Summary
ここでは、デンプン顆粒サイズ分布の再現性と統計的に有効な決定、および2パラメータ乗法形式を使用して決定された顆粒対数正規サイズ分布を指定するための手順を示します。植物や食品科学の研究のためのグラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能です。
Abstract
すべての植物源からの澱粉は、異なる発生頻度を有する様々なサイズおよび形状の顆粒で構成されている、すなわち、サイズおよび形状分布を示す。 いくつかのタイプの粒子サイズ設定技術を用いて決定されたデンプン顆粒サイズデータは、顆粒形状への感受性や顆粒サンプルサイズの制限など、乗り越えられない体系的な誤りから生じる再現性の悪さや統計的有意性の欠如のためにしばしば問題となる。電気センシングゾーン手法を用いてデンプン顆粒サイズ分布の再現性と統計的に有効な決定、精度と比較可能性を向上させた採用された2パラメータ乗算形式を用いて決定された顆粒対数サイズ分布を指定する手順を概説した。これは、グラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能であり、したがって、デンプン顆粒サイズがデンプン生合成装置およびメカニズムによってどのように成形されているかに関する研究を容易にする可能性があります。そして、それらが食品および産業用途のためのデンプンの特性および機能性に与える影響。代表的な結果は、概説された手順を用いて、サツマイモの澱粉サンプルの顆粒サイズ分布の複製分析から提示される。我々はさらに、手順のいくつかの重要な技術的側面、特に、顆粒対数正規サイズ分布の乗算仕様と、顆粒凝集体による頻繁な開口閉塞を克服するためのいくつかの技術的手段について議論した。
Introduction
デンプン顆粒は、植物光合成および貯蔵組織における2つの主な予備ホモグルカンポリマー、線形またはまばら分岐アミロースおよび高度に分岐したアミロペクチンが、脂質およびタンパク質を含むいくつかのマイナーな成分と一緒に整然と詰まっている物理的構造である。さまざまな植物種のデンプン顆粒は、球体、楕円体、多面体、血小板、立方体、立方体、不規則な細管を含む多くの3次元(3D)形状(ref.1、2)を示す。同じ組織や同じ植物種の異なる組織のそれらでさえ、様々な発生頻度を持つ形状のセットを持つことができます。つまり、植物種由来のデンプン顆粒は、特定の形状ではなく、特徴的な統計的形状分布を有し得る。不均一で球状の顆粒形状により、デンプン顆粒のサイズを適切に測定および定義することが困難になります。さらに、植物種の同じ組織由来のデンプン顆粒は、異なる割合のサイズの範囲、すなわち、特徴的なサイズ分布を示す。このサイズ分布は、デンプン顆粒サイズの分析と記述をさらに複雑にします。
デンプン顆粒のサイズは、顕微鏡、沈積/立体式場流分画(Sd/StFFF)、レーザー回折、電気センシングゾーン(ESZ)を含む粒子サイズ化技術のいくつかのカテゴリ(ref.3)を使用して分析されています。しかしながら、これらの技術は、顆粒状およびサイズ分布の存在下でのデンプン顆粒サイズの決定に等しく適していない。光、共焦点、走査型電子顕微鏡を含む顕微鏡は、形態4、5、6、7、構造8、9、およびデンプン顆粒の開発10、11の研究に優れていますが、固有の欠点のためにそのサイズ分布を定義するのにはほとんど適していません。いくつかの種のデンプンの顆粒サイズの決定に使用されてきた光学顕微鏡データ(IAOM)の顕微鏡顆粒画像またはソフトウェア支援画像分析の直接測定、 トウモロコシ12、小麦13、14、ジャガイモ15、大麦16を含む、1D(通常は最大長)または2D(表面積)サイズの非常に限られた数(数万から数千)のデンプン顆粒画像のみを測定することができます。技術によって本質的に制約される小さな顆粒サンプリングサイズは、デンプンの単位重量当たりの巨大な顆粒数(1グラム当たり120 x 10 6、1.5 g/cm³密度で10 μmの球すべてを仮定)を考慮すると、統計的に代表されることはほとんどありません。Sd/StFFF技術は、高速および分解能、およびデンプン顆粒17の狭いサイズの画分を有する可能性があるが、その精度は、損傷、異なる形状、およびデンプン顆粒の密度によって深刻な影響を受ける可能性があるため、おそらくほとんど使用されていない。レーザー回折技術は最も広く使用され、すべての主要な作物種3、14、16のデンプン顆粒サイズ分析に適用されています。この技術には多くの利点があるが、実際には顆粒形状分布の存在下でのデンプン顆粒サイズの決定には適していない。同時レーザー回折器のほとんどは、均一な球状粒子の三重光散乱理論18と、他の均一性の形状については修正されたMie理論18に依存している。この技術は、したがって、本質的に粒子形状に非常に敏感であり、均一性19の特定の形状にも完全には適しておらず、ましてや様々な割合の形状のセットを有するデンプン顆粒に対しては完全に適していない。ESZ技術は、開口を通過する粒子の体積に比例する電界の乱れを測定する。粒状の体積サイズ、数、体積分布情報などを高解像度で提供します。ESZ技術は、色、形状、組成または屈折率を含む粒子の光学特性とは無関係であり、結果は非常に再現性が高いため、特に一連の形状を有するデンプン顆粒のサイズ分布を決定するのに適している。
デンプン顆粒のサイズも多くのパラメータを使用して定義されています。それらはしばしば平均直径によって皮口的に記述されたが、これはいくつかのケースでは、2D画像12、20、または同等の球径の平均の顕微鏡的に測定された最大長の算術手段であった3。他の場合には、粒状サイズ分布は、サイズ範囲21、22、分布平均容積または平均直径(球量、数、体積、または表面積で重み付け)を使用して指定した場合は、正規分布14、23、24、25、26である。様々な分析からデンプン顆粒サイズのこれらの記述子は、非常に異なる性質のものであり、厳密に比較することはできません。異なる種のデンプン顆粒のこれらの「大きさ」、あるいは同じ種の同じ組織を直接比較した場合、それは非常に誤解を招く可能性があります。さらに、想定された正規分布の広がり(または形状)パラメータ、すなわち、分布の幅(すなわち、サイズの広がり)を測定するσ標準偏差(またはグラフィック標準偏差σ g)は、ほとんどの研究で無視されている。
デンプン顆粒のサイジング分析が直面している前述の重大な問題を解決するために、ESZ技術を用いてデンプンサンプルの顆粒サイズ分布を再現可能かつ統計的に有効な決定を行う手順と、採用された2パラメータの対数正規サイズ分布を正確かつ可分性の向上を用いて適切に指定する手順を概説した。検証とデモンストレーションのために、サツマイモ澱粉サンプルの複製顆粒サイズ分析を手順を用いて実行し 
、x/(乗算および除算)s* 形式で、そのグラフィック幾何平均と乗算標準偏差s * を使用して対数微分体積率体積等価球径分布を指定しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 澱粉サンプルの調製
- 確立された手順に従って、各種植物種のデンプン蓄積組織から2つ(または3グラムスケール)の複製デンプンサンプルを調製する(例えば、ジャガイモ15、サツマイモ28、小麦粒13、29、トウモロコシカーネル30、等)。
- スターチサンプルをアセトンまたはトルエン3~4xで十分に洗浄し、顆粒凝集体を最小限に抑え、完全に乾燥させます。
注: 準備毎に1g以上の澱粉を生成する抽出手順を使用してください。3つまたは2つの反復抽出物のそれぞれから1つまたは2つの0.5gのアリコートが、それぞれ、1つのデンプン抽出物の顆粒サイズ分析のためにサンプリングされる。
2. 電解質製剤
- 50g/L塩化リチウム500 mLをメタノールで調製し、レプリケーションデンプンサンプル(1ランあたり100 mLと100 mLを追加)用に4回のサイジングランにします。好ましくは、電解質を大量のバッチで作り、例えば、一度に4〜8L、濃度変動を最小限に抑える。
- 容器を氷の上または4°Cキャビネットで冷却し、塩化リチウムの溶解を速めます。
3. アナライザーのセットアップ
- 分析するデンプンサンプルの既知の(文献または試行走行を通して)顆粒サイズの範囲(例えば、サツマイモの澱粉の100 μm開口)をカバーする粒子径範囲を有する開口チューブを選択してください。未知の顆粒サイズの範囲のデンプンサンプルの場合、粒子径範囲が重なっているいくつかの絞り管を使用して試行を経て適切な絞りを選択します。
注: 開口チューブの粒子径範囲は、2~60%の正確なサイズ範囲で、オリフィス径の80%まで拡張されたサイズ範囲です。 表1 は、主要な作物デンプンの顆粒をサイズ変更するための3つの最も有用な開口管の特性を示しています。澱粉サンプルの粒状サイズ範囲が単一の開口チューブのサイズ範囲よりも広い場合、異なるサイズの絞りを測定して最大5個の粒径分布を組み合わせたマルチチューブオーバーラップ解析を行います。各絞りは、チューブにラベル付けされた直径と部品番号によって識別できます。チューブ上のバーコードに含まれるその直径とシリアル番号は、アナライザのコントロールパネルのバーコードリーダーを使用して、アナライザソフトウェアにスキャンすることができます。 - デンプン顆粒サイズの測定に100 mLまたは200 mL分析ビーカー(キュベット以上)を選択し、測定中に良好な顆粒懸濁液を維持するために自動攪拌(以下)を設定します。
- 実行設定を指定する標準動作方式 (SOM) と、結果を分析、表示、および印刷するための環境設定ファイルを作成します。SOM と基本設定ファイルを必要に応じて標準操作手順 (SOP) に結合します。
注: 標準化されていない分析の場合は、SOM を使用して解析を実行し、必要に応じて [SOM を編集] ウィンドウ(下記参照)を使用して実行間の SOM 設定を調整します。実行が完了したら、必要に応じて環境設定を変更して、実行結果を分析、表示、および印刷します。標準化可能な顆粒サイズ解析では、SOP を使用して解析を実行します。- アナライザー ソフトウェアを起動します。メインマニュで 、SOP | SOM ウィザードの作成 または SOM の編集を行うか、またはステータス パネルで [SOMの編集] をクリックします。ウィザードまたは [SOM の編集] ウィンドウを使用して、SOM の設定を選択します。サツマイモ澱粉サンプルの顆粒のサイズ変更に一般的に使用される設定を 表 2にまとめています。
- 作成した SOM を、SOM ウィザードの設定の概要 ウィンドウまたは [SOM の編集] ウィンドウでファイルに保存します。
- メインマニュで、[SOP]をクリック|[プリファレンスの作成ウィザード]または[プリファレンスの編集]環境設定編集ウィンドウのウィザードまたはタブを使用して、必要に応じて、表 3または他の設定値として環境設定を選択します。
- 選択した環境設定を、環境設定の作成ウィザードの作成ウィザードの設定の概要ウィンドウまたは 「環境設定の編集」 ウィンドウでファイルに保存します。
- メイン メニューで 、[SOP] をクリック|SOP の作成ウィザード:ウィザードのステップ バイ ステップ ガイドに続いて、説明を入力し、作成する SOM および基本設定ファイルを選択し、SOPを保存します。
4. 澱粉サンプルの粒状サイズ分析
- アナライザーの準備
- アナライザーの電源を入れ、コンピュータでソフトウェアを開き、アナライザーへの自動接続後にステータスパネルの上部にある[準備完了]ステータスを確認します。
- 電解液瓶を電解質で満たし、必要に応じて廃棄物瓶を空にします。
- ユーザーズマニュアルのガイドに従って、選択した絞りチューブを適切に取り付けて固定します。キャリブレーションされていない新しい絞りチューブの場合は、キャリブレーションの下のステップバイステップガイドに従って キャリブレーション| メインメニューで絞りを調整します。校正された絞りチューブの場合は、実行またはキャリブレーションの下にある「 絞り管の変更」ウィザード のステップバイステップガイドに従って キャリブレーションを確認|メインメニューで絞りキャリブレーションを確認 します。
- ロックリリースクリップ(左サンプルコンパートメントの壁の中央前面)を押して、手動でプラットフォームを下に下げて、アッセイプラットフォームのロックを解除します。100 mL の電解質を含む分析ビーカーをプラットフォームに配置し、攪拌位置に攪拌機を移動し、手動でプラットフォームをセルフロックの上の位置に上げて、開口チューブと攪拌機を電解質に浸します。
- 下部の計器ツールバーの [充填] をクリックして、アナライザーに自動的に電解質を入力させ、[ フラッシュ ]をクリックして、アナライザが自動的にシステムをフラッシュします。
- [メイン メニュー] の[SOP | SOM の読み込み] をクリックして SOM を読み込み、SOM を使用して、プリファレンス ファイルを使用せずに分析を実行します。または、SOP |をクリックしてSOP をロードします。メインメニューの SOP をロードするか、ステータスパネルのSOPをロードし、SOP を使用して分析を実行します。
- SOP を使用する場合は、メイン メニューの[SOM 情報]または[基本設定情報| SOP]をクリックして、SOM と基本設定を確認します。[サンプル|メインメニューにサンプル情報を入力するか、ステータスパネルで情報を編集して、実行のサンプル情報を入力します。
- デンプンメタノールサンプルとサイジング懸濁液を準備する
- それぞれ2または3つの複製デンプン抽出物から2または1個の0.5gサンプルを秤量する。
- 50 mL円錐形遠心分離管に5 mLメタノールに0.5 gデンプンアリコートをそれぞれ加え、超音波プロセッサから低強度超音波(12-24 W/cm2)のいくつかのパルスを使用してデンプン顆粒を完全に分散させます。
- 使い捨て可能な移管ピペットを使用して、澱粉メタノール懸濁液の1つの小さな滴(〜0.2mL)をビーカーで一定の攪拌下で50 g/L LiClメタノール電解質の100 mLに塗布する。サンプルコンパートメントドアを閉じます。
- サイズ変更の実行
- 下部のインストゥルメントツールバーで「 プレビュー 」をクリックして、プレビューの実行を開始します。ステータスパネルで、動的に表示される濃度バーが緑色で表示され、サスペンションの公称濃度範囲が 5 ~ 8% であることを確認します。
- 下部の ツールバーの 停止をクリックして、プレビューの実行を停止します。必要に応じて、懸濁液のアリコートを電解質に置き換えてデンプン電解質懸濁液を希釈し、プレビュー実行を繰り返します。
注:サスペンションの5%から8%の公称濃度範囲は、凝集した顆粒による絞り閉塞のために停止せずに実行を完了するために重要です。必要に応じて、滴検サンプルサイズ、および/またはデンプンメタノール懸濁液の濃度を調整して、公称濃度を最適範囲にした新しいデンプン電解質懸濁液を作ります。 - 検証後、下部のツールバーの [開始 ]をクリックして実行を開始します。分析装置は、実行中の ステータス パネル に実行時間と共に表示されるサイズの粒の合計数が、SOM の 制御モード によって設定された合計カウント (125,000 または 250,000) に達すると、自動的に実行を完了します。懸濁液濃度(5~8%以下)に応じて、1回の走行に2~5分以上かかります。
注: アナライザーが SOM の閉塞検出設定ごとの絞り閉塞を自動的に検出すると、実行を中止し、絞りを解除してブロックを解除し、新しい実行を開始します。このブロックアクションは、アナライザーが実行操作をキャンセルする前に、最大 4 回繰り返すように設定されています。この実行中止の閉塞問題は 、表 2 に示された 2 つの技術的な方法を使用して、説明で詳しく説明することによって克服できます。 - 必要に応じて、下部ツールバーの[開始]または[繰り返し]をクリックするだけで、同じデンプン電解質懸濁液を使用して技術的な繰り返し実行を実行します(表2および説明の説明)。
- 実行または繰り返し実行が完了した後、ビーカーを空にし、メタノールでリンスし、次の実行のために100 mLの新鮮な電解質溶液で再充填します。
- 実行中に、60 μm を超える顆粒の数が合計カウントの 0.1% を超えた場合に 拡張サイズ範囲 の通知ダイアログが表示された場合は、拡張ダイナミック サイジング範囲を絞り直径の 80% に実行する場合は 、[60% から 80% を実行] をクリックします。
注: 拡張サイズ範囲 の設定は、開口直径の 60% (この場合は 100 μm) を超える顆粒のアクションを制御します。SOM の設定は、60 μm を超えるデンプン顆粒を含めることを指定し、その数が総カウントの 0.1% を超える場合に使用されます。実行の完了は、合計カウントによって制御され、合計の合計 0.1% (静的に有意でない量と推定される) より大きな顆粒を含めずに、それ以外の場合よりもわずかに短い時間を要する場合があります。
- 実行結果の分析
- 実行の制御に SOM を使用した場合は、メイン メニューのSOPの下にある[基本設定の作成ウィザード] または[環境設定の編集]を使用して、結果の表示、印刷、および統計分析に必要な設定を選択します。
- 比較のために、1 つのグラフで複数の実行の結果をオーバーレイします。
- メイン ツールバーまたはファイル|の[オーバーレイ] をクリックします。[メインメニュー]をクリックして[オーバーレイ]ウィンドウにアクセスします。[ファイル] ボックスで目的の複数の結果ファイルに移動して選択し、[追加] をクリックして [選択したファイル] ボックスに移動し、[OK]をクリックして選択した結果を 1 つのグラフに重ね合わせることができます。
- 開いているオーバーレイにファイルを追加するには、[ファイルの実行]をクリック|[実行]メニューの[オーバーレイ]を開いて[オーバーレイ]ウィンドウにアクセスし、目的のファイルに移動して、クリックして追加します。
- 反復分析(2抽出x 2デンプンサンプリングまたは3抽出x 1デンプンサンプリング)からの平均結果を、平均粒状サイズ分布と統計量をリストまたはグラフで表示または印刷します。
- メイン メニューで、[ファイル] | [ファイル] をクリック|平均ウィンドウを開く平均。[ファイル] ボックスで目的の複数の結果ファイルに移動して選択し、[追加] をクリックして [選択したファイル] ボックスに移動します。
- 平均分布に追加の結果ファイルを含めるには、[実行] メニューの [ ファイルを開く] | [平均値に追加 ] をクリックして [平均値に追加] ウィンドウを開き、ファイルに移動して追加します。新しい平均は、グラフの [実行 (結果)] ウィンドウまたはリストに表示されます。
5. 平均分布の指定
- 平均分布を表示するメニューの実行ウィンドウで、計算|[実行] メニューの平均統計値を使用して、統計情報の概要ウィンドウを開き、行の平均統計量と、列の平均分布のグラフ統計を表示します。
- グラフ統計列のグラフィック幾何平均
()および S.D.(s*) を使用して 、x/ s* 形式で平均分布を指定します。平均 統計行にリストされている平均S.D.(σ)を使用して平均分布の幾何平均平均の平均平均平均値(μ、平均分布と同じ)を除算して、平均複製分布の変動を測定するCVを計算します。
注: 複製分布の平均値の変動を評価する平均 S.D. (μ) は、 平均分布の広がりを測定するグラフィックジオメトリ S.D. とは異なります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この手順を検証し、決定した顆粒サイズ分布の再現性を実証するために、サツマイモデンプンサンプルの複製サイジング解析を行いました。先に説明した手順28を用いて同様の発達年齢で、飼育ラインSC1149-19の畑成長サツマイモからの複製(S1およびS2)澱粉サンプルを調製した。各デンプン抽出物から、2つの0.5gアリコート(aおよびb)をサンプリングし、5mLのメタノールに懸濁し、凝集体を分解するために低エネルギー超音波のいくつかのパルスで超音波処理した。デンプンメタノール懸濁液の2組の各ペアをドロップサンプリングしてデンプン電解質懸濁液を作り、次に上記の概説されたSOMを使用して2回サイズ(技術的な繰り返し実行)し、それぞれ125,000顆粒の合計カウントを行った。1 回のサイズ変更の実行ごとに、合計カウントが約 65,000 ~125,000 を超えると、表示された微分体積サイズ分布のグラフィックジオメトリ S.D.(s*) と幾何平均 ( ) はそれぞれ大きく変化しなくなります。1つのデンプンメタノール懸濁液を使用した繰り返し実行の各ペアは、合計サイジング数250,000のために完了後にマージされました。
図1は、サツマイモ澱粉サンプルの4つの複製サイジング分析における体積分量相当の球径分布(S1a、S1b、S2a、S2b)とその平均分布を示しています。4つの複製分布の幾何学的平均のCVは3.75%であり、サイジング結果の再現性が優れています。4つの反復分布のそれぞれは、250,000顆粒の非常に大きなサンプリングサイズから決定され、1回のサイジング走行で表示された微分量分布のグラフィック幾何学的S.D.(s *)と幾何平均 ()を上回る最小数(約65,000~125,000)をはるかに上回る。したがって、決定されたレプリケート ボリューム サイズの分布はすべて統計的に有効でした。決定された対数正規顆粒サイズ分布の仕様の精度と比較性(以下で説明)を向上するために、これらの分布はすべて、 グラフに記載されているx / (乗算と除算)s* 形式のグラフィック幾何学的平均 ()およびS.D. (s *) を使用して指定しました。サツマイモの澱粉の顆粒サイズ分布は、前述の28のように対数正規性に厳密に適合していることに注意してください。
図1:サツマイモの澱粉サンプルの複製サイジング分析による対数微分体積率体積相当球サイズ分布4つの複製サイジング分析のサンプリングスキームが結果に詳述されました。反復分析からの4つの分布(S1a、S1b、S2aおよびS2b)とその平均は 、x/(乗算および除算)s*形式を使用して重ね合わせ、指定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2 は、4 つの反復サイズ変更分析の平均 (平均) または平均 (平均) の累積 (<) サイズ分布と体積率分布を示しています。デンプン顆粒の累積数と体積パーセンテージの比較では、体積相当球径が小さい顆粒が総体積よりも総計数の割合がはるかに大きいことが示されました。たとえば、体積等価球体径が9.976μm以下の顆粒の数は、総計の48.53%を占めましたが、総体積の5.854%に過ぎません。
図2:サツマイモのデンプンサンプルの4つの複製サイジング分析からのデンプン顆粒の平均累積(<)数および体積パーセントサイズ分布。 2 つの分布は、図 1 の平均サイズ分布の変換ビューです。グラフは、体積相当球サイズが特定のサイズのビンより小さいか等しいデンプン顆粒の累積(<)数(左Y軸)と体積(右Y軸)の割合を比較します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 開口径 (μm) | 粒子径範囲(μm) | 粒子体積範囲(μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
表1:作物種のデンプンの顆粒をサイズ化するための3つの最も有用な開口管。
| SOM 設定 | 選択 | |
| 説明 | SOM の説明 | サイズの澱粉顆粒 |
| SOM 著者 | - | |
| サンプルの説明 | サツマイモ澱粉サンプル | |
| 電解 質 | 50g L-1 塩化リチウム | |
| 分 散剤 | いいえ | |
| 絞り | 100 μm | |
| コントロールモード | コントロールモード | 総数 [250,000] または [125,000]a |
| 廃棄物タンク | 80% が満杯のとき | |
| 実行設定 | サンプル情報を入力してください | はい |
| 実行数 | 1 (または 2、繰り返し実行の場合) | |
| 実行前に絞りチューブをフラッシュ | はい | |
| 実行後のフラッシュ絞りチューブ | はい | |
| ファイルの保存 | パルスデータを含むはい | |
| データのエクスポート | はい | |
| レポートの印刷 | はい | |
| サンプル仕様と比較 | いいえ | |
| ビュー | サイズ | |
| スターラー設定 | ビーカーのサンプル | 100 ml マルチサイザー 4 ST |
| スターラーを使用する | はい | |
| 速度 | [15]、CW(時計回り) | |
| スターラー位置 | 自動 | |
| しきい値、電流、ゲイン | サイズ設定のしきい値 | 2 μm |
| 開口電流 | 1600 mA | |
| プリアンプゲイン | 2 | |
| 拡張サイズ範囲 b | カウントの合計 [> 0.1%] の場合 | |
| パルスサイズ設定 | サイズのビン | 400 |
| サイズ範囲 | 2~60μm | |
| ビン間隔 | 丸太径 | |
| 偶然の修正 | はい | |
| パルス編集 | いいえ | |
| 濃度 | サンプル金額 | 0.2 ml |
| 密度 | - | |
| 希釈前係数を使用する | - | |
| 分析容積 | - | |
| 電解質容積 | 100ml | |
| 希釈係数を使用する | いいえ | |
| 閉塞 | 閉塞検出 | 自動 (実行開始から) |
| デフォルトの閉塞検出: カウント率 <20%、絞り率 >40%、または濃度スパイク >40%の場合。 | ||
| 閉塞アクション | キャンセル、ブロック解除、再起動、最大[4]回 | |
| アイコンを表示 | はい | |
| 閉塞モニター | カウント率 | |
| a: ブロック解除と再起動を繰り返しても、より大きなカウントの実行が完了しなかった場合は、同じデンプン電解質懸濁液からそれぞれ 125,000 の小さな合計カウントのサイジングを 2 回繰り返し実行し、メインメニューの [FileTools] の下の [MergeRuns] を使用して、繰り返し実行の結果をマージします。あるいは、デンプン-電解質懸濁液を、公称濃度(2~5%)の低い新しいものに交換します。新しい滴検体デンプン電解質懸濁液を調製する場合は、デンプンメタノール懸濁液をパルス超音波処理して、より多くの凝集体を分解する。 | ||
| b: 拡張サイズ範囲 は、開口径の60%を超える顆粒のアクションを制御します(このSOMでは100 μm)。この設定では、合計カウントの0.1%を超える場合、60 μmを超えるデンプン顆粒を含めることを指定します。 | ||
表2:サツマイモ澱粉サンプルのサイジング実行を制御するための典型的なSOM設定。
| 環境設定 | 選択 | |
| 印刷されたレポート | サンプル情報 | サンプル、実行番号、サイズビン、合計カウント |
| サイズグラフ | 差動ボリューム %、Log X 軸、7 グループ別スムージング | |
| サイズ統計 | ボリューム、ボリューム % | |
| 平均統計量 | 合計金額、平均、S.D. | |
| オーバーレイ統計 | 合計金額、平均、S.D. | |
| リスト | 列: ビン番号、ビン直径(中央)、相違数、差分数%、ディフボリューム%。 | |
| ビングループ化: ビングループサイズ 7、すべてのビン、グループ内の合計ビン。 | ||
| 統計 | 型 | 幾何学的な |
| 範囲 | すべての | |
| 印刷する結果 | 範囲、総量、平均、S.D.、95%の信頼限界 | |
| グラフ上の結果 | 範囲:すべて、合計金額、平均、S.D. | |
| 平均化とトレンド | 平均重み付け b | ボリューム % |
| 分配c | 差分 | |
| 制限 | 2 S.D. | |
| パルス平均化 | パルスをサイズ範囲に変換を使用 | |
| エクスポート | データ項目 | サンプル情報、統計、平均統計量、サイズリスト |
| エクスポート拡張機能 | .xls | |
| 数値の書式 | 123456.78 | |
| データ形式 | タブ区切り | |
| フォルダのエクスポート | 現在のフォルダ | |
| ページ設定 | カスタムタイトルを含める、画面の色を含む日付を使用してグラフを印刷する | |
| グラフサイズ: | ハーフページ | |
| グラフオプション | 表示： | 画面とカラープリンタ |
| 線の色 | (デフォルト) | |
| 線のスタイル | (デフォルト) | |
| 伝説 | 右上 | |
| サイズ | (デフォルト) | |
| グラフスタイル | ステップ | |
| 制限スタイル | 曲線 | |
| フォントと色 | デフォルトのフォントとデフォルトの色または必要に応じて。 | |
| 表示オプション | 既定のビュー | サイズ、グラフ |
| サイズ X 軸 | 直径 | |
| 測定 | 粒子 | |
| リットル記号 | L (mL、μL、fL) | |
| マルチサイザーパルスデータ | グラフは、5010パルス、リストは、せいぜい5010パルス | |
| ボリューム単位 | μm3 | |
| 番号 | 123456.78 | |
| a: ここで指定した幾何平均と S.D. 統計量は、決定された微分体積率の等価球サイズ分布のスケールと形状を定義するグラフィック統計です。x ̅* x/s* 形式で対数正規分布を指定するために使用されます。 | ||
| b: 平均加重は、複数の実行の結果が異なる重み付けオプションによってどのように平均化されているかを指します。異なる平均化と表示オプションの[実行]メニューでこれらの設定を変更します。 | ||
| c: [実行メニュー] で [平均統計] を開くには、[計算] を選択すると、平均統計量が行で表示され、平均分布のグラフ統計が [平均] 列に表示されます。 | ||
表 3: サツマイモの澱粉サンプルのサイジング実行の結果の表示、分析、印刷の標準的な環境設定。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
概説された手順は、デンプン顆粒サイズ分析のためのいくつかの既存の方法でいくつかの重要な問題を解決しました, 3D顆粒の不適切な1Dまたは2Dサイジング、均一な顆粒形状によるサイズ測定の歪み、限られた顆粒サンプルサイズによる再現性の悪さ、疑わしい統計的妥当性、顆粒形状と無正規サイズ分布の両方の存在下での顆粒サイズの不正確または不適切な仕様(特に平均サイズの使用)を含む。デンプン顆粒の3Dサイズ(体積)を測定し、顆粒形状に反応しないESZ技術を使用しています。非常に大きな顆粒サンプルサイズ(4 x 250,000)を持つ複製分析から平均粒状サイズ分布を導出する設計は、結果を統計的に有効で再現性が高めるだけでなく、技術的に凝集した顆粒と損傷した顆粒による歪み測定を軽減してサイズ精度を向上させます(以下を参照)。代表的な結果で示されるように、この手順を用いて決定された複製分布の幾何学的手段の平均に対するCVは、通常5%未満であり、結果の満足のいく再現性を示す。さらに、 対数正規顆粒体積等価球サイズ分布のスケール()と形状(s*)の両方の乗算仕様は、デンプンサンプル中の分布顆粒サイズの真の性質をより正確に描写し、同じまたは異なるソースからのデンプンの顆粒サイズ分析の中で使用し、普遍的に同等である。したがって、この手順により、デンプン顆粒サイズをより正確かつ再現性、統計的に有効な測定が可能になり、決定された顆粒対数正規サイズ分布が適切に指定されます。これは、グラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能であり、デンプン蓄積組織におけるデンプン生合成装置とメカニズムによってデンプン顆粒の寸法がどのように成形されているか、およびそれらが食品および産業用途におけるデンプンの特性および機能性にどのような影響を与えるかについての研究に不可欠なツールとなりうる。
デンプン顆粒は、主に非球形を持つステレオ粒子であるため、サイズを3D項で定義して測定する必要があります。したがって、デンプン顆粒の体積はサイズを最もよく定義し、体積等価球径は、球以外のステレオオブジェクトを単一の1Dサイズパラメータで定義できないため、顆粒3Dサイズを適切に記述するために使用できる唯一の1Dサイズパラメータです。さらに、すべての植物種のデンプン顆粒は、様々な発生頻度を持つ形状のセットを有する。このような形状分布の存在下では、粒子形状に応答する粒子サイズ設定技術、例えば、レーザー回折技術は、これらの技術に固有のシステム誤差を形状因子で容易に補正できないため、デンプン顆粒サイズ分布の再現性および統計的に有効な決定には適さない。実際、レーザー回折技術を用いた同じサツマイモデンプンサンプルからの顆粒サイズの複製分析の中で誤差率(CV)は15-20%28に達する可能性があり、再現性の非常に低いサイジング結果を示しています。残念ながら、粒状形状がサイズ変更デンプン顆粒に与える影響はほとんど見落とされており、その結果、文献中の形状応答性粒子サイズ技術を使用して取得した疑わしいデンプン顆粒サイズデータの大きな体が得られた。
2パラメータ乗数仕様は 、対数正規分布のスケール()と形状(s*)の両方を定義し、平均サイズまたはサイズ範囲26の単一の記述子よりもはるかに正確で意味のある。乗算 x/s *、x/(s *)2、および x/(s*)3間隔は 
、±s、±2 s、および ±3sの正規分布の間隔に対応し、対数正規分布の約68.3%、95.5%、および99.7%の信頼区間をそれぞれ27にカバーする。対数正規顆粒サイズ分布の幾何平均()と S.D. ( s * ) は、分析ツールによって計算されるサイズ分布曲線のグラフィック幾何平均と S.D. に対応し、結果のサイジングまたは分析中に画面上のサイズグラフに表示するように選択できます。したがって、乗算仕様を使用するのは、むしろ便利で、簡単です。さらに、 とs*は、デンプン生合成装置28に関連する異なる生理学的意味を有することが実証されている。各種植物種からのデンプンの粒状体積分布は、植物デンプン蓄積組織におけるデンプン顆粒の形成が、対数正規分布の非制約進化複合系31または細胞内触媒反応ネットワーク32に陥るので、全ての対数的であり得る。小麦13、14のようないくつかの植物種からのデンプンの二相顆粒サイズ分布は、2つの対数正規分布とみなすことができる。したがって、顆粒対数正規体積等価球サイズ分布の乗算仕様は、 体積等価球径の形態であり、s*がデメンソンレスであるため、様々な植物源のデンプンと異なる測定によって決定される顆粒サイズの統計的に有効な普遍的な比較を可能にする可能性がある。
粒状サンプルサイズを表すデンプン(メタノール)サンプルの分析に適した総粒粉径数は、澱粉サンプルの統計的有意性の粒状サイズ分布の決定に最も重要です。サツマイモの澱粉サンプルの場合、1回のランの総数が〜65,000~125,000を超えると、表示された微分体積サイズ分布曲線のグラフィック幾何学的S.D.(s*)と幾何平均 ()は、それぞれ有意に変化しなくなり、s*および 統計的有意性の最小数を示す。手順でデンプンメタノールサンプルの250,000顆粒のサイズを決定するサンプリング冗長性は、サイズの顆粒プール内の凝集した損傷した顆粒を割引することを目的としています。集計および損傷または壊れた顆粒が、完了したランまたは2回のマージされた繰り返し実行で合計250,000顆粒の50%を占めると仮定しても、グラフィックジオメトリS.D.と決定された分布の平均は、総カウントの半分の無傷の顆粒によって固定されているため、大きな影響を受けなかったでしょう。さらに、損傷または壊れた顆粒の体積サイズの減少が大きいほど、分布への影響は少なくなります。これは、小さな顆粒の方が大きな割合を占めるが、合計サイズの顆粒の体積割合が小さいためです。図2の同じ平均分布の数と体積累積分布の比較で示すように、等価球径が9.967μm以下のデンプン顆粒は、総数の約48.53%を占めましたが、総体積の5.854%に過ぎません。したがって、10 μm未満の損傷または分解された顆粒は、微分体積率のサイズ分布に非常に小さな影響を与えます。他のプラントソースのデンプンサンプルの場合、サイジング分析の適切な合計カウントは、 試行で表示されるサイズ分布のグラフィック幾何平均()が大きく変化しなくなった最小数を2倍にします。
技術的には、サイジング実行のための最も重要なステップは、デンプン-電解質懸濁液のための5〜8%の公称濃度の最適範囲の電解質にデンプンメタノール懸濁液の適切な量をドロップすることです。目標を達成するためには、澱粉・メタノール懸濁液の滴下サイズと濃度を試行実行で調整する必要があります。最適な範囲よりも高いデンプン電解質懸濁液の濃度は、サイジング精度の低下のリスクを高め、頻繁な開口閉塞が中絶を実行し、実行を完了することが非常に困難になる可能性があります。しかし、濃度が低すぎる(例: <2%)デンプン電解質懸濁液の実行を長くし過ぎる可能性があり、顆粒の非ランダムサンプリングのために様々なサイズのビンの顆粒の周波数を歪め、許容できない誤差率(平均CV > 5%)反復分析の場合。サイジング実行の合計数は、デンプン-電解質懸濁液の最適濃度にも大きな影響を与え、したがって、添加されるデンプンメタノールの量と濃度に大きな影響を与えます。実行の合計数が大きいほど、実行の完了に必要な時間が長くなり、中絶を実行するアパーチャ閉塞のリスクが高くなります。小さなサイズのデンプン顆粒に小さな直径の開口管を使用すると、凝集による絞り閉塞の問題が悪化し、小さなデンプン顆粒(<2μm)の分析が非常に困難になります。これは確かに手順の主な欠点または制限です。開口閉塞の問題は、ある程度技術的な手段を用いて緩和することができる。1つは、デンプンメタノールサスペンションの凝集物(必然的により損傷した顆粒も同様に)を分解するために、より多くの超音波処理を使用し、および/または2〜5%の名目濃度で希釈デンプン電解質懸濁液を使用することができます。あるいは、安定した s*の最小合計カウントと 、同じデンプン電解質懸濁液からデンプンタイプ(例えばサツマイモ澱粉の約125,000カウント)のサイズ分布の技術的な繰り返し実行を使用し、繰り返し実行の結果をマージすることができます。 図1 に示す4つの複製分布(S1a、S1b、S2aおよびS2b)のそれぞれは、同じデンプン電解質懸濁液からそれぞれ125,000顆粒をサイジングする2つのマージされた技術的な繰り返しランからであった。どちらの方法も、レプリケーションエラー率を許容できないレベル(平均CV>5%)に上げる可能性があるため、十分にテストする必要があります。
同様の生理学的条件下での植物源からのデンプンサンプルの技術的および生物学的複製サイジング分析は、決定された平均顆粒サイズ分布の再現性と精度を向上させます。実際には、デンプンサンプルの3つまたは4つの生物学的複製は、特定の条件下で同じ組織から独立して抽出され得る。しかし、以前は 、4つの生物学的複製(すなわち、1つのサイジングx 1つの懸濁液x 4抽出物)の分布から得られる平均顆粒サイズ分布と、2つの生物学的複製(すなわち、1つのサイジングx 2のスターチ・メタノール・メタノールx2抽出物)からの誤差率およびs*の間に有意な差がないことを発見した。したがって、生物学的複製サンプルは、少なくともサツマイモのデンプンのために、2に減らすことができる。変更または調整できるその他のステップおよび技術的パラメータは、手順の各ステップまたは特定のパラメータの下に特に記載されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もない
Acknowledgments
この研究の一部は、農業大学総合農業研究センターと農業・人間科学部総合食料安全保障研究センター、プレーリービューA&M大学によって支えられている。私たちは、彼の技術サポートのために華天に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
