers sélectionnés, et cliquez sur OK pour superposer les résultats sélectionnés sur un seul graphique.
- Pour ajouter un fichier à une superposition ouverte, cliquez sur RunFile | Ouvrez pour superposition sur le menu Exécuter pour accéder à la fenêtre Superposition, naviguer vers le fichier désiré, et cliquez pour ajouter.
- Résultats moyens des analyses de reproduction (2 extraits x 2 prélèvements d’amidon ou 3 extraits x 1 échantillon d’amidon), et afficher ou imprimer la distribution moyenne de la taille du granule et les statistiques dans une liste ou un graphique.
- Sur le menu principal, cliquez sur File | FileTool | Moyenne pour ouvrir la fenêtre Moyenne. Accédez et sélectionnez plusieurs fichiers de résultats souhaités dans la boîte Fichiers, cliquez sur Ajouter pour les déplacer vers la case Fichiers sélectionnés, et cliquez sur OK pour faire la moyenne des résultats sélectionnés et afficher la moyenne sur un seul graphique.
- Pour inclure un fichier de résultat supplémentaire dans une distribution moyenne, sur le menu Exécuter, cliquez sur RunFile | Open et Ajouter à la moyenne pour ouvrir la fenêtre Ajouter à la moyenne, naviguer et ajouter le fichier. La nouvelle moyenne apparaît sur le graphique de la fenêtre ou de la liste Run (résultat).
5. Spécifier la distribution moyenne
- Dans la fenêtre Run-Menu affichant la distribution moyenne, cliquez sur Calculer | Statistiques moyennes sur le menu Exécuter pour ouvrir la fenêtre de résumé des statistiques, qui affiche les statistiques moyennes en lignes, et les statistiques graphiques pour la distribution moyenne dans les colonnes.
- Utilisez la moyenne géométrique graphique (
) et S.D. (s*) dans la colonne de statistiques graphique pour spécifier la distribution moyenne dans le x/ s* forme. Calculer les variations de mesure du CV entre les distributions moyennes de répliques en divisant la moyenne (μ, la même que la distribution moyenne) des moyens géométriques des distributions moyennes avec le S.D. moyen (σ) indiqué dans la ligne moyenne des statistiques.
REMARQUE : Le S.D. moyen (pour μ) évaluant les variations entre les moyens des distributions de répétition est différent de la S.D. géométrique graphique (pour) mesurant l’écart de la distribution moyenne.
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Representative Results
Pour valider la procédure, et démontrer la reproductibilité de la distribution déterminée de taille de granule, nous avons exécuté reproduire des analyses de dimensionnement des échantillons d’amidon de sweetpotato. Nous avons préparé des échantillons d’amidon de reproduction (S1 et S2) provenant de patates douces cultivées en champ d’une lignée de reproduction SC1149-19 à un âge de développement similaire à l’aide d’une procédureprécédemment décrite 28. De chaque extrait d’amidon, deux aliquots de 0,5 g (a et b) ont été échantillonnés, suspendus dans 5 mL de méthanol et sonifiés avec plusieurs impulsions d’ultrason de basse énergie pour décomposer des agrégats. Chacune des deux paires de suspensions amidon-méthanol a été échantillonnée pour fabriquer une suspension amidon-électrolyte, qui a ensuite été dimensionnée deux fois (répétition technique) en utilisant le SOM décrit ci-dessus pour un nombre total de 125 000 granules chacun. Pour chaque course de dimensionnement unique, une fois que le nombre total atteint plus de ~65.000 et ~125.000, le graphique géométrique S.D. (s*) et géométrique moyenne ( ) de la distribution différentielle affichée de taille de volume ne changent plus significativement, respectivement. Chaque paire des séries répétées à l’aide d’une suspension amidon-méthanol a été fusionnée après l’achèvement pour un dénombrement total de dimensionnement de 250 000.
La figure 1 montre les distributions différentielle de volume-pourcentage volume-équivalent-sphère-diamètre (S1a, S1b, S2a et S2b) pour les quatre analyses de dimensionnement de répétition des échantillons d’amidon de sweetpotato, et leur distribution moyenne. Le CV pour la moyenne des moyens géométriques des quatre distributions de répétition était de 3,75 %, ce qui démontre une excellente reproductibilité des résultats de dimensionnement. Chacune des quatre distributions de répliques a été déterminée à partir d’une très grande taille d’échantillonnage de 250 000 granules, dépassant de loin les nombres minimes (~65 000 et ~125 000) au-dessus duquel le S.D. géométriquegraphique (s*) et la moyenne géométrique () de la distribution différentielle affichée de la taille du volume en une seule course de dimensionnement ne changent plus significativement. Par conséquent, les distributions déterminées de la taille du volume étaient toutes statistiquement valides. Pour une meilleure précision et comparabilité (ci-dessous) de la spécification des distributions déterminées de taille de granule lognormal, toutes ces distributions ont été spécifiées en utilisant leurs moyens géométriques graphiques ( )etS.D. ( s *) dans un x/ (multiplier et diviser) s* forme comme indiqué sur le graphique. S’il vous plaît noter que la distribution de la taille granule de l’amidon de la patate douce a été rigoureusement ajusté pour être lognormal commedécrit précédemment 28.
Figure 1 : Répartitions différentielles lognormales de taille de volume-pourcentage-équivalent-sphère des analyses de dimensionnement des échantillons d’amidon de sweetpotato. Le schéma d’échantillonnage des quatre analyses de dimensionnement de reproduction a été détaillé dans le résultat. Les quatre distributions (S1a, S1b, S2a et S2b) provenant d’analyses de répétition et leur moyenne ont été superposées et spécifiées à l’aide de la forme x/ (multiplier et diviser) s* . S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 montre les distributions moyennes (ou moyennes) cumulatives (et lt;) de la taille du nombre et du pourcentage de volume des quatre analyses de dimensionnement de répétition, qui étaient des vues de transformation de la répartition différentielle moyenne de la taille du pourcentage de volume. La comparaison entre le nombre cumulatif et les pourcentages de volume des granules d’amidon a montré que les granules ayant des diamètres de sphère équivalents en volume plus petits représentaient des pourcentages beaucoup plus importants du nombre total que le volume total. Par exemple, le nombre de granules ayant des diamètres de sphère équivalents en volume plus petits ou égaux à 9,976 μm représentait 48,53 % du nombre total, mais seulement 5,854 % du volume total.
Figure 2 : Distribution cumulative moyenne (<) de la taille du nombre et du pourcentage de volume des granules d’amidon provenant des quatre analyses de dimensionnement des échantillons d’amidon de la patate douce. Les deux distributions sont des vues de transformation de la répartition de la taille moyenne à la figure 1. Le graphique compare le nombre cumulatif (<) (axe Y gauche) aux pourcentages de volume (axe Y droit) des granules d’amidon ayant des tailles de sphère équivalentes en volume inférieures ou égales à des bacs de taille particulière. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Diamètre d’ouverture (μm) | Gamme de diamètre des particules (μm) | Gamme de volume de particules (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0,524 - 33,5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Tableau 1 : Trois tubes d’ouverture les plus utiles pour dimensionner les granules d’amidons des espèces cultivées.
| Paramètres SOM | Sélection | |
| Description | Description SOM | Granules d’amidon de dimensionnement |
| Auteur som | - | |
| Description de l’échantillon | Échantillons d’amidon de sweetpotato | |
| Électrolyte | 50 g de chlorure de lithium L-1 | |
| Dispersant (Dispersant) | Non | |
| Ouverture | 100 μm | |
| Mode de contrôle | Mode de contrôle | Nombre total [250 000] ou [125 000] |
| Réservoir de déchets | Quand 80% plein | |
| Exécuter les paramètres | Entrez l’exemple d’informations | Oui |
| Nombre de pistes | 1 (ou 2, pour les répétitions) | |
| Rincer le tube d’ouverture avant la course | Oui | |
| Rincer le tube d’ouverture après la course | Oui | |
| Enregistrer le fichier | Oui, y compris les données d’impulsions | |
| Données sur l’exportation | Oui | |
| Rapport d’impression | Oui | |
| Comparer aux spécifications de l’échantillon | Non | |
| Vue | Taille | |
| Paramètres stirrer | Échantillon bécher | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Utiliser stirrer | Oui | |
| Vitesse | [15], CW (horloge sage) | |
| Position stirrer | Automatique | |
| Seuil, courant et gain | Seuil de dimensionnement | 2 μm |
| Courant d’ouverture | 1600 mA | |
| Gain préampli | 2 | |
| Gamme de taille étendue b | Lorsque le compte [> 0,1%] du nombre total | |
| Paramètres pulse to size | Bacs de taille | 400 |
| Gamme de tailles | 2 à 60 μm | |
| Espacement des bacs | Diamètre du journal | |
| Correction de coïncidence | Oui | |
| Édition pulse | Non | |
| Concentration | Montant de l’échantillon | 0,2 ml |
| Densité | - | |
| Utiliser le facteur de pré-dilution | - | |
| Volume analytique | - | |
| Volume d’électrolyte | 100 ml | |
| Utiliser le facteur de dilution | Non | |
| Blocage | Détection de blocage | Automatique (Dès le début de l’exécuter) |
| Détection de blocage par défaut: lorsque le taux de comptage <20%, taux d’ouverture >40%, ou pic de concentration >40%. | ||
| Action de blocage | Annuler, débloquer et redémarrer, jusqu’à [4] fois | |
| Afficher l’icône | Oui | |
| Moniteur de blocage | Taux de comptement | |
| a: Si le débloquage et le redémarrage répétés ne pouvaient pas obtenir la plus grande série de comptage terminée, faire deux séries répétées de dimensionnement d’un nombre total inférieur de 125.000 chacun de la même suspension amidon-électrolyte, et fusionner les résultats des séries répétées en utilisant [MergeRuns] sous [FileTools] de [Fichier] dans le menu principal. Alternativement, remplacez la suspension amidon-électrolyte par une nouvelle ayant une concentration nominale plus faible (2-5%). Lors de la préparation d’une nouvelle suspension d’amidon-électrolyte goutte-échantillon, pulse-sonicate la suspension amidon-méthanol à nouveau pour briser plus d’agrégats. | ||
| b: La gamme de taille étendue contrôle les actions pour les granulés de plus de 60 % du diamètre de l’ouverture (100 μm dans ce SOM). Le réglage précise l’inclusion de granules d’amidon de plus de 60 μm lorsque leur dénombrement est supérieur à 0,1 % du nombre total. | ||
Tableau 2 : Paramètres SOM typiques pour le contrôle des séries de dimensionnement pour les échantillons d’amidon de sweetpotato.
| Paramètres de préférence | Sélection | |
| Rapports imprimés | Exemples d’informations | Échantillon, numéro d’exécuter, bacs de taille, nombre total |
| Graphiques de taille | Volume différentiel %, Axe Log X, Lisse par groupes de sept | |
| Statistiques de taille | Volume, Volume % | |
| Statistiques moyennes | Montant total, moyen, S.D. | |
| Statistiques de superposition | Montant total, moyen, S.D. | |
| Liste | Colonnes: Numéro de bac, Diamètre du bac (au centre), Diff. Nombre, Diff. Nombre %, Diff. Volume %. | |
| Bin Grouping: Bin Group Taille 7, Tous les bacs, Sum Bins dans le groupe. | ||
| Statistiques | Type | Géométriquea |
| Gamme | Tous | |
| Résultats à imprimer | Fourchette, Montant total, Moyenne, S.D., limites de confiance de 95 % | |
| Résultats sur graphique | Gamme: Tous, Montant total, Moyenne, S.D. | |
| Moyenne et tendance | Pondération moyenneb | Volume % |
| Distributionc | Différentiel | |
| Limites | 2 S.D. | |
| Moyenne des impulsions | Utilisez convert pulses en gamme de taille | |
| Exportation | Éléments de données | Exemples d’information, statistiques, statistiques moyennes, liste de taille |
| Extension de l’exportation | .xls | |
| Format de nombre | 123456.78 | |
| Format de données | Onglet Délimité | |
| Dossier d’exportation | Dossier actuel | |
| Configuration de la page | Inclure le titre personnalisé, imprimer des graphiques à l’aide de la couleur de l’écran Inclure la date | |
| Taille du graphique : | Demi-page | |
| Option graphique | Affichage: | Imprimante d’écran et de couleur |
| Couleur de ligne | (Par défaut) | |
| Style de ligne | (Par défaut) | |
| Légende | En haut à droite | |
| Taille | (Par défaut) | |
| Style graphique | Étape | |
| Style limite | Courbe | |
| Polices et couleurs | Polices par défaut et couleurs par défaut ou comme vous le souhaitez. | |
| Afficher les options | Vue par défaut | Taille, Graphique |
| Axe taille X | Diamètre | |
| Mesure | Particules | |
| Symbole de litre | L (mL, μL, fL) | |
| Données d’impulsion multisizer | Graphique tout au plus 5010 impulsions, Liste tout au plus 5010 impulsions | |
| Unités de volume | μm3 | |
| Nombres | 123456.78 | |
| a: Les statistiques géométriques moyennes et S.D. spécifiées ici sont graphiques qui définissent l’échelle et la forme de la répartition différentielle déterminée de la taille de la sphère équivalente en pourcentage de volume. Ils sont utilisés pour spécifier la distribution lognormal dans le formulaire x ̅* x/s*. | ||
| b: La pondération moyenne se réfère à la façon dont les résultats de plusieurs courses sont en moyenne par différentes options de pondération. Modifiez ces paramètres dans le menu Exécuter pour différentes options de moyenne et de vue. | ||
| c: Sélectionnez [Calculer] pour ouvrir [ Statistiques moyennes] dans le menu [Exécuter] pour voir les statistiques moyennes en lignes, les statistiques graphiques pour la distribution moyenne dans la colonne « Moyenne ». | ||
Tableau 3 : Paramètres de préférence typiques pour la vue, les analyses et l’impression des résultats des tirages de dimensionnement pour les échantillons d’amidon de la patate douce.
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Discussion
La procédure décrite a résolu certains problèmes critiques dans plusieurs méthodes existantes pour les analyses de la taille des granules d’amidon, y compris le dimensionnement 1D ou 2D inapproprié des granules 3D, la distorsion des mesures de dimensionnement en raison de formes granulés non uniformes, une faible reproductibilité et une validité statistique douteuse en raison de tailles limitées échantillon granuleux, spécification inexacte ou incorrecte (en particulier l’utilisation de la taille moyenne) de tailles granulés en présence de la forme granule et des distributions de taille non normale. Il utilise la technique ESZ qui mesure les tailles 3D (volume) des granules d’amidon et ne répond pas aux formes granuleuses. La conception visant à tirer la distribution moyenne de la taille du granulé à partir d’analyses de reproduction ayant une très grande taille d’échantillon granulé (4 x 250 000) rend non seulement le résultat statistiquement valide et plus reproductible, mais atténue également techniquement les distorsions de mesure par granules agrégés et endommagés afin d’améliorer la précision du dimensionnement (expliqué ci-dessous). Comme le démontrent les résultats représentatifs, le CV pour la moyenne des moyens géométriques de répliquer les distributions déterminées à l’aide de la procédure est généralement inférieur à 5 %, ce qui indique une reproductibilité satisfaisante des résultats. En outre, la spécification multiplicative de l’échelle () et dela forme (s*) de la distribution de taille de taille de granule granule-équivalent-sphère lognormal représente plus exactement la vraie nature des tailles distribuées de granule dans un échantillon d’amidon, et est simple à utiliser et universellement comparable parmi des analyses de dimensionnement granuleux des amidons de sources identiques ou différentes. Par conséquent, la procédure permet une détermination plus précise, reproductible et statistiquement valide de la taille des granules d’amidon, et une spécification appropriée des distributions déterminées de taille lognormal granule. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granuleux d’échantillons d’amidon à l’échelle grammétrique, et pourrait devenir un outil essentiel pour des études sur la façon dont les dimensions du granule d’amidon sont moulées par l’appareil de biosynthèse de l’amidon et les mécanismes dans les tissus accumulés par amidon végétal, et comment ils ont un impact sur les propriétés et les fonctionnalités des amidons pour des usages alimentaires et industriels.
Les granules d’amidon sont des particules stéréo ayant pour la plupart des formes non sphériques de sorte que leurs tailles doivent être définies et mesurées en termes 3D. Ainsi, les volumes de granules d’amidon définissent le mieux leurs tailles, et le diamètre de la sphère équivalente en volume est le seul paramètre de taille 1D unique qui peut être utilisé pour décrire correctement les tailles 3D granule car aucun objet stéréo autre que la sphère ne peut être défini avec un seul paramètre de taille 1D. En outre, les granules d’amidon de toutes les espèces végétales possèdent un ensemble de formes avec différentes fréquences d’occurrence. En présence d’une telle distribution de forme, toutes les techniques de dimensionnement des particules sensibles aux formes des particules, par exemple, la technique de diffraction laser, ne conviennent pas aux déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon, car l’erreur du système inhérente à ces techniques ne peut pas être facilement corrigée avec un facteur de forme. En fait, le taux d’erreur (CV) parmi les analyses de reproduction des tailles de granules à partir du même échantillon d’amidon de sweetpotato utilisant la technique de diffraction laser pourrait atteindre jusqu’à 15-20%28, indiquant des résultats de dimensionnement très mal reproductibles. Malheureusement, l’impact des formes granulées sur les granules d’amidon de dimensionnement ont été la plupart du temps négligés, qui ont eu comme conséquence un grand corps des données douteuses de taille de granule d’amidon acquises utilisant des techniques de dimensionnement de particules shape-responsive dans la littérature.
La spécification multiplicative à deux paramètres définit à la fois l’échelle () et la forme(s*) des distributions lognormales, et est jusqu’à présent plus précise et significative qu’un seul descripteur de taille moyenne ou une plage de taille26. Les intervallesmultiplicatifs x / s*, x/ (s*)2, et x/ (s*)3, correspondant 
à ± s, ± 2s, et ± 3 sintervalles d’une distribution normale, couvre environ 68,3%, 95,5%, et 99,7% intervalles de confiance d’une distribution lognormale,respectivement 27. La moyenne géométrique ( ) et S.D. ( s * ) d’une distribution de taille granule lognormal correspondent à la moyenne géométrique graphique et S.D. de la courbe de distribution de taille, qui sont calculéspar le logiciel d’analyseur et peuvent être sélectionnés pour afficher sur le graphique de taille à l’écran lors d’une course de dimensionnement ou des analyses des résultats. Il est donc assez pratique et simple d’utiliser la spécification multiplicative. En outre, le et s* ont été démontrés pour avoir différentes implications physiologiques associées à l’appareil de biosynthèse d’amidon28. Les distributions granulées en volume d’amidons provenant de diverses espèces végétales peuvent bien être toutes lognormales puisque la formation de granules d’amidon dans les tissus accumulés par amidon végétal tombe dans un système complexe en évolution sans contrainte31 ou un réseau de réaction catalytique intracellulaire32 caractéristique d’une distribution lognormale. Les distributions bimodales de taille granuleux d’amidons de certaines espèces végétales, comme cellesdu blé 13,14, pourraient être considérées comme deux distributions lognormales. Par conséquent, la spécification multiplicative des distributions de taille granule lognormal volume-équivalent-sphère peut également permettre une comparaison universelle statistiquement valide des tailles de granules déterminées à partir d’amidons de diverses sources végétales et par différentes mesures, comme le est sous la forme de volume équivalent-sphère diamètre et s* est sans démension.
Un dénombrement total approprié du granulé pour l’analyse d’un échantillon d’amidon (en méthanol), qui représente la taille de l’échantillon granule, est le plus important pour la détermination réussie de la répartition de la taille du granulé de la signification statistique de l’échantillon d’amidon. Dans le cas des échantillons d’amidon de la patate douce, une fois que le nombre total en une seule course atteint plus de ~65.000 et ~125.000, le graphique géométrique S.D. ( s*) et géométrique moyenne ( ) de la courbe de distribution différentielle affichée de taille de volume ne changent plus significativement, respectivement, indiquant des comptes minimaux pour le s* et de signification statistique. La redondance de l’échantillonnage dans le dimensionnement de 250 000 granules pour un échantillon d’amidon-méthanol dans la procédure vise à réduire les granules agrégés et endommagés dans la piscine granulée de taille. Même en supposant que les granules agrégés, endommagés ou cassés représentaient 50 % du nombre total de 250 000 granules dans une course terminée ou deux séries répétées fusionnées, le S.D. géométrique graphique et la moyenne de la distribution déterminée n’auraient pas été sensiblement touchés car ils auraient été ancrés par les granules intacts de la moitié du nombre total. En outre, plus la taille du volume des granules endommagés ou cassés est importante, moins ils ont d’impact sur la distribution. C’est parce que les granules plus petits prennent un plus grand pourcentage de nombre, mais des pourcentages plus petits de volume des granules totaux de taille. Comme en témoigne la comparaison entre les distributions cumulatives de nombre et de volume pour la même distribution moyenne à la figure 2,les granules d’amidon d’un diamètre équivalent de sphère inférieur ou égal à 9,967 μm représentaient environ 48,53 % du nombre total, mais seulement 5,854 % du volume total. Ainsi, les granules endommagés ou décomposés de moins de 10 μm auraient un impact très faible sur la répartition différentielle de la taille en pourcentage du volume. Pour les échantillons d’amidon d’autres sources végétales, un décompte total approprié pour leurs analyses de dimensionnement peut être celui qui double le nombre minimal sur lequel la moyenne géométrique graphique () de la distribution de la taille affichée dans un essai ne change plus significativement.
Techniquement, l’étape la plus critique pour une course de dimensionnement est de laisser tomber une bonne quantité de la suspension amidon-méthanol à l’électrolyte pour une plage optimale de 5 à 8% de concentration nominale pour la suspension amidon-électrolyte. Pour atteindre l’objectif, la taille de la goutte et la concentration de la suspension amidon-méthanol peuvent devoir être ajustées au moyen de séries d’essais. Les concentrations des suspensions amidon-électrolyte supérieures à la plage optimale augmentent les risques de réduction de la précision du dimensionnement et de blocages fréquents de l’ouverture conduisant à des avortements, ce qui pourrait rendre très difficile la réalisation d’une course. Mais, une concentration trop faible (p. ex. <2%) de la suspension amidon-électrolyte peut prolonger une course trop, et déformer les fréquences des granules dans des bacs de différentes tailles en raison de l’échantillonnage non aléatoire des granules, ce qui pourrait conduire à un taux d’erreur inacceptable (le CV moyen > 5%) pour une analyse de répétition. Le nombre total pour une course de dimensionnement a également un impact majeur sur la concentration optimale d’une suspension amidon-électrolyte, d’où la quantité et la concentration de l’amidon-méthanol ajouté. Plus le nombre total pour une course est élevé, plus le temps d’achèvement de la course est long, et donc plus il y a de risques de blocages d’ouverture conduisant à des avortements. Le problème du blocage de l’ouverture par les agrégats s’aggrave lorsque des tubes d’ouverture de plus petits diamètres sont utilisés pour les granules d’amidon de plus petite taille, ce qui rend très difficile l’analyse des petits granules d’amidon (< 2 μm). C’est en effet l’inconvénient majeur ou la limitation de la procédure. Le problème du blocage de l’ouverture pourrait être atténué dans une certaine mesure en utilisant certains moyens techniques. On peut utiliser plus de sonication pour briser les agrégats (inévitablement des granulés plus endommagés aussi) dans une suspension amidon-méthanol, et/ou une suspension amidon-électrolyte diluée à des concentrations nominales de 2 à 5 %. Alternativement, on peut utiliser des séries techniques répétées de dimensionnement du nombre total minimal pour stable s* et des distributions de taille pour un type d’amidon (par exemple environ 125.000 comptes pour l’amidon de sweetpotato) de la même suspension amidon-électrolyte, et fusionner les résultats des séries répétées. Chacune des quatre distributions de répétition (S1a, S1b, S2a et S2b) indiquées à la figure 1 proviennent de deux séries techniques fusionnées de dimensionnement de 125 000 granules chacun à partir de la même suspension amidon-électrolyte. Les deux méthodes doivent être bien testées, car elles peuvent augmenter le taux d’erreur de réplication à un niveau inacceptable (c.-à-d. le CV moyen > 5%).
Les analyses techniques et biologiques de dimensionnement des échantillons d’amidon provenant de sources végétales dans des conditions physiologiques similaires améliorent la reproductibilité et l’exactitude de la distribution moyenne déterminée de la taille des granules. Pratiquement, trois ou quatre répliques biologiques d’échantillons d’amidon peuvent être extraites indépendamment du même tissu dans une condition spécifique. Mais, nous avons déjà constaté qu’il n’y avait pas de différence significative dans les taux d’erreur (CV et erreurs standard pour la moyenne), et s* entre la distribution moyenne de la taille du granulé dérivée de distributions de quatre répliques biologiques (c.-à-d., un dimensionnement x une suspension x 4 extraits) et celui de deux échantillons techniques chacun à partir de deux répliques biologiques (c.-à-d. un dimensionnement x 2 suspensions d’amidon-méthanol x 2 extraits)28. Ainsi, les échantillons biologiques de réplique pourraient être réduits à deux, au moins pour l’amidon de sweetpotato. D’autres étapes et paramètres techniques qui pourraient être modifiés ou ajustés ont été spécifiquement notés en dessous de chacune des étapes ou du paramètre particulier de la procédure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ces travaux sont en partie appuyés par le Cooperative Agriculture Research Center et le Integrated Food Security Research Center du College of Agriculture and Human Sciences de l’Université Prairie View A&M. Nous remercions Hua Tian pour son soutien technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
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