Summary
Presentert her er en prosedyre for reproduserbare og statistisk gyldige bestemmelser av stivelse granulat størrelse distribusjoner, og for å spesifisere de bestemte granulat lognormal størrelse distribusjoner ved hjelp av en to-parameter multiplikativ form. Det gjelder for alle granulatstørrelsesanalyser av gramskala stivelsesprøver for plante- og matvitenskapsforskning.
Abstract
Stivelse fra alle plantekilder består av granulat i en rekke størrelser og former som har forskjellige forekomstfrekvenser, det vil vil at den viser en størrelse og en formfordeling. Stivelse granulat størrelse data bestemmes ved hjelp av flere typer partikkelstørrelse teknikker er ofte problematisk på grunn av dårlig reproduserbarhet eller mangel på statistisk signifikans som følge av noen uoverstigelige systematiske feil, inkludert følsomhet for granulat former og grenser for granulat-utvalgstørrelser. Vi skisserte en prosedyre for reproduserbare og statistisk gyldige bestemmelser av stivelsesgranulatstørrelsesfordelinger ved hjelp av den elektriske sensing soneteknikken, og for å spesifisere de bestemte granulat lognormale størrelsesfordelingene ved hjelp av en vedtatt toparametermultiplikativ form med forbedret nøyaktighet og sammenlignbarhet. Det gjelder for alle granulatstørrelsesanalyser av gramskala stivelsesprøver, og kan derfor legge til rette for studier på hvordan stivelsesgranulatstørrelser er formet av stivelsesbiosynteseapparatet og mekanismene; og hvordan de påvirker egenskaper og funksjonalitet av stivelser for mat og industriell bruk. Representative resultater presenteres fra replikere analyser av granulatstørrelsesfordelinger av sweetpotato-stivelsesprøver ved hjelp av den skisserte prosedyren. Vi diskuterte videre flere viktige tekniske aspekter ved prosedyren, spesielt multiplikativ spesifikasjon av granul lognormal størrelse distribusjoner og noen tekniske midler for å overvinne hyppig blenderåpning blokkering av granulat aggregater.
Introduction
Stivelse granulat er den fysiske strukturen der to viktigste reserve homoglucan polymerer i plante fotosyntese og lagring vev, lineær eller tynt forgrenet amylose og svært forgrenet amylopectin, er ryddig pakket sammen med noen mindre komponenter, inkludert lipider og proteiner. Stivelse granulat fra ulike plantearter viser mange tredimensjonale (3D) former (anmeldt i ref.1,2), inkludert kuler, ellipsoider, polyhedroner, blodplater, terninger, cuboids, og uregelmessige tubuli. Selv de fra samme vev eller forskjellige vev av samme plantearter kan ha et sett med former med varierende forekomstfrekvenser. Med andre ord, stivelse granulat fra en planteart kan ha en karakteristisk statistisk formfordeling, snarere enn en bestemt form. De ikke-ensartede og ikke-sfæriske granulatformene gjør det vanskelig å måle og definere stivelsesgranulatstørrelser. I tillegg er stivelse granulat fra samme vev av en planteart av en rekke størrelser med forskjellige proporsjoner, det vil vil at viser en karakteristisk størrelsesfordeling. Denne størrelsesfordelingen kompliserer analysen og beskrivelsen av stivelsesgranulatstørrelser.
Stivelse granulat størrelser har blitt analysert ved hjelp av flere kategorier av partikkelstørrelse teknikker (gjennomgått i ref.3),inkludert mikroskopi, sedimentering / sterisk felt-flow fraksjonering (Sd / StFFF), laser diffraksjon og elektrisk sensing sone (ESZ). Imidlertid er disse teknikkene ikke like egnet for bestemmelse av stivelse granulat størrelser i nærvær av en granulat form og en størrelsesfordeling. Mikroskopi, inkludert lys, konfokal og skanning elektron mikroskopi, er utmerket for studier av morfologi4,5,6,7, struktur8,9 og utvikling10,11 av stivelse granulat, men neppe egnet for å definere sine størrelsesfordelinger på grunn av noen iboende mangler. Direkte målinger av mikroskopiske granulatbilder eller programvareassistert bildeanalyse av optiske mikroskopidata (IAOM), som har blitt brukt til bestemmelse av granulatstørrelser av stivelse fra flere arter, inkludert mais12,hvete13,14,potet15 og bygg16, kan måle bare 1D (vanligvis maksimal lengde) eller 2D (overflateareal) størrelser av svært begrensede tall (titusenvis) av stivelse granulat bilder. De små granulatprøvestørrelsene som er iboende begrenset av teknikkene, kan sjelden være statistisk representative, med tanke på de enorme granulattallene per enhetsvekt av stivelse (~ 120 x 106 per gram, forutsatt at alle 10 μm sfærer på 1,5 g / cm³ tetthet), og derfor kan føre til dårlig reproduserbarhet av resultatene. Sd/StFFF-teknikken kan ha høy hastighet og oppløsning, og smale størrelsesfraksjoner av stivelsesgranulat17, men har sjelden blitt brukt sannsynligvis fordi nøyaktigheten kan bli alvorlig påvirket av skader, forskjellige former og tetthet av stivelsesgranulat. Laserdiffraksjonsteknikken er den mest brukte, og har blitt brukt på stivelse granulat størrelse analyser for alle store avlingsarter3,14,16. Selv om teknikken har mange fordeler, er den faktisk ikke egnet for bestemmelser av stivelse granulat størrelser i nærvær av en granulat form distribusjon. De fleste av de samtidige laserdiffraksjonsinstrumentene er avhengige av Mie lysspøpendeteori 18 for ensartede sfæriske partikler og den modifiserte Mie-teorien18 for noen andre former for ensartethet. Teknikken er derfor iboende svært følsom for partikkelformer, og ikke helt egnet selv for visse former for ensartethet19, enn si for stivelse granulat som har et sett med former av varierende proporsjoner. ESZ-teknikken måler den elektriske feltforstyrrelsen proporsjonal med volumet av partikkelen som passerer gjennom en blenderåpning. Det gir granulat volumstørrelser, samt nummer- og volumdistribusjonsinformasjon, etc., ved høye oppløsninger. Siden ESZ-teknikken er uavhengig av optiske egenskaper av partikler, inkludert farge, form, sammensetning eller brytningsindeks, og resultatene er svært reproduserbare, er det spesielt egnet for å bestemme størrelsesfordelinger av stivelsesgranulat som har et sett med former.
Stivelse granulat størrelser har også blitt definert ved hjelp av mange parametere. De ble ofte simplistically beskrevet av gjennomsnittlige diametre, som i noen tilfeller var aritmetiske midler av mikroskopisk målte maksimale lengder på 2D-bilder12,20,eller gjennomsnitt av tilsvarende sfærediameter3. I andre tilfeller ble granulatstørrelsesfordelingene spesifisert ved hjelp av størrelsesområder21,22, fordelingens gjennomsnittlige volum eller gjennomsnittlig diameter (sfæreekvivalent, vektet etter antall, volum eller overflateareal) forutsatt en normalfordeling 14,23,24,25,26. Disse beskrivelsene av stivelse granulat størrelser fra ulike analyser er av svært forskjellig natur, og ikke strengt sammenlignbare. Det kan være svært misvisende hvis disse "størrelsene" av stivelse granulat fra forskjellige arter eller til og med samme vev av samme art ble direkte sammenlignet. Videre har spredningsparameteren (eller formen) for de antatte normale distribusjonene, det vil at standardavviket σ (eller grafisk standardavvik σg) som måler bredden på fordelingen (det vil at spredningen av størrelsene) har blitt ignorert i de fleste studier.
For å løse de nevnte kritiske problemene som stivelsesgranulatanalyser står overfor, skisserte vi en prosedyre for reproduserbare og statistisk gyldige bestemmelser av granulatstørrelsesfordelinger av stivelsesprøver ved hjelp av ESZ-teknikken, og for riktig angir de bestemte granul lognormale størrelsesfordelingene ved hjelp av en vedtatt toparametermultiplikativ form27 med forbedret nøyaktighet og sammenlignbarhet. For validering og demonstrasjon utførte vi replikere granulatstørrelsesanalyser av sweetpotato-stivelsesprøver ved hjelp av prosedyren, og spesifiserte lognormal differensialvolum-prosent volum-ekvivalent-sfære diameter fordelinger ved hjelp av sine grafiske geometriske 
midler og multiplikative standardavvik s* i en x/ (multiplisere og dele) s* form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av stivelsesprøver
- Forbered to (eller tre) gram-skala replikere stivelsesprøver fra stivelsesoppsamler vev av ulike plantearter etter de etablerte prosedyrene (f.eks poteter15, søtpotatoer28, hvetekorn13,29og maiskjerner30, etc.).
- Vask stivelsesprøver grundig med aceton eller toluen 3-4x for å minimere granulataggregater og tørke dem helt.
MERK: Bruk ekstraksjonsprosedyrer som gir mer enn 1 g stivelse per tilberedning. En eller to 0,5-g aliquots fra hver av de tre eller to replikere ekstrakter, henholdsvis, er samplet for granulat størrelse analyse av en stivelse ekstrakt.
2. Elektrolytt forberedelse
- Forbered 500 ml 50 g/ L litiumklorid i metanol for fire størrelseskjøringer for replikeringsstivelsesprøver (100 ml per kjøring pluss en ekstra 100 ml). Fortrinnsvis, gjør elektrolytten i store volumpartier, for eksempel 4 til 8 L om gangen, for å minimere konsentrasjonsvariasjonen.
- Avkjøl beholderen på is eller i et 4 °C-skap for å øke oppløsningen av litiumkloridet.
3. Sette opp analysatoren
- Velg et blenderåpningsrør med et partikkeldiameterområde som dekker det kjente (i litteraturen eller gjennom prøvekjøringer) granulatstørrelsesområde av stivelsesprøver som skal analyseres, for eksempel en 100 μm blenderåpning for sweetpotato stivelse. For stivelsesprøver av ukjent granulatstørrelsesområde velger du en passende blenderåpning gjennom prøvekjøringer ved hjelp av flere blenderåpningsrør med overlappende partikkeldiameterområder.
MERK: Partikkeldiameterområdet til et blenderåpningsrør er det nøyaktige størrelsesområdet mellom 2 og 60 % av, og med et utvidet størrelsesområde til 80 % av åpningens diameter. Tabell 1 viser egenskaper for tre mest nyttige blenderåpningsrør for størrelse granulat av store avlingssåre. Hvis granulatstørrelsesområdet til en stivelsesprøve er bredere enn størrelsesområdet til et enkelt blenderåpningsrør, utfører du en multi-tube overlappingsanalyse som kombinerer opptil fem partikkelstørrelsesfordeler målt med blenderåpninger av forskjellige størrelser. Hver blenderåpning er identifiserbar med diameter og delenummer merket på røret. Diameteren og serienummeret i en strekkode på røret kan skannes inn i analysatorprogramvaren ved hjelp av strekkodeleseren på kontrollpanelet på analysatoren. - Valgte et 100 eller 200 ml analytisk beger (over cuvettes) for bestemmelse av stivelse granulat størrelser, og sette opp automatisk omrøring (nedenfor) for å opprettholde en god granulat suspensjon under måling.
- Opprett en standard driftsmetode (SOM) for å angi kjøreinnstillinger og en Innstillingsfil for analyse, visning og utskrift av resultatene. Kombiner SOM- og Preferences-filen i en SOP (Standard Operating Procedure) etter behov.
MERK: For analyser som ikke kan standardiseres, bruk SOM til å kjøre analysene, og juster SOM-innstillingene mellom kjøringer gjennom Rediger SOM-vinduet (se nedenfor) etter behov. Når du har fullført, analyserer, viser og skriver ut kjøreresultatene ved å endre innstillingene etter ønske. For standardiserbare granulatanalyser, bruk en SOP til å kjøre analysene.- Start analysatorprogramvaren. Klikk SOP-| Opprett SOM-veiviser eller Rediger SOM, eller klikk Rediger SOM i Status-panelet. Bruk veiviseren eller Vinduet Rediger SOM til å velge innstillinger for en SOM. Innstillinger som vanligvis brukes til å endre størrelse på granulat av sweetpotato stivelsesprøver, oppsummeres i tabell 2.
- Lagre den opprettede SOM i en fil i vinduet Som Wizard-Summary of Settings, eller i vinduet Rediger SOM.
- Klikk SOP-| Opprett innstillingsveiviser eller Rediger innstillinger. Bruk veiviseren eller fanene i redigeringsvinduet Innstillinger til å velge innstillingsinnstillinger som de i tabell 3 eller andre etter ønske.
- Lagre de valgte innstillingene i en fil i vinduet Opprett innstillinger-sammendrag av innstillinger eller i vinduet Rediger innstillinger.
- Klikk SOP-| Opprett SOP-veiviser. Etter den trinnvise veiledningen for veiviseren angir du en beskrivelse, velger filen SOM og Innstillinger for å opprette og lagre en SOP.
4. Granul størrelsesanalyser av stivelsesprøvene
- Klargjøre analysatoren
- Slå på analysatoren, åpne programvaren på datamaskinen og kontroller Klar-statusen øverst i statuspanelet etter den automatiske tilkoblingen til analysatoren.
- Fyll elektrolyttkannen med elektrolytt, tøm avfallskannen om nødvendig.
- Installer og fest det valgte blenderrøret på riktig måte i brukerhåndboken. For et ukalibrerert nytt blenderåpningsrør kalibrerer du det etter den trinnvise veiledningen under Kalibrerings- | Kalibrer blenderåpningen på hovedmenyen. For et kalibrert blenderåpningsrør må du kontrollere kalibreringen etter den trinnvise veiledningen for veiviseren for endre blenderåpning under | Kontroller blenderkalibrering på hovedmenyen.
- Lås opp analyseplattformen ved å skyve låseutløserklemmen (på midt foran på venstre prøveromvegg) og senk plattformen manuelt ned til bunnen. Plasser et analytisk beger som inneholder 100 ml elektrolytt på plattformen, flytt røreren til omrøringsposisjonen, og løft plattformen manuelt til den selvlåsende øvre posisjonen for å senke blenderrøret og røreren i elektrolytten.
- Klikk Fyll på verktøylinjen nederst på instrumentet for å få analysatoren automatisk til å fylle systemet med elektrolytten, og klikk På flush for å få analysatoren automatisk til å tømme systemet.
- Last inn SOM ved å klikke sop | last inn en SOM på hovedmenyen, og bruk SOM til å kjøre en analyse uten en Preferences fil. Du kan også laste inn en SOP ved å klikke SOP-| Last inn en SOP på hovedmenyen eller Last inn SOP i statuspanelet, og bruk SOP til å kjøre en analyse.
- Hvis du bruker en SOP, klikker du på SOP | som info eller innstillingsinformasjon på hovedmenyen for å bekrefte innstillingene for SOM og Innstillinger. Klikk eksempel | Angi eksempelinformasjon på hovedmenyen eller Rediger informasjon i statuspanelet for å angi eksempelinformasjonen for kjøringen.
- Forbered stivelse-metanol prøve og størrelse suspensjoner
- Vei to eller en 0,5 g prøve fra hver av de to eller tre replikere stivelseekstrakter, henholdsvis.
- Legg hver av de 0,5 g stivelse aliquots til 5 ml metanol i en 50 ml konisk sentrifuge rør, og fullt spre stivelse granulat ved hjelp av flere pulser av lav intensitet ultralyd (12-24 W / cm2) fra en ultralydprosessor.
- Bruk en engangsoverføringspipette til å bruke en liten dråpe stivelse-metanolfjæring (~ 0,2 ml) på 100 ml 50 g/ L LiCl metanolelektrolytt under konstant omrøring i begeret. Lukk døren til prøverommet.
- Utføre en skaleringskjøring
- Klikk forhåndsvisning på den nederste instrumentverktøylinjen for å starte en forhåndsvisningskjøring. På statuspanelet må du kontrollere at den dynamisk viste konsentrasjonsstangen er grønn, og viser et 5 til 8 % nominell konsentrasjonsområde for suspensjonen.
- Klikk Stopp på den nederste verktøylinjen for å stoppe forhåndsvisningskjøringen. Om nødvendig fortynne stivelseselektrolyttfjæringen ved å erstatte en aliquot av suspensjonen med elektrolytten, og gjenta deretter en forhåndsvisningskjøring.
MERK: Suspensjonens 5 % til 8 % nominelle konsentrasjonsområde er avgjørende for fullføring av en løpetur uten stans på grunn av blenderåpningsblokkering ved aggregert granulat. Juster om nødvendig dråpeprøvestørrelsen og/eller konsentrasjonen av stivelses-metanolsuspensjonen for å lage en ny stivelseselelektrolyttsuspensjon som har den nominelle konsentrasjonen i det optimale området. - Etter bekreftelsen klikker du på Start på den nederste verktøylinjen for å starte kjøringen. Analysatoren fullfører automatisk kjøringen når det totale antallet granulatstørrelser, som vises sammen med kjøretiden på statuspanelet i en kjøring, når det angitte antallet (125 000 eller 250 000) av kontrollmodusen til SOM. Avhengig av suspensjonskonsentrasjonen (innenfor 5-8% rekkevidde eller lavere), tar et enkelt løp 2 til 5 min eller mer.
MERK: Når analysatoren automatisk oppdager en blenderåpningsblokkering per blokkeringsdeteksjonsinnstillinger for SOM, vil den avbryte kjøringen, tømme for å oppheve blokkeringen og starte en ny kjøring. Denne blokkeringshandlingen er satt til å gjentas maksimalt i fire ganger før analysatoren avbryter kjøringsoperasjonen. Dette kjøreavbruddsproblemet kan overvinnes ved hjelp av to tekniske metoder som nevnt i tabell 2 og beskrevet i diskusjonen. - Utfør om nødvendig en teknisk repetisjonskjøring (se Tabell 2 og detaljert i Diskusjon) ved hjelp av samme stivelseselelektrolyttsuspensjon ved ganske enkelt å klikke start eller gjenta på den nederste verktøylinjen.
- Etter ferdigstillelse av en løpetur eller gjenta løp, tøm begeret, skyll det med metanol og fyll det på med 100 ml frisk elektrolyttløsning for neste løp.
- Hvis en dialogboks for utvidet størrelsesområde vises når antall granulater som er større enn 60 μm, overskrider 0,1 % av det totale antallet (i henhold til SOM-innstillingen), klikker du Kjør 60 % til 80 % for å kjøre et utvidet dynamisk størrelsesområde til 80 % av blenderdiameteren.
MERK: Innstillingen Utvidet størrelsesområde kontrollerer handlinger for granulater som er større enn 60 % av blenderåpningsdiameteren (100 μm, i dette tilfellet). Innstillingen i SOM spesifiserer inkludering av stivelse granulat større enn 60 μm når deres teller nå over 0,1% av den totale tellingen. Fullføringen av løpet styres fortsatt av det totale antallet, og kan ta litt kortere tid enn ellers uten å inkludere de større granulatene på mindre enn 0,1% (antatt statisk ubetydelig beløp) av det totale antallet.
- Analysere kjøreresultatene
- Hvis en SOM ble brukt til å kontrollere kjøringene, velger du Innstillinger etter ønske for visning, utskrift og statistiske analyser av resultatene ved hjelp av veiviseren opprett innstillinger eller Redigeringsinnstillinger under SOP på hovedmenyen.
- Overlegg resultater fra flere kjøringer på en enkelt graf for sammenligning.
- Klikk Overlegg på hovedverktøylinjen eller filoppsettet | Overlegg på hovedmenyen for å få tilgang til overleggsvinduet. Naviger til og velg flere ønskede resultatfiler i Filer-boksen, klikk Legg til for å flytte dem til Valgte filer-boksen, og klikk OK for å legge de valgte resultatene på en enkelt graf.
- Hvis du vil legge til en fil i et åpent overlegg, klikker du Kjør | Åpne for Overlegg på Kjør-menyen for å få tilgang til Overlegg-vinduet, naviger til ønsket fil og klikk for å legge til.
- Gjennomsnittlige resultater fra replikere analyser (2 utdrag x 2 stivelsesprøvetaking eller 3 ekstrakter x 1 stivelsesprøvetaking), og se eller skrive ut gjennomsnittlig granulatstørrelsesfordeling og statistikk i en liste eller graf.
- Klikk Fil på Filverktøy-|-menyen | Gjennomsnitt for å åpne Gjennomsnitt-vinduet. Naviger til og velg flere ønskede resultatfiler i Filer-boksen, klikk Legg til for å flytte dem til Valgte filer-boksen, og klikk OK for å gjennomsnittlig de valgte resultatene og vise gjennomsnittet på en enkelt graf.
- Hvis du vil inkludere en ekstra resultatfil i en gjennomsnittlig distribusjon, klikker du Kjørfil | Åpne og Legg til i gjennomsnitt på Kjør-menyen for å åpne vinduet Legg til i gjennomsnitt, navigere til og legge til filen. Det nye gjennomsnittet vises i diagrammet i vinduet Kjør (resultat) eller oppføring.
5. Angi gjennomsnittlig fordeling
- Klikk Beregn | Gjennomsnittlig statistikk på Kjør-menyen for å åpne statistikksammendragsvinduet, som viser gjennomsnittsstatistikken i rader, og grafstatistikken for den gjennomsnittlige fordelingen i kolonnene.
- Bruk den grafiske geometriske gjennomsnittet (
) og SD(er*) i grafstatistikkkolonnen for å angi gjennomsnittlig fordeling i x/ s* -skjemaet. Beregn CV-målevariantene blant de gjennomsnittlige replikeringsfordelene ved å dele gjennomsnittet (μ, det samme som for den gjennomsnittlige fordelingen) av de geometriske måtene for de gjennomsnittlige distribusjonene med gjennomsnittlig SD (σ) oppført i den gjennomsnittlige statistikkraden.
MERK: Den gjennomsnittlige SD (for μ) som vurderer variasjoner blant midler til replikeringsfordelene, er forskjellig fra den grafiske geometriske SD (for ) som måler spredningen av den gjennomsnittlige fordelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere prosedyren, og demonstrere reproduserbarhet av den bestemte granulstørrelsesfordelingen, utførte vi replikere størrelsesanalyser av sweetpotato stivelsesprøver. Vi utarbeidet replikere (S1 og S2) stivelsesprøver fra feltdyrkede sweetpotatoes av en avlslinje SC1149-19 i en lignende utviklingsalder ved hjelp av en tidligere beskrevet prosedyre28. Fra hvert stivelsesekstrakt ble to 0,5 g aliquots (a og b) samplet, suspendert i 5 ml metanol og sonikert med flere pulser med lavenergi ultralyd for å bryte opp aggregater. Hver av de to par stivelse-metanol suspensjoner ble drop-samplet for å lage en stivelse-elektrolytt suspensjon, som deretter ble størrelse to ganger (tekniske gjenta kjører) ved hjelp av ovennevnte skissert SOM for en total telling på 125.000 granulat hver. For hver enkelt størrelseskjøring, når det totale antallet når over ~ 65 000 og ~ 125 000, endres ikke den grafiske geometriske SD(e*) og geometriske gjennomsnittet ( ) av den viste differensialvolumstørrelsesfordelingen ikke lenger betydelig. Hvert par av repetisjonsløpene ved hjelp av en stivelse-metanol suspensjon ble slått sammen etter ferdigstillelse for en total størrelse antall på 250.000.
Figur 1 viser differensialvolum-prosent volum-ekvivalent-sfære-diameter distribusjoner (S1a, S1b, S2a og S2b) for de fire replikere størrelsesanalyser av sweetpotato stivelse prøver, og deres gjennomsnittlige distribusjon. CVen for gjennomsnittet av geometriske midler for de fire replikere distribusjonene var 3,75 %, noe som viste en utmerket reproduserbarhet av størrelsesresultatene. Hver av de fire replikere distribusjonene ble bestemt fra en svært stor samplingsstørrelse på 250 000 granulat, langt over de minimale tellingene (~ 65 000 og ~ 125 000) over hvilken den grafiske geometriske SD(s*) og geometrisk gjennomsnitt ( ) av den viste differensialvolumstørrelsesfordelingen i en enkelt størrelseskjøring ikke lenger endres betydelig. Derfor var de bestemte replikeringsdistribusjonene for volumstørrelse alle statistisk gyldige. For bedre nøyaktighet og sammenlignbarhet (diskutert nedenfor) av spesifikasjonen av bestemte lognormal granulat størrelse distribusjoner, alle disse distribusjonene ble spesifisert ved hjelp av sine grafiske geometriske midler ( ) og SD(er*) i en x/ (multiplisere og dele) s* form som oppført på grafen. Vær oppmerksom på at granulatstørrelsesfordelingen av sweetpotato-stivelsen er nøye montert for å være lognormal som tidligere beskrevet28.
Figur 1: Lognormal differensialvolum-prosent volum-ekvivalent-sfære størrelse distribusjoner fra replikere størrelsesanalyser av sweetpotato stivelse prøver. Prøvetakingsordningen for de fire replikeringsanalysene ble beskrevet i resultatet. De fire distribusjonene (S1a, S1b, S2a og S2b) fra replikere analyser og deres gjennomsnitt ble lagt over og spesifisert ved hjelp av x/ (multiplisere og dividere) s* form. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 viser de gjennomsnittlige (eller gjennomsnittlige) kumulative (<) tall- og volumprosentstørrelsesfordelingene for de fire replikeringsanalysene, som var transformasjonsvisninger av den gjennomsnittlige differensialvolumprosentstørrelsesfordelingen. Sammenligningen mellom det kumulative antallet og volumprosenten av stivelsesgranulat viste at granulat med mindre volumekvivalente sfærediameter utgjorde mye større prosentandeler av det totale antallet enn det totale volumet. For eksempel utgjorde antall granulater med volumekvivalente sfærediameter mindre eller lik 9,976 μm 48,53% av det totale antallet, men bare 5,854% av det totale volumet.
Figur 2: Gjennomsnittlig kumulativ (<) tall- og volumprosentstørrelsesfordelinger av stivelsesgranulat fra de fire replikere størrelsesanalysene av sweetpotato-stivelsesprøver. De to distribusjonene er transformasjonsvisninger av den gjennomsnittlige størrelsesfordelingen i figur 1. Grafen sammenligner det kumulative (<) tallet (venstre Y-akse) med volumprosenter (høyre Y-akse) av stivelsesgranulat som har volumekvivalente sfærestørrelser lavere eller lik bestemte størrelseshyller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Blenderåpning diameter (μm) | Området med partikkeldiameter (μm) | Område for partikkelvolum (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 til 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 til 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 til 268 x 103 |
Tabell 1: Tre mest nyttige blenderåpningsrør for størrelse granulat av stivelse fra avlingsarter.
| SOM-innstillinger | Utvalg | |
| Beskrivelse | SOM beskrivelse | Størrelse Stivelse Granulat |
| SOM forfatter | - | |
| Eksempel beskrivelse | Sweetpotato stivelse prøver | |
| Elektrolytt | 50 g L-1 litiumklorid | |
| Dispergeringsmiddel | Nei | |
| Blenderåpning | 100 μm | |
| Kontrollmodus | Kontrollmodus | Totalt antall [250 000] eller [125 000]a |
| Avfall Tank | Når 80% full | |
| Kjør innstillinger | Angi eksempelinformasjon | Ja |
| Antall kjøringer | 1 (eller 2, for gjentatte kjøringer) | |
| Skyll blenderåpningsrøret før kjøring | Ja | |
| Skyll blenderåpningsrøret etter kjøring | Ja | |
| Lagre fil | Ja, inkludert pulsdata | |
| Eksportere data | Ja | |
| Skrive ut rapport | Ja | |
| Sammenlign med eksempelspesifikasjoner | Nei | |
| Vise | Størrelse | |
| Innstillinger for rører | Eksempel beger | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Bruk rørerører | Ja | |
| Hastighet | [15], CW (klokkeklok) | |
| Rørerposisjon | Automatisk | |
| Terskel, gjeldende og forsterkning | Størrelse terskel | 2 μm |
| Blenderstrøm | 1600 mA | |
| Forskuddsinnskuddsgevinst | 2 | |
| Utvidet størrelsesområde b | Når antall [> 0,1%] av totalt antall | |
| Innstillinger for puls til størrelse | Størrelse hyller | 400 |
| Størrelsesområde | 2 til 60 μm | |
| Avstand for hyller | Logg diameter | |
| Tilfeldighet korreksjon | Ja | |
| Puls Rediger | Nei | |
| Konsentrasjon | Eksempel på beløp | 0,2 ml |
| Tetthet | - | |
| Bruk fortynningsfaktor | - | |
| Analytisk volum | - | |
| Elektrolyttvolum | 100 ml | |
| Bruk fortynningsfaktor | Nei | |
| Blokkering | Blokkeringsdeteksjon | Automatisk (Fra starten av kjøring) |
| Standard blokkeringsgjenkjenning: Når tellefrekvens <20 %, Blenderfrekvens >40 % eller konsentrasjonspigger >40 %. | ||
| Blokkeringshandling | Avbryt, fjern blokkeringen og start på nytt,Opptil [4] ganger | |
| Vis-ikon | Ja | |
| Blokkeringsmonitor | Telle rate | |
| a: Hvis gjentatt unblock og omstart ikke kunne få større telling kjøre fullført, gjør to gjentatte kjøringer av størrelse en lavere total telling på 125.000 hver fra samme stivelse-elektrolytt suspensjon, og slå sammen resultatene av gjenta kjørene ved hjelp av [MergeRuns] under [FileTools] av [File] i hovedmenyen. Alternativt kan du erstatte stivelseselektrolyttfjæringen med en ny som har en lavere nominell konsentrasjon (2-5%). Når du forbereder en ny drop-sample stivelse-elektrolytt suspensjon, puls-sonicate stivelse-metanol suspensjon igjen for å bryte opp flere aggregater. | ||
| b: Utvidet størrelsesområde kontrollerer handlinger for granulater som er større enn 60 % av blenderåpningdiameteren (100 μm i denne SOM). Innstillingen angir inkludering av stivelse granulat større enn 60 μm når deres teller er større enn 0,1% av den totale tellingen. | ||
Tabell 2: Typiske SOM-innstillinger for å kontrollere størrelseskjøringer for sweetpotato-stivelsesprøver.
| Innstillinger for innstillinger | Utvalg | |
| Utskrevne rapporter | Eksempel på informasjon | Eksempel, Kjør nummer, Størrelseshyller, Totalt antall |
| Størrelse grafer | Differensialvolum %, Logg X-akse, Glatt etter grupper på syv | |
| Størrelse statistikk | Volum, Volum % | |
| Gjennomsnittlig statistikk | Totalt beløp, mener, S.D. | |
| Overlegg statistikk | Totalt beløp, mener, S.D. | |
| Oppføringen | Kolonner: Hyllenummer, Hyllediameter (midten), Diff. Nummer, Diff. Nummer %, Diff. Volum %. | |
| Hyllegruppering: Hyllegruppe størrelse 7, Alle hyller, Summer i gruppe. | ||
| Statistikk | Type | Geometrisken |
| Området | Alle | |
| Resultater som skal skrives ut | Område, Totalt beløp, Gjennomsnitt, S.D., 95% Konfidensgrenser | |
| Resultater på grafen | Rekkevidde: Alt, Totalt beløp, Gjennomsnitt, S.D. | |
| Snitt og trend | Gjennomsnittlig vektingb | Volum % |
| Distribusjonc | Differensial | |
| Grenser | 2 S.D. | |
| Puls snitt | Bruk Konverter pulser til størrelsesområde | |
| Eksportere | Dataelementer | Eksempelinformasjon, Statistikk, Gjennomsnittsstatistikk, Størrelsesoppføring |
| Eksporter utvidelse | .xls | |
| Tallformat | 123456.78 | |
| Dataformat | Tabulatordelt | |
| Eksportere mappe | Gjeldende mappe | |
| Utskriftsformat | Inkluder egendefinert tittel, skriv ut grafer ved hjelp av skjermfarge inkluder dato | |
| Graf størrelse: | Halv side | |
| Alternativ for graf | Vise: | Skjerm- og fargeskriver |
| Linjefarge | (Standard) | |
| Linjestil | (Standard) | |
| Legenden | Øverst til høyre | |
| Størrelse | (Standard) | |
| Graf stil | Trinn | |
| Begrens stil | Kurve | |
| Skrifter og farger | Standardskrifter og standardfarger eller etter ønske. | |
| Vis alternativer | Standardvisning | Størrelse, Graf |
| Størrelse X-akse | Diameter | |
| Måle | Partikler | |
| Liter Symbol | L (ml, μL, ml) | |
| Pulsdata for multisizer | Graf på de fleste 5010 pulser, Liste på det meste 5010 pulser | |
| Volumenheter | μm3 | |
| Numre | 123456.78 | |
| a: Den geometriske gjennomsnitt og SD-statistikken som er angitt her er grafiske som definerer skalaen og formen på den bestemte differensialvolum-prosent ekvivalent-sfære størrelsesfordelingen. De brukes til å angi lognormal distribusjon i x ̅ * x / s * skjema. | ||
| b: Gjennomsnittlig vekting refererer til hvordan resultater fra flere kjøringer er i gjennomsnitt av ulike vektingsalternativer. Endre disse innstillingene i Kjør-menyen for ulike snitt- og visningsalternativer. | ||
| c: Velg [Beregn] for å åpne [ Gjennomsnittlig statistikk] i [Kjør-menyen] for å se den gjennomsnittlige statistikken i rader, grafstatistikken for den gjennomsnittlige fordelingen i "Gjennomsnitt" -kolonnen. | ||
Tabell 3: Typiske preferanseinnstillinger for visning, analyser og utskrift av resultater fra størrelseskjøringer for sweetpotato-stivelsesprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den skisserte prosedyren har løst noen kritiske problemer i flere eksisterende metoder for stivelse granulat størrelse analyser, inkludert upassende 1D- eller 2D-størrelse av 3D-granulat, forvrengning av størrelsesmålinger på grunn av ingen ensartede granulatformer, dårlig reproduserbarhet og tvilsom statistisk gyldighet på grunn av begrensede granulatprøvestørrelser, unøyaktig eller feil spesifikasjon (spesielt bruk av gjennomsnittsstørrelsen) av granulatstørrelser i nærvær av både granulatform og ingen normale størrelsesfordelinger. Den bruker ESZ-teknikken som måler 3D-størrelser (volum) av stivelsesgranulat og ikke svarer på granulatformer. Utformingen for å utlede den gjennomsnittlige granulstørrelsesfordelingen fra replikere analyser som har en svært stor granulprøvestørrelse (4 x 250 000) gir ikke bare resultatet statistisk gyldig og mer reproduserbar, men reduserer også teknisk måleforvrengninger med aggregerte og skadede granulater for å forbedre størrelsesnøyaktigheten (forklart nedenfor). Som vist i de representative resultatene, er CVen for gjennomsnittet av geometriske midler for replikere distribusjoner bestemt ved hjelp av prosedyren vanligvis mindre enn 5%, noe som indikerer en tilfredsstillende reproduserbarhet av resultatene. Videre viser multiplikativ spesifikasjon av både skalaen ( ) og formen (e*) av lognormal granulvolum-ekvivalent-sfærestørrelsesfordeling mer nøyaktig den sanne natur distribuerte granulatstørrelser i en stivelsesprøve, og er grei å bruke og universelt sammenlignbar blant granulatstørrelsesanalyser av stivelse fra samme eller forskjellige kilder. Derfor muliggjør prosedyren mer nøyaktig, reproduserbar og statistisk gyldig bestemmelse av stivelsesgranulatstørrelser, og riktig spesifikasjon av bestemte granulat lognormale størrelsesfordelinger. Det gjelder for alle granulatstørrelsesanalyser av gramskala stivelsesprøver, og kan bli et viktig verktøy for studier på hvordan stivelsesgranulatdimensjoner er formet av stivelsesbiosynteseapparatet og mekanismer i plantestivelsesamkumulerende vev, og hvordan de påvirker egenskaper og funksjonalitet av stivelse for mat og industriell bruk.
Stivelse granulat er stereopartikler som for det meste ikke er sfæriske former, slik at størrelsene må defineres og måles i 3D-termer. Dermed definerer volumene av stivelsesgranulat best sine størrelser, og volumekvivalentsfærediameteren er den eneste enkelt 1D-størrelsesparameteren som kan brukes til å beskrive granulat3D-størrelsene på riktig måte, siden ingen andre stereoobjekter enn sfære kan defineres med en enkelt 1D-størrelsesparameter. Videre har stivelse granulat fra alle plantearter et sett med former med ulike forekomstfrekvenser. I nærvær av en slik formfordeling er alle partikkelstørrelsesteknikker som reagerer på partikkelformer, for eksempel laserdiffraksjonsteknikken, ikke egnet for reproduserbare og statistisk gyldige bestemmelser av stivelsesgranulatstørrelsesfordelinger, da systemfeilen som ligger i disse teknikkene ikke lett kan korrigeres med en formfaktor. Faktisk kan feilfrekvensen (CV) blant replikere analyser av granulatstørrelser fra samme sweetpotato stivelsesprøve ved hjelp av laserdiffraksjonsteknikken nå så høyt som 15-20%28, noe som indikerer svært dårlig reproduserbare størrelsesresultater. Dessverre har virkningen av granulatformer på størrelsesstivelsegranulat for det meste blitt oversett, noe som resulterte i en stor mengde tvilsomme stivelsesgranulatstørrelsesdata som er oppnådd ved hjelp av formresponsive partikkelstørrelsesteknikker i litteraturen.
Den toparametermultlikative spesifikasjonen definerer både skalaen ( ) og formen (e*) av lognormale distribusjoner, og er så langt mer presis og meningsfylt enn en enkelt beskrivelse av gjennomsnittlig størrelse eller et størrelsesområde26. Multiplikative x/ s*, x/ (s*)2, og x/ (s*)3 intervaller, 
tilsvarende ± s, ± 2s, og ± 3 sintervaller av en normal fordeling, dekker ca 68,3%, 95,5%, og 99,7% konfidensintervaller av en lognormal distribusjon,henholdsvis 27. Den geometriske gjennomsnitt ( ) og SD ( s* ) av en lognormal granulat størrelsesfordeling tilsvarer den grafiske geometriske gjennomsnitt og SD av størrelsesfordelingskurven, som beregnes av analysatorprogramvaren og kan velges for å vises på skjermstørrelsesgrafen under en størrelseskjøring eller analyser av resultater. Det er derfor ganske praktisk, og enkelt å bruke multiplikativ spesifikasjon. I tillegg har og s* vist seg å ha forskjellige fysiologiske implikasjoner forbundet med stivelsebiosynteseapparatet28. Granulatvolumstørrelsesfordelingene av stivelse fra ulike plantearter kan godt være alle lognormale siden dannelsen av stivelsesgranulat i plantestivelsesopphopning av vev faller inn i et uhemmet utviklende komplekst system31 eller et intracellulært katalytisk reaksjonsnettverk32 karakteristisk for en lognormal distribusjon. De bimodale granulatstørrelsesfordelingene av stivelse fra noen plantearter, som de frahvete 13,14, kan betraktes som to lognormale fordelinger. Derfor kan multiplikativ spesifikasjon av granulat lognormal volumekvivalent-sfære størrelsesfordelinger også tillate en statistisk gyldig universell sammenligning av granulatstørrelser bestemt fra stivelse av ulike plantekilder og ved ulike målinger, da det er i form av volumekvivalent sfærediameter og s* er demensionless.
En passende total granulstørrelsestelling for analyse av en stivelsesprøve (i metanol), som representerer granulatprøvestørrelsen, er mest kritisk til vellykket bestemmelse av granulatstørrelsesfordelingen av statistisk signifikans for stivelsesprøven. Når det gjelder sweetpotato-stivelsesprøver, når den totale tellingen i et enkelt løp når over ~ 65.000 og ~ 125.000, endres den grafiske geometriske SD (er* og geometrisk gjennomsnitt ( ) av den viste differensialvolumstørrelsesfordelingskurven ikke lenger betydelig, noe som indikerer minimale tellinger for s* og statistisk betydning. Prøvetakingsredundansen i størrelse 250.000 granulat for en stivelse-metanol prøve i prosedyren er ment å rabatt for aggregerte og skadede granulat i størrelse granulat bassenget. Selv forutsatt at de aggregerte og skadede eller ødelagte granulatene utgjorde 50% av det totale antallet på 250.000 granulat i en fullført kjøring eller to sammenslåtte repetisjoner, ville den grafiske geometriske SD og gjennomsnittet av den bestemte fordelingen ikke ha blitt betydelig påvirket da de ville ha blitt forankret av de intakte granulatene på halvparten av det totale antallet. Videre, jo mer volum-størrelse reduksjon av de skadede eller ødelagte granulat, jo mindre innvirkning de har på fordelingen. Dette skyldes at mindre granulater tar en større antall prosent, men mindre volumprosenter av granulatet i totalstørrelse. Som demonstrert ved sammenligningen mellom antall og volum kumulative fordelinger for samme gjennomsnittlige fordeling i figur 2, stivelse granulat med en tilsvarende sfære diameter mindre enn eller lik 9.967 μm utgjorde ca 48.53% av det totale antallet, men bare 5.854% av det totale volumet. Dermed vil eventuelle skadede eller nedbrudde granulater mindre enn 10 μm ha en svært liten innvirkning på differensialvolumprosentstørrelsesfordelingen. For stivelsesprøver av andre plantekilder kan en passende totaltelling for deres størrelsesanalyser være den som dobler den minimale tellingen som det grafiske geometriske gjennomsnittet ( ) av den viste størrelsesfordelingen i en prøvekjøring ikke lenger endres betydelig.
Teknisk sett er det mest kritiske trinnet for en størrelseskjøring å slippe en riktig mengde stivelse-metanol suspensjon til elektrolytten for et optimalt område på 5 til 8% nominell konsentrasjon for stivelse-elektrolytt suspensjon. For å nå målet, kan fallstørrelsen og konsentrasjonen av stivelse-metanol suspensjon må justeres gjennom prøvekjøringer. Konsentrasjoner av stivelseselelektrolyttsuspensjoner høyere enn det optimale området øker risikoen for redusert størrelsespresisjon, og hyppige blenderåpningsblokkeringer som fører til å kjøre aborter, noe som kan gjøre det svært vanskelig å fullføre et løp. Men for lav konsentrasjon (f.eks. <2 %) av stivelseselelektrolyttsuspensjonen kan forlenge en løpetur for mye, og forvrenge frekvenser av granulat i forskjellige størrelsesbeholdere på grunn av ikke-tilfeldig prøvetaking av granulat, noe som kan føre til en uakseptabel feilfrekvens (gjennomsnittlig CV > 5%) for en replikeringsanalyse. Den totale tellingen for en størrelseskjøring har også en stor innvirkning på den optimale konsentrasjonen av en stivelseselelektrolyttsuspensjon, derav på mengden og konsentrasjonen av stivelse-metanol lagt til. Jo større totaltelling for en løpetur, jo lengre tid for ferdigstillelse av løpet, og dermed mer risiko for blenderåpningblokkeringer som fører til å kjøre aborter. Problemet med blenderåpningsblokkering av aggregater forverres når blenderåpningsrør med mindre diameter brukes til stivelsesgranulat av mindre størrelser, noe som gjør det svært vanskelig å analysere små stivelsesgranulat (< 2 μm). Dette er faktisk den store ulempen eller begrensningen av prosedyren. Blenderåpningsproblemet kan lindres til en viss grad ved hjelp av noen tekniske midler. Man kan bruke mer sonikering til å bryte opp aggregater (uunngåelig mer skadet granulat også) i en stivelse-metanol suspensjon, og / eller en fortynnet stivelse-elektrolytt suspensjon ved 2-5% nominelle konsentrasjoner. Alternativt kan man bruke tekniske repetisjonskjøringer av størrelse på den minimale totale tellingen for stabil s* og av størrelsesfordelingene for en stivelsestype (f.eks. ca. 125.0000 tellinger for sweetpotato-stivelse) fra samme stivelseselelektrolyttsuspensjon, og slå sammen resultatene av repetisjonsløpene. Hver av de fire replikere distribusjonene (S1a, S1b, S2a og S2b) som vises i figur 1, var fra to sammenslåtte tekniske repetisjonskjøringer med størrelse 125 000 granulat hver fra samme stivelseselelektrolyttsuspensjon. Begge metodene må testes godt, da de kan øke replikeringsfeilfrekvensen til et uakseptabelt nivå (det vil si den gjennomsnittlige CV-en > 5%).
Tekniske og biologiske replikeringsanalyser av stivelsesprøver fra plantekilder under lignende fysiologiske forhold forbedrer reproduserbarheten og nøyaktigheten til den bestemte gjennomsnittlige granulatstørrelsesfordelingen. Praktisk talt kan tre eller fire biologiske repliker av stivelsesprøver bli uavhengig hentet fra samme vev under en bestemt tilstand. Men vi har tidligere funnet ut at det ikke var noen signifikant forskjell i feilfrekvenser (CV og standardfeil for gjennomsnittet), og s* mellom gjennomsnittlig granulatstørrelsesfordeling avledet fra distribusjoner av fire biologiske replikeringer (det vil si en størrelse x en suspensjon x 4 ekstrakter) og en fra de av to tekniske prøvetaking hver fra to biologiske repliker (det vil si en størrelse x 2 stivelse-metanol suspensjoner x 2 ekstrakter)28. Dermed kan biologiske replikere prøver reduseres til to, i hvert fall for sweetpotato-stivelsen. Andre trinn og tekniske parametere som kan endres eller justeres, ble spesielt notert under hvert av trinnene eller den bestemte parameteren i prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet er delvis støttet av Cooperative Agriculture Research Center, og Integrated Food Security Research Center ved College of Agriculture and Human Sciences, Prairie View A&M University. Vi takker Hua Tian for hans tekniske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
