Summary
此处介绍了淀粉颗粒大小分布的可重复和统计有效确定过程，以及使用双参数乘法指定已确定的颗粒日志正常大小分布。它适用于植物和食品科学研究的克级淀粉样品的所有颗粒大小分析。
Abstract
来自所有植物来源的淀粉由颗粒组成，其大小和形状具有不同的发生频率，即显示大小和形状分布。 使用几种类型的颗粒大小技术确定的淀粉颗粒大小数据通常是有问题的，因为一些不可逾越的系统错误导致的可重复性差或缺乏统计意义，包括对颗粒形状的敏感性和颗粒样本大小的限制。我们概述了使用电传感区技术可重复和统计有效确定淀粉颗粒大小分布的程序，以及使用采用的两参数乘法来指定已确定的颗粒日志正常大小分布的程序，提高了准确性和可比性。它适用于克级淀粉样品的所有颗粒大小分析，因此，可以促进淀粉颗粒大小如何由淀粉生物合成装置和机制成型的研究：以及它们如何影响淀粉用于食品和工业用途的特性和功能。通过使用概述的程序对甜品淀粉样品的颗粒大小分布进行复制分析，可以呈现具有代表性的结果。我们进一步讨论了该过程的几个关键技术方面，特别是颗粒日志正常大小分布的倍增规格，以及克服颗粒聚合频繁孔径堵塞的一些技术手段。
Introduction
淀粉颗粒是植物光合作用和储存组织中的两种主要储备同质聚合物、线性或稀疏分支淀粉样蛋白和高度分支的淀粉样蛋白，与一些小成分（包括脂质和蛋白质）有序地包装在一起的物理结构。来自各种植物物种的淀粉颗粒呈现出许多三维（3D）形状（参考1、2），包括球体、椭圆体、多壳体、血小板、立方体、立方体和不规则的管状物。即使是来自同一植物物种的同一组织或不同组织的组织，也可能有一组不同发生频率的形状。换句话说，来自植物物种的淀粉颗粒可能有一个特征的统计形状分布，而不是一个特定的形状。非均匀和非球形颗粒形状使得难以正确测量和定义淀粉颗粒大小。此外，来自植物物种同一组织的淀粉颗粒具有不同比例的大小，即表现出特征大小分布。这种大小分布使淀粉颗粒大小的分析和描述进一步复杂化。
淀粉颗粒尺寸已使用几类颗粒大小技术进行分析（在参考3中回顾），包括显微镜、沉积/星体场流分馏（Sd/StFFF）、激光衍射和电传感区（ESZ）。然而，这些技术并不同样适合在颗粒形状和大小分布存在的情况下确定淀粉颗粒大小。显微镜，包括光，共生和扫描电子显微镜，是优秀的形态学研究4，5，6，7，结构8，9和发展10，11淀粉颗粒，但很难定义其大小分布由于一些固有的缺陷。光学显微镜数据（IAOM）的微小颗粒图像或软件辅助图像分析的直接测量，这些数据已用于确定来自几个物种的淀粉颗粒大小， 包括玉米12，小麦13，14，土豆15和大麦16，只能测量1D（通常最大长度）或2D（表面积）大小非常有限的数量（数万至几千）淀粉颗粒图像。考虑到淀粉单位重量的巨大颗粒数（假设所有 10 μm 球体的密度为1.5 g/cm3），固有的受技术约束的小颗粒采样尺寸在统计学上很少具有代表性，因此可能导致结果的可重复性差。Sd/StFFF技术可能具有高速和分辨率，淀粉颗粒17的窄尺寸部分，但很少使用，可能是因为它的准确性可能受到损害，不同的形状和淀粉颗粒密度的严重影响。激光衍射技术是应用最广泛的技术，已应用于淀粉颗粒大小分析的所有主要作物品种3，14，16。虽然该技术有许多优点，但它实际上并不适合在颗粒形状分布的情况下确定淀粉颗粒大小。大多数并发激光衍射仪器依靠米光散射理论18来制造均匀的球形粒子，而修改后的Mie理论18依赖于其他一些均匀形状的粒子。因此，该技术本身对颗粒形状非常敏感，甚至不完全适合某些均匀性19的形状，更不用说淀粉颗粒具有一组不同比例的形状了。ESZ 技术测量电场扰动与通过孔径的粒子体积成正比。它以高分辨率提供颗粒体积大小、数量和体积分布信息等。由于ESZ技术独立于粒子的任何光学特性，包括颜色、形状、成分或折射指数，结果非常可重复，因此特别适合确定具有一组形状的淀粉颗粒的大小分布。
淀粉颗粒大小也通过使用许多参数来定义。它们通常用平均直径简单描述，在某些情况下，平均直径是2D图像12、20或等值球直径3平均最大长度的算术手段。在其他情况下，颗粒大小分布使用大小范围21，22，分布平均体积或平均直径（球面等价物，按数字、体积或表面积加权）来指定，假设正常分布 14、23、24、25、26。这些描述的淀粉颗粒大小从各种分析是一个完全不同的性质，并没有严格的可比性。如果直接比较来自不同物种的淀粉颗粒的这些"大小"，甚至同一物种的相同组织，可能会非常具有误导性。此外，在大多数研究中，测量分布宽度（即大小差）的标准偏差σ（或图形标准偏差σg）的公差（或形状）参数被忽略。
为了解决淀粉颗粒大小分析面临的上述关键问题，我们概述了使用 ESZ 技术对淀粉样品颗粒大小分布进行可重复且统计上有效的确定的程序，并使用采用的两参数倍增形式27正确指定已确定的颗粒日体大小分布，提高了准确性和可比性。为了验证和演示，我们使用该程序对甜品淀粉样品进行了复制颗粒大小分析，并使用其图形几何手段 
和乘法标准偏差s* 以 x/（乘以除法） s* 形式指定日志异常差量百分比体积等价球直径分布。
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Protocol
1. 淀粉样品的准备
- 按照既定程序（例如，土豆15、甜薯28、小麦粒13、29、玉米仁30等），从各种植物物种的淀粉积累组织中准备两个（或三个）克级的复制淀粉样品。
- 用丙酮或甲苯彻底清洗淀粉样品 3-4 倍，以最大限度地减少颗粒聚合并完全干燥。
注：使用每次制剂产生超过1克淀粉的提取程序。分别从三到两个复制提取物中分别抽取一两个0.5克的阿利报价，用于对一种淀粉提取物进行颗粒大小分析。
2. 电解质制备
- 在甲醇中准备 500 mL 的 50 克/升氯化锂，用于复制淀粉样品的四次大小运行（每次运行 100 mL，外加额外的 100 mL）。最好是大批量批量地制造电解质，例如一次4至8升，以尽量减少浓度变化。
- 在冰上或 4 °C 柜中冷却容器，以加速氯化锂的溶解。
3. 设置分析仪
- 选择一个直径范围覆盖已知（在文献或通过试运行）颗粒大小范围淀粉样品的孔径管进行分析，例如，100μm孔径的甜波塔托淀粉。对于颗粒大小范围未知的淀粉样品，请使用几个颗粒直径范围重叠的孔径管，通过试运行选择合适的光圈。
注：孔径管的粒子直径范围是其精确尺寸范围，在2%至60%之间，尺寸范围扩大至孔径的80%。 表1 列出了三个最有用的孔径管的属性，用于大小主要作物淀粉颗粒。如果淀粉样品的颗粒大小范围大于单个孔径管的尺寸范围，则执行多管重叠分析，结合测量的多达五个颗粒大小分布和不同尺寸的孔径。每个光圈的直径和在管子上标记的部分编号可识别。其直径和序列号包含在管子上的条形码中，可以使用分析仪控制面板上的条形码读取器扫描到分析器软件中。 - 选择 100 或 200 mL 分析烧杯（超过 cuvettes）用于确定淀粉颗粒大小，并设置自动搅拌（下图），以在测量过程中保持良好的颗粒悬浮。
- 创建标准操作方法 （SOM） 来指定运行设置，以及用于分析、查看和打印结果的首选项文件。根据需要，将 SOM 和首选项文件组合到标准操作程序 （SOP） 中。
注：对于非标准化分析，请使用 SOM 运行分析，并根据需要在 编辑 SOM 窗口之间调整 SOM 设置（见下文）。运行完成后，通过根据需要更改首选项来分析、查看和打印运行结果。对于标准化颗粒大小分析，请使用 SOP 运行分析。- 启动分析器软件。在主马努，单击 SP| 创建 SOM 向导 或 编辑 SOM，或在状态面板上，单击 "编辑 SOM"。使用向导或 编辑 SOM 窗口来选择 SOM 的设置。通常用于大小甜波塔托淀粉样品颗粒的设置在 表 2中总结。
- 将创建的 SOM 保存到"设置"窗口的 SOM 向导摘要中的文件，或保存在"编辑 SOM"窗口中。
- 在主马努，单击SP| 创建首选项向导或编辑首选项。使用"首选项"编辑窗口中的向导或选项卡，根据需要选择与表 3或其他设置相同的首选项设置。
- 将所选的首选项保存到"创建首选项向导""设置"窗口摘要中的文件中，或保存在 "编辑首选项" 窗口中。
- 在主菜单上，单击 SP|创建 SOP 向导。按照向导的分步指南，输入描述，选择 SOM 和首选项文件以创建和保存SOP。
4. 淀粉样品的颗粒大小分析
- 准备分析仪
- 打开分析仪，打开计算机中的软件，并在其自动连接到分析仪后验证状态面板顶部的"就绪状态"。
- 将电解质罐装满电解质，必要时清空废罐。
- 按照用户手册中的指南正确安装并保护所选的孔径管。对于未校准的新孔径管，根据 校准|校准 主菜单上的光圈。对于校准孔径管，请在运行或校准下的 更改孔径管向导 的分步指南下验证 校准|验证主菜单上的光圈校准 。
- 通过推锁释放夹（在左示例隔间壁的中间前部）解锁检测平台，并手动将平台降低到底部。将含有 100 mL 电解质的分析烧杯放在平台上，将搅拌器移到搅拌位置，并手动将平台提升到自锁的上部位置，将孔径管和搅拌器浸入电解质中。
- 单击 底部 仪器工具栏，让分析仪自动用电解质填充系统，然后单击 "冲洗"， 让分析仪自动冲洗系统。
- 通过单击 SOP |主菜单上 加载 SOM 来加载 SOM， 然后使用 SOM 运行没有首选项文件的分析。 或者，通过单击 SP|加载SP在 主菜单上加载 SOP 或在状态面板上 加载 SOP， 并使用 SOP 运行分析。
- 如果使用 SOP，请单击主菜单上的SOP | SOM 信息或首选项信息，以验证 SOM 和首选项设置。单击示例|在主菜单上输入示例信息或在状态面板上编辑信息，以输入运行中的示例信息。
- 准备淀粉甲醇样品和大小悬架
- 分别从两到三个复制淀粉提取物中各重两到一个0.5克样品。
- 在 50 mL 锥形离心管中将每个 0.5 克淀粉阿利克报价添加到 5 mL 甲醇中，然后使用超声波处理器中的几个低强度超声波脉冲（12-24 W/cm2）完全分散淀粉颗粒。
- 使用一次性转移移液器，在烧杯中不断搅拌下，将一小滴淀粉甲醇悬架（±0.2 mL）涂抹在 50 g/L LiCl 甲醇电解质的 100 mL 上。关闭样品舱门。
- 执行大小运行
- 单击底部仪表工具栏中的 预览 以启动预览运行。在状态面板上，验证动态显示的浓度条是否为绿色，并显示悬挂的 5% 到 8% 名义浓度范围。
- 单击底部工具栏上的 "停止 "以停止预览运行。如有必要，通过用电解质替换悬架的别名来稀释淀粉电解质悬架，然后重复预览运行。
注：由于聚合颗粒的孔径阻塞，悬架的 5% 至 8% 名义浓度范围对于完成无停止运行至关重要。如有必要，调整滴样尺寸和/或淀粉甲醇悬架的浓度，使新的淀粉电解质悬架具有名义浓度的最佳范围。 - 验证后，单击 "启动 底部工具栏"以开始运行。一旦大小颗粒的总计数（在运行中显示与 状态 面板 上的运行时间一起显示）达到 SOM 控制模式 设置的总计数（125，000 或 250，000），分析仪就会自动完成运行。根据悬架浓度（在 5-8% 范围内或更低），单次运行需要 2 到 5 分钟或更远的时间。
注：当分析仪自动检测 SOM 每个阻塞检测设置的孔径阻塞时，它将中止运行、冲洗以解锁光圈并启动新运行。此阻塞操作设置为在分析器取消运行操作之前最大重复四次。使用 表 2 中注明并在讨论中详细说明的两种技术方法可以克服此流产堵塞问题。 - 如果需要，只需单击底部工具栏上的"开始"或"重复"，即可使用相同的淀粉电解质悬架执行技术重复运行（参见表 2并在讨论中详细说明）。
- 运行或重复运行完成后，清空烧杯，用甲醇冲洗，并重新填充 100 mL 新鲜电解质溶液，以进行下一次运行。
- 在运行过程中，如果大于 60 μm 的颗粒数超过总计数的 0.1%（根据 SOM 设置），则会出现 扩展大小范围 通知对话，则单击 "运行"60% 到 80% 以运行到孔径直径 80% 的动态大小范围。
注： 扩展尺寸范围 设置控制直径大于光圈直径 60% 的颗粒的操作（在这种情况下为 100 μm）。SOM 中的设置规定，当淀粉颗粒的计数达到总计数的 0.1% 以上时，其含法量超过 60 μm。运行的完成仍受总计数控制，并且可能需要略少于其他时间，而不包括总计数中总计数的 0.1% （推定静态微不足道的量）的大颗粒。
- 分析运行结果
- 如果 SOM 用于控制运行，请根据需要选择首选项设置，以便使用主菜单上的"创建首选项向导"或SOP下的"编辑首选项"对结果进行查看、打印和统计分析。
- 单个图形上的多个运行的叠加结果进行比较。
- 单击主工具栏或文件|上的叠加叠加在主菜单上以访问叠加窗口。导航到并选择文件框中的多个预期结果文件，单击"添加"将其移动到"已选定文件"框，然后单击"确定"以在单个图形上叠加所选结果。
- 要将文件添加到打开的叠加，请单击运行文件|打开运行菜单上的叠加，以访问叠加窗口，导航到所需的文件，然后单击以添加。
- 复制分析的平均结果（2 个提取物 x 2 淀粉取样或 3 个提取物 x 1 淀粉取样），并在列表或图表中查看或打印平均颗粒大小分布和统计数据。
- 在主菜单上，单击文件|文件| 平均打开平均窗口。导航到并选择文件框中的多个预期结果文件，单击Add将其移动到"选定文件"框，然后单击"确定"以平均所选结果并在单个图形上显示平均值。
- 要在平均分布中包括一个额外的结果文件，在运行菜单上，单击"运行文件"|打开并添加到平均值以打开"添加到平均"窗口、导航到并添加该文件。新平均值显示在运行（结果）窗口或列表中的图表上。
5. 指定平均分布
- 在显示平均分布的运行菜单窗口中，单击"计算|运行菜单上的平均统计数据以打开统计摘要窗口，该窗口以行显示平均统计数据，以及列中平均分布的图形统计。
- 使用图形统计列中的图形几何平均值
（） 和 S.D.（s*）来指定 x/s* 形式中的平均分布。 通过将平均分布的平均值（μ， 与平均分布数相同）与平均统计行中列出的平均 S.D. （σ）的均值（μ相同）除以平均复制分布之间的 CV 测量差异。
注：评估复制分布方式之间差异的平均 S.D.（μ）与 测量平均分布点差的图形几何 S.D. （用于）不同。
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Representative Results
为了验证该过程，并证明已确定颗粒大小分布的可重复性，我们对甜品淀粉样品进行了复制大小分析。我们准备复制（S1和S2）淀粉样品从田间种植的甜味品的育种线SC1149-19在类似的发育年龄使用先前描述的程序28。从每个淀粉提取物中，抽取两个0.5克的aliquot（a和b），悬浮在5 mL的甲醇中，用几脉冲低能超声波进行声波，以分解聚合物。两对淀粉-甲醇悬架中的每一对都经过滴样处理，以制造淀粉-电解质悬架，然后使用上述概述的 SOM 进行两次大小（技术重复运行），每个悬架的总计数为 125，000 粒。对于每个单个大小运行，一旦总计数达到超过 [65，000] 和 [125，000），显示的微分体积大小分布的图形几何 S.D.（s*） 和几何平均值 （） 不再显著变化。每对使用淀粉甲醇悬架的重复运行在完成后合并，总尺寸为 250，000。
图 1显示了甜波塔托淀粉样品的四个复制尺寸分析及其平均分布的微分体积百分比等量球直径分布（S1a、S1b、S2a 和 S2b）。四个复制分布的几何手段的平均 CV 为 3.75%，显示了大小结果的出色可重复性。这四个复制分布都是从 250，000 粒的非常大的抽样大小中确定的，远远超过了最小计数 （约 65，000 和 125，000），而上述图形几何 S.D.（s*） 和在 单个大小运行中显示的微分体积大小分布的几何平均值不再显著变化。因此，已确定的复制体积大小分布在统计学上都有效。为了提高已确定的日志正常颗粒大小分布的规格的准确性和可比性（如下所述），所有这些分布都是通过使用图形几何法 （） 和 S.D.（s*）在 图形上列出的x/（乘和除法）s*形式来指定的。请注意，甜波塔托淀粉的颗粒大小分布已严格安装为日志正常如先前描述的28。
图1：从甜品淀粉样品的复制大小分析中，日体差体积百分比等量球大小分布。结果详细介绍了四个复制尺寸分析的抽样方案。复制分析中的四个分布（S1a、S1b、S2a和S2b）及其平均值使用 x//（乘和除）s*形式覆盖和指定。请点击这里查看此数字的较大版本。
图 2 显示了四个复制大小分析的平均（或平均）累积（+lt：）数字和体积百分比大小分布，这是平均差额百分比大小分布的转换视图。淀粉颗粒的累积数和体积百分比之间的比较表明，体积等价球直径较小的颗粒在总计数中所占的百分比远远大于总体积。例如，体积等效球径较小或相等于 9.976 μm 的颗粒数量占总计数的 48.53%，但仅占总体积的 5.854%。
图2：甜味淀粉样品的四个复制尺寸分析中淀粉颗粒的平均累积量（+lt：）数量和体积百分比大小分布。 这两种分布是图 1 中平均大小分布的转换视图。该图将淀粉颗粒的累积（+lt：）数（左 Y 轴）与体积（右 Y 轴）百分比进行比较，淀粉颗粒的体积等价球大小较低或等于特定大小的箱体。 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 孔径直径 （μm） | 粒子直径范围 （μm） | 粒子体积范围 （+m3） |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
表1：三个最有用的孔径管，用于调整作物品种淀粉颗粒的大小。
| 索姆设置 | 选择 | |
| 描述 | 索姆描述 | 大小淀粉颗粒 |
| 索姆作者 | - | |
| 示例描述 | 甜波塔托淀粉样品 | |
| 电解 质 | 50 g L-1 氯化锂 | |
| 分散 剂 | 不 | |
| 孔径 | 100μm | |
| 控制模式 | 控制模式 | 总计数 [250，000] 或 [125，000]a |
| 废物箱 | 当 80% 已满时 | |
| 运行设置 | 输入样本信息 | 是的 |
| 运行次数 | 1（或2，用于重复运行） | |
| 运行前冲洗孔径管 | 是的 | |
| 运行后冲洗孔径管 | 是的 | |
| 保存文件 | 是的，包括脉冲数据 | |
| 出口数据 | 是的 | |
| 打印报告 | 是的 | |
| 与样品规格进行比较 | 不 | |
| 视图 | 大小 | |
| 搅拌器设置 | 样品烧杯 | 100毫升多增压器 4 ST |
| 使用搅拌器 | 是的 | |
| 速度 | [15]，CW（时钟明智） | |
| 斯特勒位置 | 自动 | |
| 阈值、当前和增益 | 大小阈值 | 2 微米 |
| 孔径电流 | 1600 mA | |
| 预增益 | 2 | |
| 扩展尺寸范围 b | 当计数 [=0.1% ] 的总计数时 | |
| 脉冲到大小设置 | 大小箱 | 400 |
| 大小范围 | 2 至 60μm | |
| 箱间距 | 日志直径 | |
| 巧合更正 | 是的 | |
| 脉冲编辑 | 不 | |
| 浓度 | 样本量 | 0.2 毫升 |
| 密度 | - | |
| 使用预稀释因子 | - | |
| 分析量 | - | |
| 电解质体积 | 100 毫升 | |
| 使用稀释因子 | 不 | |
| 堵塞 | 阻塞检测 | 自动（从运行开始） |
| 默认阻塞检测：当计数速率 =lt;20、光圈率 =40% 或浓度峰值时 =40%。 | ||
| 阻止操作 | 取消、取消阻止和重新启动，最多 [4] 次 | |
| 显示图标 | 是的 | |
| 阻塞监视器 | 计数率 | |
| a：如果重复解锁和重新启动无法完成大计数运行，则从相同的淀粉电解质悬架中进行两次重复运行，每次大小降低 125，000 个，并在主菜单中使用 [文件"的[FileTool]下使用 [合并运行] 合并重复运行的结果。或者，用名义浓度较低的新悬架（2-5%）替换淀粉电解质悬架。在准备一种新的滴样淀粉-电解质悬架时，脉冲声波再次使淀粉-甲醇悬浮物分解更多的聚合物。 | ||
| b：扩展尺寸范围控制孔径大于 60% 的颗粒的动作（此 SOM 中的 100μm）。该设置规定，当淀粉颗粒的计数大于总计数的 0.1% 时，其含法量大于 60 μm。 | ||
表2：用于控制甜味淀粉样品尺寸运行的典型SOM设置。
| 首选项设置 | 选择 | |
| 打印报告 | 示例信息 | 样本、运行编号、大小箱、总计数 |
| 大小图 | 差量%，日志 X 轴，按七组平滑 | |
| 大小统计 | 体积， 体积 % | |
| 平均统计数据 | 总金额，平均值，S.D. | |
| 叠加统计 | 总金额，平均值，S.D. | |
| 清单 | 列：箱号、箱径（中）、差号、差号、差号、差量。 | |
| 箱组：箱组大小7，所有箱，总箱在组。 | ||
| 统计 | 类型 | 几何a |
| 范围 | 所有 | |
| 打印结果 | 范围，总金额，平均值，S.D.，95%的信心限制 | |
| 图表上的结果 | 范围：全部，总金额，平均，S.D. | |
| 平均和趋势 | 平均加权b | 体积百分比 |
| 分布c | 微分 | |
| 限制 | 2 S.D. | |
| 脉冲平均 | 使用将脉冲转换为大小范围 | |
| 出口 | 数据项 | 样本信息、统计、平均统计、大小列表 |
| 出口扩展 | .xls | |
| 编号格式 | 123456.78 | |
| 数据格式 | 已划定选项卡 | |
| 导出文件夹 | 当前文件夹 | |
| 页面设置 | 包括自定义标题、使用屏幕颜色的打印图形（包括日期） | |
| 图形大小： | 半页 | |
| 图形选项 | 显示： | 屏幕和彩色打印机 |
| 线色 | （默认） | |
| 线条样式 | （默认） | |
| 传说 | 右上角 | |
| 大小 | （默认） | |
| 图形样式 | 步 | |
| 限制样式 | 曲线 | |
| 字体和颜色 | 默认字体和默认颜色或根据需要。 | |
| 查看选项 | 默认视图 | 大小， 图形 |
| 大小 X 轴 | 直径 | |
| 测量 | 粒子 | |
| 升符号 | L （毫升， μL， 毫升） | |
| 多增脉冲数据 | 最多 5010 个脉冲的图形，最多列出 5010 个脉冲 | |
| 体积单位 | μm3 | |
| 数字 | 123456.78 | |
| a：此处指定的几何平均值和 S.D. 统计数据是图形统计，它们定义了确定的差分体数百分比等效球体大小分布的尺度和形状。它们用于指定 x ̅* x/s* 表单中的日志正常分布。 | ||
| b：平均加权是指不同加权选项如何平均多个运行的结果。更改"运行"菜单中的这些设置，以查看不同的平均值和查看选项。 | ||
| c：选择 [计算] 在 [运行菜单] 中打开 [平均统计数据]， 以查看行中的平均统计数据， 即 "平均" 列中平均分布的图表统计数据。 | ||
表3：甜味淀粉样品尺寸运行结果的查看、分析和打印的典型偏好设置。
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Discussion
概述的程序解决了淀粉颗粒大小分析的几种现有方法中的一些关键问题， 包括 3D 颗粒的不当 1D 或 2D 尺寸、由于颗粒形状不均匀而导致尺寸测量失真、由于颗粒样本大小有限而重复性差和统计有效性可疑、颗粒大小不准确或不当（特别是使用平均尺寸）的颗粒大小存在颗粒形状和非正常大小分布。它使用 ESZ 技术测量淀粉颗粒的 3D 大小（体积），对颗粒形状无响应。从具有非常大颗粒样本大小（4 x 250，000）的复制分析中得出平均颗粒大小分布的设计不仅使结果在统计学上有效且更具可重复性，而且在技术上还通过聚合和损坏颗粒来减轻测量失真，以提高尺寸精度（如下所述）。如代表结果所示，使用该过程确定的几何复制分布方式的平均 CV 通常小于 5%，表明结果的可重复性令人满意。此外， 淀粉样品中分布颗粒大小分布的尺度（）和形状（s*）的倍增规格更准确地描绘了淀粉样品中分布颗粒大小的真实性质，在相同或不同来源的淀粉颗粒大小分析中使用简单且具有普遍可比性。因此，该程序能够更准确、可重复、统计上有效确定淀粉颗粒大小，并正确规范已确定的颗粒日志异常大小分布。它适用于克级淀粉样品的所有颗粒大小分析，并可能成为研究淀粉颗粒尺寸如何由淀粉生物合成装置和植物淀粉积累组织中的机制成型，以及它们如何影响淀粉对食品和工业用途的特性和功能的研究的重要工具。
淀粉颗粒是具有大多数非球形形状的立体颗粒，因此必须用 3D 术语定义和测量其大小。因此，淀粉颗粒的体积最好定义其大小，而体积等效球径是唯一可用于正确描述颗粒 3D 大小的单个一维尺寸参数，因为除了球体之外，没有立体物体可以用单个 1D 大小参数来定义。此外，来自所有植物物种的淀粉颗粒具有一组具有不同发生频率的形状。在这种形状分布的情况下，任何对粒子形状有反应的粒子大小技术，例如激光衍射技术，都不适合可重复和统计上有效的淀粉颗粒大小分布测定，因为这些技术固有的系统误差不能轻易地用形状因子纠正。事实上，使用激光衍射技术对同一甜品淀粉样品的颗粒大小进行复制分析时的误差率（CV）可能高达15-20%28，表明其可重复性极差。不幸的是，颗粒形状对淀粉颗粒大小的影响大多被忽视了，这导致了大量可疑的淀粉颗粒大小数据，这些数据是在文献中使用形状响应粒子大小技术获得的。
双参数乘法规范定义了 日志正常分布的尺度（）和形状（s*），并且比平均尺寸或大小范围26的单一描述更为精确和有意义。乘法 x/s*，x/（s*）2 和 x/（s*）3个间隔，对应 
于±、±2 和 ±3的正常分布间隔，分别覆盖约68.3%、95.5%和99.7%的日体分布信心区间，分别为27.日志颗粒大小分布的几何平均值 （） 和 S.D. （s*）与大小分布曲线的图形几何平均值和 S.D. 相对应，后者由分析器软件计算，可选择在大小运行或结果分析期间显示在屏幕上的大小图上。因此，使用倍增规范相当方便和简单。此外， 和s*已被证明有不同的生理影响与淀粉生物合成装置28。不同植物物种淀粉的颗粒体积大小分布很可能都是正常现象，因为植物淀粉积累组织中淀粉颗粒的形成落入一个不受约束的进化复杂系统31或细胞内催化反应网络32具有日志正常分布的特点。一些植物物种的淀粉的双模颗粒大小分布，如小麦13、14的淀粉，可视为两种日体分布。因此，颗粒日志正常体积等效球体大小分布的倍增规格也允许从统计学上有效的通用比较颗粒大小确定从各种植物来源的淀粉和不同的测量，因为 是体积等价球直径和s*的形式是无损的。
分析淀粉（甲醇）样品（代表颗粒样本大小）的适当总颗粒大小计数对于成功确定淀粉样品具有统计意义的颗粒大小分布至关重要。在甜波塔托淀粉样品中，一旦单次运行的总计数达到超过 [65，000] 和 [125，000]，所显示的微分体积大小分布曲线的图形几何 S.D. （s*） 和几何均值 （） 不再显著变化，分别表示 s* 和 统计意义的最小计数。在该过程中，淀粉甲醇样品的 250，000 粒颗粒的抽样冗余旨在对大小颗粒池中的聚合和损坏颗粒进行折扣。即使假设在完成运行或两次合并重复运行中，聚合、损坏或破碎的颗粒占 250，000 粒颗粒总数的 50%，图形几何 S.D. 和确定分布的平均值也不会受到显著影响，因为它们会被总计数一半的完整颗粒锚定。此外，受损或破裂颗粒的体积尺寸越小，对分布的影响就越小。这是因为较小的颗粒占比较大，但总尺寸颗粒的体积百分比较小。图 2中相同平均分布的数量和体积累积分布的比较表明，等球直径小于或等于9.967μm的淀粉颗粒约占总数的48.53%，但仅占总量的5.854%。因此，任何损坏或分解的颗粒小于 10 μm，都会对差异体积百分比大小分布产生非常小的影响。对于其他植物来源的淀粉样本，其大小分析的适当总计数可以是 试运行中显示大小分布的图形几何平均值 （） 不再显著变化的最小计数的两倍。
从技术上讲，大小运行的最关键步骤是将适量的淀粉-甲醇悬架放到电解质上，以达到淀粉-电解质悬架5%至8%名义浓度的最佳范围。要达到目标，淀粉甲醇悬架的下降大小和浓度可能需要通过试运行进行调整。淀粉电解质悬架的浓度高于最佳范围会增加尺寸精度降低的风险，以及导致流产的频繁孔径阻塞的风险，这可能导致很难完成运行。但是，浓度过低（例如 +lt;2%）淀粉电解质悬架可能会延长运行太多，并扭曲颗粒在各种大小的垃圾箱的频率，由于颗粒的非随机采样，这可能导致不可接受的错误率（平均 CV > 5%）用于复制分析。大小运行的总计数也对淀粉-电解质悬架的最佳浓度产生重大影响，因此对添加淀粉-甲醇的数量和浓度有重大影响。跑步的总计数越大，完成跑步的时间越长，因此导致流产的孔径堵塞的风险就越大。当小直径的孔径管用于较小尺寸的淀粉颗粒时，聚合的孔径阻塞问题会恶化，这使得分析小淀粉颗粒变得非常困难（+lt; 2 μm）。这确实是程序的主要缺陷或限制。光圈堵塞问题可以通过一些技术手段得到一定程度的缓解。人们可能使用更多的声波分解淀粉甲醇悬浮物中的聚合物（不可避免地也会损坏更多的颗粒）和/或以2-5%名义浓度稀释淀粉-电解质悬浮物。或者，人们可以使用技术重复运行大小的最小总计数稳定 s* 和 大小分布的淀粉类型 （例如约 125，000 计数甜波塔托淀粉） 从相同的淀粉电解质悬架， 并合并重复运行的结果. 图 1 中显示的四个复制分布（S1a、S1b、S2a 和 S2b）均来自两个合并的技术重复运行，每个颗粒大小为 125，000 颗粒，分别来自同一淀粉电解质悬架。这两种方法都需要经过良好的测试，因为它们可能会将复制误差率提高到不可接受的水平（即平均 CV =5%）。
在类似的生理条件下，对来自植物来源的淀粉样品进行技术和生物复制尺寸分析，可提高确定的平均颗粒大小分布的可重复性和准确性。实际上，淀粉样品的三到四个生物复制品可以在特定条件下从同一组织中独立提取。但是，我们以前发现错误率（平均值的 CV 和标准误差） 和 s *从四个生物复制品分布（即一个尺寸 x 1 悬架 x 4 提取物）和两个技术样本（即一个尺寸 x 2 淀粉甲醇悬架 x 2 提取物）28之间的平均颗粒大小分布没有显著差异。因此，生物复制样品可以减少到两个，至少对于甜波塔托淀粉。可修改或调整的其他步骤和技术参数在每个步骤或程序中的特定参数下方特别注明。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了合作农业研究中心和农业与人文科学学院综合粮食安全研究中心、草原景观A&M大学的部分支持。我们感谢华天的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
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