Summary
Burada nişasta granül boyutu dağılımlarının tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak geçerli tayinleri ve iki parametreli multiplicative form kullanılarak belirlenen granül lognormal boyut dağılımlarının belirtilmesi için bir prosedür sunulmaktadır. Bitki ve gıda bilimi araştırmaları için gram ölçekli nişasta örneklerinin tüm granül boyutlandırma analizleri için geçerlidir.
Abstract
Tüm bitki kaynaklarından nişasta, farklı oluşum frekanslarına sahip, yani bir boyut ve şekil dağılımı sergileyen çeşitli boyut ve şekillerde granüllerdenoluşur. Çeşitli parçacık boyutlandırma teknikleri kullanılarak belirlenen nişasta granül boyutu verileri, granül şekillerine duyarlılık ve granül örnek boyutlarının sınırları da dahil olmak üzere bazı aşılmaz sistematik hatalardan kaynaklanan zayıf tekrarlanabilirlik veya istatistiksel önemin olmaması nedeniyle genellikle sorunludur. Elektrik algılama bölgesi tekniğini kullanarak nişasta granül boyutu dağılımlarının tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak geçerli tayinleri ve gelişmiş doğruluk ve karşılaştırılılabilirlik ile benimsenmiş iki parametreli multiplicative form kullanarak belirlenen granül lognormal boyut dağılımlarını belirtmek için bir prosedür özetledik. Gram ölçekli nişasta örneklerinin tüm granül boyutlandırma analizleri için geçerlidir ve bu nedenle nişasta granül boyutlarının nişasta biyosentez aparatı ve mekanizmaları tarafından nasıl kalıplandırıldığı ile ilgili çalışmaları kolaylaştırabilir; ve gıda ve endüstriyel kullanımlar için nişasdaların özelliklerini ve işlevselliğini nasıl etkilediklerini. Temsili sonuçlar, özetlenen prosedür kullanılarak sweetpotato nişaste örneklerinin granül boyutu dağılımlarının çoğaltılması analizlerinden sunulur. Ayrıca, prosedürün birkaç temel teknik yönünü, özellikle granül lognormal boyut dağılımlarının multiplicative spesifikasyonunu ve granül agregaları ile sık diyafram tıkanıklığı aşmak için bazı teknik araçları tartıştık.
Introduction
Nişasta granülleri, bitki fotosentez ve saklama dokularındaki iki ana rezerv homoglucan polimerinin, doğrusal veya seyrek dallı amilozun ve yüksek dallı amilektin, lipitler ve proteinler de dahil olmak üzere bazı küçük bileşenlerle birlikte düzenli olarak paket edildiği fiziksel yapıdır. Çeşitli bitki türlerinden nişasta granülleri küreler, elipsoidler, polihedronlar, trombositler, küpler, küboidler ve düzensiz tübüller dahil olmak üzere birçok üç boyutlu (3D) şekiller(ref.1,2'deincelenmiştir) sergiler. Aynı dokudan veya aynı bitki türünün farklı dokularından gelenler bile, değişen oluşum frekanslarına sahip bir dizi şekle sahip olabilir. Başka bir deyişle, bir bitki türünden gelen nişasta granülleri, belirli bir şekil yerine karakteristik bir istatistiksel şekil dağılımına sahip olabilir. Homojen olmayan ve küresel olmayan granül şekilleri, nişasta granül boyutlarının düzgün bir şekilde ölçülmesi ve tanımlanmasını zorlaştırır. Ek olarak, bir bitki türünün aynı dokularından gelen nişasta granülleri, farklı oranlarda, yani karakteristik bir boyut dağılımı sergileyen çeşitli boyutlardadır. Bu boyut dağılımı, nişaste granül boyutlarının analizini ve açıklamasını daha da karmaşık hale gelir.
Nişasta granül boyutları, mikroskopi, sedimansasyon/sterik alan akışı fraksiyonasyonu (Sd/StFFF), lazer kırınım ve elektrik algılama bölgesi (ESZ) dahil olmak üzere çeşitli parçacık boyutlandırma teknikleri kategorileri(ref. 3'tegözden geçirilmiştir) kullanılarak analiz edilmiştir. Bununla birlikte, bu teknikler granül şekli ve boyut dağılımı varlığında nişasta granül boyutlarının belirlenmesi için eşit derecede uygun değildir. Işık, konfokal ve taramalı elektron mikroskopisi de dahil olmak üzere mikroskopi, morfoloji4,5,6,7, yapı 8,9 ve nişaste granüllerinin gelişimi10,11 çalışmaları için mükemmeldir, ancak bazı doğal eksiklikler nedeniyle boyut dağılımlarını tanımlamak için pek uygun değildir. Çeşitli türlerden nişastelerin granül boyutlarının belirlenmesinde kullanılan mikroskobik granül görüntülerin doğrudan ölçümleri veya optik mikroskopi verilerinin (IAOM) yazılım destekli görüntü analizi, mısır12, buğday13,14,patates15 ve arpa16dahil olmak üzere, nişasta granül görüntülerinin çok sınırlı sayıda (on ila birkaç bin) sadece 1D (genellikle maksimal uzunluk) veya 2D (yüzey alanı) boyutlarını ölçebilir. Doğal olarak tekniklerle kısıtlanan küçük granül örnekleme boyutları, nişastanın birim ağırlığı başına muazzam granül sayıları göz önüne alındığında nadiren istatistiksel olarak temsil edilebilir (~120 x 10 gram başına6, 10 μm kürenin tümü 1,5 g/cm³ yoğunlukta varsayılır) ve bu nedenle sonuçların zayıf tekrarlanabilirliğine yol açabilir. Sd / StFFF tekniği yüksek hız ve çözünürlüğe ve nişasta granüllerinin dar boyut fraksiyonlarına sahip olabilir17, ancak muhtemelen doğruluğu hasarlardan, farklı şekillerden ve nişasta granüllerinin yoğunluğundan ciddi şekilde etkilenebileceği için nadiren kullanılmıştır. Lazer kırınım tekniği en yaygın kullanılan tekniktir ve tüm büyük mahsul türleri için nişaste granül boyutu analizleri için uygulanmıştır3,14,16. Tekniğin birçok avantajı olmasına rağmen, granül şekil dağılımı varlığında nişasta granül boyutlarının belirlenmesi için aslında uygun değildir. Eşzamanlı lazer kırınım araçlarının çoğu, tekdüze küresel parçacıklar için Mie ışık saçılma teorisi18'e ve diğer bazı homojenlik şekilleri için değiştirilmiş Mie teorisi18'e dayanır. Bu nedenle teknik, doğal olarak parçacık şekillerine karşı çok hassastır ve belirli homojenlik şekilleri için bile tamamen uygun değildir19, farklı oranlarda bir dizi şekle sahip nişasta granülleri için bırakın. ESZ tekniği, elektrik alanı rahatsızlığını bir diyafram açıklığından geçen parçacığın hacmiyle orantılı olarak ölçen bir tekniktir. Granül hacim boyutlarının yanı sıra sayı ve hacim dağıtım bilgilerini vb. ESZ tekniği renk, şekil, kompozisyon veya kırılma indeksi de dahil olmak üzere parçacıkların herhangi bir optik özelliğinden bağımsız olduğundan ve sonuçlar çok tekrarlanabilir olduğundan, özellikle bir dizi şekle sahip nişasta granüllerinin boyut dağılımlarını belirlemek için uygundur.
Nişaste granül boyutları da birçok parametre kullanılarak tanımlanmıştır. Genellikle, bazı durumlarda mikroskobik olarak ölçülen 2D görüntülerin12,20veya eşdeğer küre çaplarının ortalamalarının aritmetik araçları olan ortalama çaplarla basit bir şekilde tanımlanmıştır3. Diğer durumlarda, granül boyutu dağılımları, normal dağılım 14 ,23, 24,25,26 varsayılarak21,22,dağılım ortalama hacmi veya ortalama çapı (küre eşdeğeri, sayı, hacim veya yüzey alanına göre ağırlıklandı) kullanılarak belirtilmiştir. Çeşitli analizlerden nişasta granül boyutlarının bu tanımlayıcıları çok farklı bir yapıya sahiptir ve kesinlikle karşılaştırılamaz. Farklı türlerden nişaste granüllerinin bu "boyutları" ve hatta aynı türün aynı dokuları doğrudan karşılaştırıldığında çok yanıltıcı olabilir. Ayrıca, varsayılan normal dağılımların yayılma (veya şekil) parametresi, yani dağılımın genişliğini (yani boyutların yayılmasını) ölçen standart sapma σ (veya grafik standart sapma σg)çoğu çalışmada göz ardı edilmiştir.
Nişasta granül boyutlandırma analizlerinin karşı karşıya olduğu yukarıda belirtilen kritik sorunları çözmek için, ESZ tekniğini kullanarak nişasta örneklerinin granül boyut dağılımlarının tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak geçerli tayin edilmesi ve belirlenen granül lognormal boyut dağılımlarının, benimsenmiş iki parametreli çarpanlı form27 kullanılarak daha iyi doğruluk ve karşılaştırılılabilirlik ile doğru bir şekilde belirtilmesi için bir prosedür özetledik. Doğrulama ve gösterim için, prosedürü kullanarak sweetpotato nişasta örneklerinin granül boyutlandırma analizlerini çoğalttık ve grafik geometrik araçlarını ve multiplicative standart sapmalarını s * kullanarak lognormal diferansiyel hacim yüzdesi hacim eşdeğeri küre çapı 
dağılımlarını x/ (çarpın ve bölün) s* formunda belirttik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nişast örneklerinin hazırlanması
- Belirlenen prosedürleri izleyerek çeşitli bitki türlerinin nişaste biriktiren dokularından iki (veya üç) gram ölçekli çoğaltılmış nişaste örnekleri hazırlayın (örneğin, patates15, sweetpotatoes28, buğday taneleri13,29ve mısır çekirdekleri30, vb.).
- Nişaste örneklerini aseton veya toluen 3-4x ile iyice yıkayarak granül agregalarını en aza indirin ve tamamen kurulayın.
NOT: Hazırlık başına 1 g'dan fazla nişasta veren ekstraksiyon prosedürlerini kullanın. Bir nişasta ekstresinin granül boyutlandırma analizi için sırasıyla üç veya iki çoğaltma özlerinin her birinden bir veya iki adet 0,5 g aliquot örneklenir.
2. Elektrolit hazırlama
- Replikasyon nişasta örnekleri için dört boyutlandırma çalışması için metanolde 500 mL 50 g/L lityum klorür hazırlayın (çalışma başına 100 mL artı ekstra 100 mL). Tercihen, konsantrasyon varyasyonu en aza indirmek için elektroliteyi bir seferde 4 ila 8 L gibi büyük hacimli gruplar halinde yapın.
- Lityum klorürün çözünmesini hızlandırmak için kabı buz üzerinde veya 4 °C'lik bir dolapta soğutun.
3. Analizörün kurulması
- Analiz edilecek nişasta örneklerinin bilinen (literatürde veya deneme çalıştırmaları yoluyla) granül boyut aralığını kapsayan parçacık çapı aralığına sahip bir diyafram tüpü seçin, örneğin sweetpotato nişastaları için 100 μm diyafram. Bilinmeyen granül boyut aralığındaki nişasta örnekleri için, çakışan parçacık çapı aralıklarına sahip birkaç diyafram tüpü kullanarak deneme çalıştırmaları yoluyla uygun bir diyafram seçin.
NOT: Bir diyafram tüpünün partikül çapı aralığı, delik çapının% 2 ila 60'ı arasında ve delik çapının% 80'ine kadar genişletilmiş boyutlandırma aralığı ile doğru boyutlandırma aralığıdır. Tablo 1, büyük mahsul nişastalarının granüllerini boyutlandırmak için en kullanışlı üç diyafram tüpünün özelliklerini listeler. Nişasta örneğinin granül boyut aralığı tek bir diyaframlı tüpün boyutlandırma aralığından daha genişse, farklı boyutlardaki diyafram açıklıklarıyla ölçülen beş adede kadar parçacık boyutu dağılımını birleştiren çok tüplü bir çakışma analizi gerçekleştirin. Her diyafram, çapı ve tüp üzerinde etiketlenmiş parça numarası ile tanımlanabilir. Tüpün üzerindeki bir barkodda bulunan çapı ve seri numarası, analizörün Kontrol Panelinde bulunan Barkod Okuyucu kullanılarak analizör yazılımına taranabilir. - Nişaste granül boyutlarının belirlenmesi için 100 veya 200 mL analitik bir beher (cuvettes üzerinde) seçin ve ölçüm sırasında iyi bir granül süspansiyonu korumak için otomatik karıştırma (aşağıda) ayarlayın.
- Çalışma ayarlarını belirtmek için bir Standart çalışma yöntemi (SOM) ve sonuçları çözümleme, görüntüleme ve yazdırma için bir Tercihler dosyası oluşturun. SOM ve Tercihler dosyasını gerektiğinde standart bir çalışma yordamı (SÇP) içinde birleştirin.
NOT: Standart olmayan analizler için, analizleri çalıştırmak için SOM'u kullanın ve SOM ayarlarını gerektiğinde SOM'u Düzenle penceresinden (aşağıya bakın) çalıştırmalar arasında ayarlayın. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, Tercihler'i istediğiniz gibi değiştirerek çalışma sonuçlarını çözümleyebilir, görüntüleyin ve yazdırın. Standart hale getirilebilir granül boyutlandırma analizleri için, analizleri çalıştırmak için bir SÇP kullanın.- Çözümleyici yazılımını başlatın. Ana Manu'da SÇP | SOM Sihirbazı Oluşturma veya SOM'u Düzenlemeveya Durum Paneli'nda SOM'u Düzenle 'yitıklatın. Som ayarlarını seçmek için sihirbazı veya SOM'u Düzenle penceresini kullanın. Genellikle sweetpotato nişasta örneklerinin granüllerini boyutlandırmak için kullanılan ayarlar Tablo 2'de özetlenmiştir.
- Oluşturulan SOM'u SOM Sihirbazı-Ayarların Özeti penceresinde veya SOM'u Düzenle penceresinde bir Dosyaya kaydedin.
- Ana Manu'da, SÇP | Tercih Oluşturma Sihirbazı veya Tercihleri Düzenle. Tercih ayarlarını Tablo 3'tekiler veya diğerleri gibi istediğiniz gibi seçmek için Tercihler düzenleme penceresindeki sihirbazı veya sekmeleri kullanın.
- Seçili Tercihleri, Tercih Oluşturma Sihirbazı-Ayarların Özeti penceresinde veya Tercihleri Düzenle penceresindeki bir dosyaya kaydedin.
- Ana Menüde SÇP | SÇP Sihirbazı Oluştur. Sihirbazın adım adım kılavuzunu izleyerek bir açıklama girin, SÇP oluşturmak ve kaydetmek için SOM ve Tercihler dosyasınıseçin.
4. Nişasta örneklerinin granül boyutlandırma analizleri
- Çözümleyiciyi Hazırlama
- Çözümleyiciyi açın, yazılımı bilgisayarda açın ve çözümleyiciye otomatik bağlantısından sonra Durum Paneli'nin üst kısmındaki Hazır durumunu doğrulayın.
- Elektrolit kavanozu elektrolitle doldurun, gerekirse atık kavanozu boşaltın.
- Kullanım kılavuzundaki kılavuzu izleyerek seçilen diyafram tüpünü düzgün bir şekilde takın ve sabitleyin. Kalibre edilmemiş yeni diyaframlı bir tüp için Kalibrasyon | altındaki adım adım kılavuzu izleyerek kalibre edin Ana Menüdeki Diyaframı Kalibre Edin. Kalibre edilmiş diyafram tüpü için, Çalıştırma veya Kalibrasyon | altındaki Diyafram Tüpünü Değiştirme Sihirbazı'nın adım adım kılavuzunu izleyerek kalibrasyonu doğrulayın Ana Menüde Diyafram Kalibrasyonunu Doğrulayın.
- Kilit açma klipsini (sol numune bölmesi duvarının orta ön tarafında) iterek test platformunun kilidini açın ve platformu manuel olarak altına diriltin. Platforma 100 mL elektrolit içeren analitik bir beher yerleştirin, karıştırıcıyı karıştırma konumuna getirin ve diyafram tüpünü ve karıştırıcıyı elektrolit içine daldırmak için platformu manuel olarak kendiliğinden kilitleyen üst konuma yükseltin.
- Analizörün sistemi otomatik olarak elektrolitle doldurmasını sağlamak için alt gösterge Araç Çubuğu'nda Doldur'u tıklatın ve çözümleyicinin sistemi otomatik olarak temizlemesini sağlamak için Temizle'yi tıklatın.
- Sop | Ana Menüye SOM Yükle 'yi tıklatarak SOM'yi yükleyin ve Tercihler dosyası olmadan bir çözümleme çalıştırmak içinSOM'yi kullanın. Alternatif olarak, SÇP | tıklayarak bir SÇP yükleyin Ana Menüye bir SÇP yükleyin veya Durum Paneli'ne SÇP yükleyin ve çözümlemeyi çalıştırmak için SÇP'yi kullanın.
- SÇP kullanıyorsanız, SOM ve Tercih ayarlarını doğrulamak için Ana Menüde SOP | SOM Bilgisi veya Tercih Bilgileri'ni tıklatın. Örnek |'i tıklatın Çalıştırmanın örnek bilgilerini girmek için Ana Menü'ye Örnek Bilgileri veya Durum Paneli'ndeki Bilgileri Düzenle'yi girin.
- Nişasta-metanol örneği ve boyutlandırma süspansiyonları hazırlayın
- İki veya üç çoğaltma nişasta özlerinin her birinden sırasıyla iki veya bir 0,5 g örnek tartın.
- 0.5 g nişasta aliquots her birini 50 mL konik santrifüj tüpünde 5 mL metanol ekleyin ve ultrasonik bir işlemciden düşük yoğunluklu ultrason (12-24 W / cm2)birkaç darbe kullanarak nişasta granüllerini tamamen dağıtın.
- Tek kullanımlık bir transfer pipet kullanarak, nişasta-metanol süspansiyonunun (~0.2 mL) küçük bir damlasını, beherde sürekli karıştırma altında 50 g / L LiCl metanol elektrolitinin 100 mL'sine uygulayın. Örnek bölmenin kapısını kapatın.
- Boyutlandırma çalıştırması gerçekleştirme
- Önizleme çalıştırmasını başlatmak için gösterge araç çubuğundaki Önizleme'yi tıklatın. Durum Paneli'nde, dinamik olarak görüntülenen konsantrasyon çubuğunun yeşil olduğunu ve süspansiyon için %5 ila %8 nominal konsantrasyon aralığı gösterdiğini doğrulayın.
- Önizleme çalıştırmasını durdurmak için alt Araç Çubuğu'nda Durdur'a tıklayın. Gerekirse, süspansiyonun bir aliquot'ını elektrolitle değiştirerek nişaste-elektrolit süspansiyonu seyreltin ve ardından bir Önizleme çalışmasını tekrarlayın.
NOT: Süspansiyonun %5 ila %8 nominal konsantrasyon aralığı, toplanmış granüllerin diyafram tıkanması nedeniyle durmadan bir çalıştırmanın tamamlanması için kritik öneme sahiptir. Gerekirse, nominal konsantrasyonu en uygun aralıkta olan yeni bir nişasta elektrolit süspansiyonu yapmak için damla numune boyutunu ve/ veya nişasta-metanol süspansiyonunun konsantrasyonuna ayarlayın. - Doğrulamadan sonra, çalıştırmayı başlatmak için alt Araç Çubuğu'nda Başlat'ı tıklatın. Çözümleyici, bir çalıştırmada Durum Paneli'ndeki çalışma süresiyle birlikte görüntülenen toplam büyüklükteki granül sayısı, SOM'un Denetim Modu tarafından ayarlanan Toplam Sayıya (125.000 veya 250.000) ulaştığında çalıştırmayı otomatik olarak tamamlar. Süspansiyon konsantrasyonuna bağlı olarak (%5-8 aralıkta veya daha düşük), tek bir çalışma 2 ila 5 dakika veya daha fazla sürer.
NOT: Çözümleyici, SOM'un blokaj algılama ayarları başına otomatik olarak bir diyafram tıkanıklığı algıladığında, çalıştırmayı iptal eder, diyaframın engelini kaldırmak ve yeni bir çalıştırma başlatmak için temizlenir. Çözümleyici çalıştırma işlemini iptal etmeden önce bu engelleme eylemi en fazla dört kez yinelenmeye ayarlanır. Bu çalıştırmayı engelleyen tıkanıklık sorunu, Tablo 2'de belirtildiği gibi ve tartışmada ayrıntılı olarak açıklanan iki teknik yöntem kullanılarak aşılabilir. - Gerekirse, alt Araç Çubuğu'nda Başlat veya Yinele'yi tıklatarak aynı nişasta elektrolit süspansiyonu kullanarak teknik bir tekrar çalıştırması gerçekleştirin (bkz. Tablo 2 ve Tartışma'da ayrıntılı).
- Bir çalıştırma veya tekrar çalıştırmasının tamamlanmasından sonra, kabı boşaltın, metanol ile durulayın ve bir sonraki çalıştırma için 100 mL taze elektrolit çözeltisi ile yeniden doldurun.
- Bir çalıştırma sırasında, 60 μm'den büyük granül sayısı toplam sayımın %0,1'ini aştığında (SOM ayarı başına) Genişletilmiş Boyut Aralığı bildirim iletişim kutusu görüntülenirse, diyafram çapının %80'ine kadar genişletilmiş dinamik boyutlandırma aralığı çalıştırmak için %60 ila %80 çalıştır'ı tıklatın.
NOT: Genişletilmiş Boyut Aralığı ayarı, diyafram çapının %60'ından büyük granüller için eylemleri kontrol eder (bu durumda 100 μm). SOM'deki ayar, sayıları toplam sayının% 0,1'ine ulaştığında 60 μm'den büyük nişasta granüllerinin dahil edilmesini belirtir. Çalıştırmanın tamamlanması hala toplam sayım tarafından denetlenmektedir ve toplam sayımın% 0,1'inden (statik olarak önemsiz olduğu varsayılan miktar) daha az olan daha büyük granüller dahil edilmeden diğerinden biraz daha az zaman alabilir.
- Çalıştırma sonuçlarını çözümleme
- Çalıştırmaları denetlemek için bir SOM kullanıldıysa, Tercih Oluşturma Sihirbazı'nı veya Ana Menüdeki SÇP altındaki Tercihleri Düzenle'yi kullanarak sonuçların görüntülenmesi, yazdırılması ve istatistiksel analizleri için tercih ayarları'nı seçin.
- Karşılaştırma için tek bir grafikte birden çok çalıştırmadan elde edilen kaplama sonuçları.
- Ana Araç Çubuğu'nda veya Dosya | Yer Paylaşımı'nı tıklatın Yer Paylaşımı penceresine erişmek için Ana Menü'de yer paylaşımı. Dosyalar kutusuna gidin ve birden çok istenen sonuç dosyasını seçin, Seçili Dosyalar kutusuna taşımak için Ekle'yi tıklatın ve seçili sonuçları tek bir grafikte kaplamak için Tamam'ı tıklatın.
- Açık bir kaplamaya dosya eklemek için RunFile | Yer Paylaşımı penceresine erişmek için Çalıştır Menüsünde Yer Paylaşımı için açın, istediğiniz dosyaya gidin ve eklemek için tıklatın.
- Çoğaltma analizlerinden elde edilen ortalama sonuçlar (2 ekstrakt x 2 nişasta örneklemesi veya 3 ekstrakt x 1 nişasta örneklemesi) ve ortalama granül boyutu dağılımını ve istatistiklerini bir liste veya grafikte görüntüleyin veya yazdırın.
- Ana Menüde Dosya | DosyasıTool | Ortalama penceresini açmak için ortalama. Dosyalar kutusunda birden çok istenen sonuç dosyasına gidin ve seçin, Seçili Dosyalar kutusuna taşımak için Ekle'yi tıklatın ve seçili sonuçların ortalamasını almak ve ortalamayı tek bir grafikte görüntülemek için Tamam'ı tıklatın.
- Ortalama bir dağıtıma ek bir sonuç dosyası eklemek için, Çalıştır Menüsü'nde RunFile | Aç ve Ortalamaya Ekle penceresini tıklatarak Ortalamaya Ekle penceresini açın, dosyaya gidin ve dosyayı ekleyin. Yeni ortalama, Çalıştır (sonuç) penceresindeki veya listesindeki grafikte görünür.
5. Ortalama dağılımın belirtilme
- Ortalama dağıtımı görüntüleyen Çalıştır Menüsü penceresinde | Hesapla'yı tıklatın Satırlardaki ortalama istatistikleri ve sütunlardaki ortalama dağılımın grafik istatistiklerini görüntüleyen istatistik özeti penceresini açmak için Çalıştır Menüsündeki Ortalama İstatistikler.
- x / s * formundaki ortalama dağılımı belirtmek için grafik istatistikleri sütunundaki grafik geometrik ortalama
( ) ve S.D. (s*) kullanın. Ortalama dağıtımların geometrik araçlarının ortalamasını (μ, ortalama dağılımla aynı) ortalama istatistik satırında listelenen ortalama S.D. (σ) ile bölerek, ortalama çoğaltma dağılımları arasındaki CV ölçüm varyasyonlarını hesaplayın.
NOT: Çoğaltma dağılımları arasındaki varyasyonları değerlendiren ortalama S.D. (μ için), ortalama dağılımın yayılmasını ölçen grafik geometrik S.D.'den farklıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosedürü doğrulamak ve belirlenen granül boyutu dağılımının tekrarlanabilirliğini göstermek için sweetpotato nişasta örneklerinin boyutlandırma analizlerini gerçekleştirdik. Daha önce tanımlanmış bir prosedür 28 kullanarak benzer bir gelişim çağında SC1149-19 üreme hattının tarlada yetiştirilen sweetpotatoes'lerinden çoğaltma (S1 veS2)nişasta örnekleri hazırladık. Her nişasta özünden, iki adet 0,5 g aliquot (a ve b) örneklendi, 5 mL metanolde askıya alındı ve agregaları parçalamak için birkaç düşük enerjili ultrason darbesi ile sonicated. İki nişastaki metanol süspansiyon çiftinin her biri, nişaste elektrolit süspansiyonu yapmak için damla örneklendi, daha sonra her biri toplam 125.000 granül sayısı için yukarıda belirtilen SOM kullanılarak iki kez (teknik tekrar çalıştırmaları) boyutlandırıldı. Her bir boyutlandırma çalışması için, toplam sayı ~65.000 ve ~125.000'in üzerine ulaştığında, görüntülenen diferansiyel hacim boyutu dağılımının grafik geometrik S.D. (s*) ve geometrik ortalaması ( ) artık sırasıyla önemli ölçüde değişmez. Bir nişasta-metanol süspansiyonu kullanılarak yapılan tekrar koşularının her çifti, tamamlandıktan sonra toplam 250.000 boyutlandırma sayısı için birleştirildi.
Şekil 1, sweetpotato nişasta örneklerinin dört ayrıştırma analizi ve ortalama dağılımları için diferansiyel hacim yüzdesi hacim eşdeğeri küre çapı dağılımlarını (S1a, S1b, S2a ve S2b) göstermektedir. Dört çoğaltma dağılımının geometrik araçlarının ortalaması için CV% 3.75 idi ve boyutlandırma sonuçlarının mükemmel bir tekrarlanabilirliğini gösterdi. Dört çoğaltma dağılımının her biri, 250.000 granülden oluşan çok büyük bir örnekleme boyutundan, üzerinde grafik geometrik S.D. (s*) ve geometrik ortalamanın ( ) tek bir boyutlandırma çalışmasında artık önemli ölçüde değişmediği minimum sayıları (~65.000 ve ~125.000) aştığı belirlendi. Bu nedenle, belirlenen çoğaltma hacim boyutu dağılımlarının tümü istatistiksel olarak geçerliydi. Belirlenen lognormal granül boyutu dağılımlarının spesifikasyonunun daha iyi doğruluğu ve karşılaştırılırlığı (aşağıda tartışılmıştır) için, tüm bu dağılımlar grafikte listelendiği gibi grafik geometrik araçları ( ) ve S.D.(s*) bir x/ (çarpma ve bölme) s* formunda kullanılarak belirtilmiştir. Sweetpotato nişastesinin granül boyutu dağılımının daha önce açıklandığı gibi lognormal olacak şekilde titizlikle takıldığını lütfen unutmayın28.
Şekil 1: Sweetpotato nişasta örneklerinin boyutlandırma analizlerinden lognormal diferansiyel hacim yüzdesi hacim eşdeğeri küre boyutu dağılımları. Dört çoğaltma boyutlandırma analizi için örnekleme şeması sonuç olarak ayrıntılı olarak yer leştirilmiştir. Çoğaltma analizlerinden elde edilen dört dağılım (S1a, S1b, S2a ve S2b) ve ortalamaları üst üste bindirildi ve x/ (çarp ve böl) s* formu kullanılarak belirtildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2, ortalama fark hacmi yüzdesi boyut dağılımının dönüşüm görünümleri olan dört çoğaltma boyutlandırma analizinin ortalama (veya ortalama) kümülatif (<) sayı ve hacim yüzdesi boyut dağılımlarını gösterir. Nişasta granüllerinin kümülatif sayısı ve hacim yüzdeleri arasındaki karşılaştırma, daha küçük hacim eşdeğeri küre çaplarına sahip granüllerin toplam sayının toplam hacimden çok daha büyük yüzdelerini oluşturduğunu göstermiştir. Örneğin, hacim eşdeğeri küre çaplarına sahip granüllerin sayısı daha küçük veya 9.976 μm'ye eşittir, ancak toplam sayının% 48.53'ünü oluştururken, toplam hacmin sadece% 5.854'ünü oluşturur.
Şekil 2: Sweetpotato nişasta örneklerinin dört çoğaltma boyutlandırma analizinden nişasta granüllerinin ortalama kümülatif (<) sayı ve hacim yüzdesi boyut dağılımları. İki dağılım, Şekil 1'deki ortalama boyut dağılımının dönüşüm görünümleridir. Grafik, birim eşdeğeri küre boyutları belirli boyut depo gözleri arasında daha düşük veya eşit olan nişasta granüllerinin birim (sağ Y ekseni) yüzdeleriyle birikmeli (<) sayıyı (sol Y ekseni) karşılaştırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Diyafram Çapı (μm) | Parçacık Çap Aralığı (μm) | Partikül Hacim Aralığı (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1,44 - 92,0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Tablo 1: Mahsul türlerinden nişasta granüllerini boyutlandırmak için en kullanışlı üç diyafram tüpü.
| SOM Ayarları | Seçim | |
| Açıklama | SOM açıklaması | Boyutlandırma Nişasta Granülleri |
| SOM yazarı | - | |
| Örnek açıklama | Sweetpotato nişast örnekleri | |
| Elektrolit | 50 g L-1 Lityum Klorür | |
| Dispersant | Hayır | |
| Diyafram | 100 μm | |
| Denetim Modu | Denetim Modu | Toplam Sayım [250.000] veya [125.000]a |
| Atık Tankı | %80 dolduğunda | |
| Çalışma Ayarları | Örnek bilgileri girin | Evet |
| Çalıştırma sayısı | 1 (veya 2, tekrar çalıştırmalar için) | |
| Çalıştırmadan önce diyafram tüpünü temizle | Evet | |
| Çalıştırmadan sonra diyafram tüpünü temizle | Evet | |
| Dosyayı kaydet | Evet, darbe verileri dahil | |
| Verileri dışarı aktarma | Evet | |
| Raporu yazdır | Evet | |
| Örnek teknik özelliklerle karşılaştırın | Hayır | |
| Görünüm | Boyutu | |
| Karıştırıcı Ayarları | Örnek beher | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Karıştırıcı kullan | Evet | |
| Hız | [15], CW (saat açısından) | |
| Karıştırıcı konumu | Otomatik | |
| Eşik, Akım ve Kazanç | Boyutlandırma eşiği | 2 μm |
| Diyafram akımı | 1600 mA | |
| Preamp kazancı | 2 | |
| Genişletilmiş boyut aralığı b | Toplam sayımın [> %0,1] sayısı | |
| Pulse'dan Boyuta Ayarlar | Boyut depo gözleri | 400 |
| Boyut aralığı | 2 ila 60 μm | |
| Depo gözü aralığı | Günlük çapı | |
| Tesadüf düzeltmesi | Evet | |
| Darbe Düzenleme | Hayır | |
| Konsantrasyon | Örnek miktar | 0,2 ml |
| Yoğun -luğu | - | |
| Ön seyreltme faktörü kullanın | - | |
| Analitik hacim | - | |
| Elektrolit hacmi | 100 ml | |
| Seyreltme faktörü kullan | Hayır | |
| Tıkanma | Tıkanıklık algılama | Otomatik (Çalıştırmanın başlangıcından itibaren) |
| Varsayılan tıkanıklık algılama: sayım hızı <%20, Diyafram oranı >%40 veya konsantrasyon artışı >%40 olduğunda. | ||
| Tıkandırı eylemi | İptal etme, engellemeyi kaldırma ve yeniden başlatma,En fazla [4] kez | |
| Göster simgesi | Evet | |
| Tıkanıklık monitörü | Sayım oranı | |
| a: Tekrarlanan engellemeyi kaldırma ve yeniden başlatma daha büyük sayım çalıştırmasını tamamlayamadıysa, aynı nişasta elektrolit süspansiyonundan her biri 125.000'in daha düşük bir toplam sayısını boyutlandırmak için iki tekrar çalıştırma yapın ve Ana Menü'deki[ Dosya ] altında [DosyaTools] altında[MergeRuns] kullanarak tekrar çalıştırmalarının sonuçlarını birleştirin. Alternatif olarak, nişasta elektrolit süspansiyonu daha düşük nominal konsantrasyona (%2-5) sahip yenisiyle değiştirin. Yeni bir damla örnek nişaste-elektrolit süspansiyonu hazırlarken, daha fazla agregayı parçalamak için nişaste-metanol süspansiyonu tekrar darbeyle sonicate edin. | ||
| b: Genişletilmiş Boyut Aralığı, diyafram çapının %60'ından (bu SOM'de 100 μm) daha büyük granüller için eylemleri kontrol eder. Bu ayar, sayıları toplam sayımın %0,1'inden büyük olduğunda 60 μm'den büyük nişastan granüllerinin dahil edilmesini belirtir. | ||
Tablo 2: Sweetpotato nişasta örnekleri için boyutlandırma çalıştırmalarını kontrol etmek için tipik SOM ayarları.
| Tercih Ayarları | Seçim | |
| Yazdırılan Raporlar | Örnek bilgi | Örnek, Çalışma Numarası, Boyut Depo Gözleri, Toplam Sayım sayısı |
| Boyut grafikleri | Diferansiyel Birim %, Günlük X Ekseni, YediLi Gruplara Göre Düzgün | |
| Boyut istatistikleri | Birim, Birim % | |
| Ortalama istatistikler | Toplam tutar, ortalama, S.D. | |
| Yer paylaşımı istatistikleri | Toplam tutar, ortalama, S.D. | |
| Liste | Sütunlar: Depo Gözü Numarası, Depo Gözü Çapı (ortada), Fark Numarası, Fark Sayısı %, Fark Hacmi %. | |
| Depo Gözü Gruplandırma: Depo Gözü Grup Boyutu 7, Tüm Depo Gözleri, Gruptaki Toplam Depo Gözleri. | ||
| Istatistik | Türü | Geometrika |
| Aralığı | Tüm | |
| Yazdıracak sonuçlar | Aralık, Toplam Tutar, Ortalama, S.D., %95 Güven Limitleri | |
| Grafikte sonuçlar | Aralık: Tümü, toplam tutar, ortalama, S.D. | |
| Ortalama ve Trend | Ortalamaağırlıklandırma b | Birim % |
| Dağıtımc | Fark | |
| Sınır -ları | 2 S.D. | |
| Nabız ortalaması | Darbeleri Boyut Aralığına Dönüştür'ü kullanma | |
| Ihracat | Veri öğeleri | Örnek Bilgiler, İstatistikler, Ortalama İstatistikler, Boyut Listesi |
| Dışa aktarma uzantısı | .xls | |
| Sayı biçimi | 123456.78 | |
| Veri biçimi | Sekme Sınırlandırılmış | |
| Klasörü dışarı aktar | Geçerli Klasör | |
| Sayfa yapısı | Özel Başlık Ekle, Ekran Rengi Ekleme Tarihini Kullanarak Grafik Yazdır | |
| Grafik boyutu: | Yarım Sayfa | |
| Grafik Seçeneği | Görüntü: | Ekran ve Renkli Yazıcı |
| Çizgi rengi | (Varsayılan) | |
| Çizgi stili | (Varsayılan) | |
| Efsane | Sağ Üst | |
| Boyutu | (Varsayılan) | |
| Grafik stili | Adım | |
| Stili sınırla | Eğri | |
| Yazı Tipleri ve Renkler | Varsayılan Yazı Tipleri ve Varsayılan Renkler veya istediğiniz gibi. | |
| Görünüm Seçenekleri | Varsayılan görünüm | Boyut, Grafik |
| Boyut X ekseni | Çapı | |
| Ölçüm | Parçacık | |
| Litre Sembolü | L (mL, μL, fL) | |
| Multisizer darbe verileri | En fazla 5010 darbe grafiği, En fazla 5010 darbeyi listele | |
| Birim birimleri | μm3 | |
| Sayılar | 123456.78 | |
| a: Burada belirtilen geometrik ortalama ve S.D. istatistikleri, belirlenen diferansiyel hacim yüzdesi eşdeğer küre boyutu dağılımının ölçeğini ve şeklini tanımlayan grafik istatistiklerdir. x ̅* x/ s* formunda lognormal dağılımı belirtmek için kullanılırlar. | ||
| b: Ortalama ağırlıklandırma, birden çok çalıştırmadan elde edilen sonuçların farklı ağırlıklandırma seçenekleriyle nasıl ortalamaya sahip olduğunu ifade eder. Farklı ortalama ve görüntüleme seçenekleri için Çalıştır Menüsü'ndeki bu ayarları değiştirin. | ||
| c: Satırlardaki ortalama istatistikleri, "Ortalama"sütunundaki ortalama dağılımın grafik istatistiklerini görmek için [Çalıştır Menüsü]'nde [ Ortalama İstatistikler ] 'i açmak için [ Hesapla ]'yıseçin. | ||
Tablo 3: Sweetpotato nişasta örnekleri için boyutlandırma çalıştırmalarından elde edilen sonuçların görüntülenmesi, analizleri ve yazdırı için tipik tercih ayarları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özetlenen prosedür, nişasta granül boyutu analizleri için mevcut birkaç yöntemde bazı kritik sorunları çözmüştür, 3B granüllerin uygunsuz 1D veya 2D boyutlandırılması, tekdüze olmayan granül şekilleri nedeniyle boyutlandırma ölçümlerinin bozulması, sınırlı granül numune boyutları nedeniyle zayıf tekrarlanabilirlik ve şüpheli istatistiksel geçerlilik, hem granül şekli hem de normal olmayan boyut dağılımları varlığında granül boyutlarının yanlış veya yanlış spesifikasyonu (özellikle ortalama boyutun kullanımı) dahil olmak üzere. Nişaste granüllerinin 3D boyutlarını (hacmini) ölçen ve granül şekillere yanıt vermeyen ESZ tekniğini kullanır. Çok büyük bir granül numune boyutuna (4 x 250.000) sahip çoğaltma analizlerinden ortalama granül boyutu dağılımını türetmek için tasarlanan tasarım, sonucu yalnızca istatistiksel olarak geçerli ve daha tekrarlanabilir hale getirmekle kalmaz, aynı zamanda boyutlandırma doğruluğunu artırmak için toplu ve hasarlı granüller tarafından ölçüm bozulmalarını teknik olarak azaltır (aşağıda açıklanmıştır). Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, prosedür kullanılarak belirlenen geometrik çoğaltma dağılımlarının ortalaması için CV genellikle% 5'ten daha küçüktür, bu da sonuçların tatmin edici bir tekrarlanabilirliğini gösterir. Ayrıca, lognormal granül hacim eşdeğeri küre boyutu dağılımının hem ölçeğinin ( ) hem de şeklinin (s*) çarpan spesifikasyonu, bir nişasta örneğindeki dağıtılmış granül boyutlarının gerçek doğasını daha doğru bir şekilde gösterir ve aynı veya farklı kaynaklardan gelen nişastaların granül boyutlandırma analizleri arasında kullanımı kolaydır ve evrensel olarak karşılaştırılabilir. Bu nedenle, prosedür nişasta granül boyutlarının daha doğru, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak geçerli bir şekilde belirlenmesini ve belirlenen granül lognormal boyut dağılımlarının uygun şekilde belirtimini sağlar. Gram ölçekli nişasta örneklerinin tüm granül boyutlandırma analizleri için geçerlidir ve nişasta granül boyutlarının nişasta biyosentez aparatı ve bitki nişastası biriktiren dokulardaki mekanizmalar tarafından nasıl kalıplaştığı ve nişastaların gıda ve endüstriyel kullanımlar için özelliklerini ve işlevlerini nasıl etkilediğine dair çalışmalar için önemli bir araç haline gelebilir.
Nişasta granülleri, boyutlarının 3D terimlerle tanımlanması ve ölçülmesi için çoğunlukla küresel olmayan şekillere sahip stereo parçacıklardır. Bu nedenle, nişaste granüllerinin hacimleri boyutlarını en iyi şekilde tanımlar ve hacim eşdeğeri küre çapı, küre dışındaki hiçbir stereo nesne tek bir 1D boyut parametresiyle tanımlanamadığından, granül 3D boyutlarını düzgün bir şekilde tanımlamak için kullanılabilecek tek tek 1D boyut parametresidir. Ayrıca, tüm bitki türlerinden nişaste granülleri, çeşitli oluşum frekanslarına sahip bir dizi şekle sahiptir. Böyle bir şekil dağılımının varlığında, parçacık şekillerine duyarlı herhangi bir parçacık boyutlandırma tekniği, örneğin lazer kırınım tekniği, nişasta granül boyutu dağılımlarının tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak geçerli tayinleri için uygun değildir, çünkü bu tekniklerin doğasında bulunan sistem hatası bir şekil faktörü ile kolayca düzeltilemez. Aslında, lazer kırınım tekniğini kullanarak aynı sweetpotato nişasta örneğinden granül boyutlarının çoğaltma analizleri arasındaki hata oranı (CV) % 15-20'ye kadar ulaşabilir28, bu da çok düşük tekrarlanabilir boyutlandırma sonuçlarına işaret eder. Ne yazık ki, granül şekillerin nişasta granülleri boyutlandırma üzerindeki etkisi çoğunlukla göz ardı edilmiştir, bu da literatürde şekle duyarlı parçacık boyutlandırma teknikleri kullanılarak elde edilen şüpheli nişasta granül boyutu verilerinin büyük bir gövdesi ile sonuçlanmıştır.
İki parametreli çarpan belirtimi, lognormal dağılımların hem ölçeğini ( ) hem de şekli (s*) tanımlar ve şimdiye kadar ortalama boyuttaki veya boyut aralığı26olan tek bir tanımlayıcıdan çok daha kesin ve anlamlıdır. Normal dağılımın ± s, ± 2s ve ±3 saralıklarına karşılık gelen çoklayıcı x / s *, x/ ( s *) 
3 aralık, lognormal dağılımın sırasıyla yaklaşık% 68.3, % 95.5 ve% 99.7 güven aralıklarını kapsar. Lognormal granül boyutu dağılımının geometrik ortalaması ( ) ve S.D. ( s* ) analizör yazılımı tarafından hesaplanan ve boyutlandırma çalışması veya sonuçların analizleri sırasında ekrandaki boyut grafiğinde görüntülenmek üzere seçilebilen boyut dağılımı eğrisinin grafik geometrik ortalamasına ve S.D.'sine karşılık gelir. Bu nedenle, çok yönlü spesifikasyonu kullanmak oldukça kullanışlı ve basittir. Ek olarak, ve s* nişaste biyosentez aparatı ile ilişkili farklı fizyolojik etkilere sahip olduğu gösterilmiştir28. Çeşitli bitki türlerinden nişastaların granül hacim boyutu dağılımları, bitki nişastası biriken dokularda nişasta granüllerinin oluşumu, kısıtlanmamış gelişen karmaşık bir sistem31'e veya lognormal dağılımın32 özelliğine sahip hücre içi katalitik reaksiyon ağına düştüğü için tüm lognormal olabilir. Buğday13 , 14gibi bazı bitki türlerinden nişastelerin bimodal granül boyutu dağılımları iki lognormal dağılım olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, granül lognormal hacim eşdeğeri küre boyutu dağılımlarının multiplicative spesifikasyonu, çeşitli bitki kaynaklarının nişastalarından ve farklı ölçümlerden belirlenen granül boyutlarının istatistiksel olarak geçerli bir evrensel karşılaştırmasına da izin verebilir, çünkü hacim eşdeğeri küre çapı ve s* demensiyonsuzdur.
Granül örnek boyutunu temsil eden bir nişasta (metanol) örneğinin analizi için uygun bir toplam granül boyutlandırma sayısı, nişasta örneği için istatistiksel önemin granül boyut dağılımının başarılı bir şekilde belirlenmesi için en kritiktir. Sweetpotato nişastası örneklerinde, tek bir çalıştırmadaki toplam sayı ~65.000 ve ~125.000'in üzerine ulaştığında, görüntülenen diferansiyel hacim boyutu dağıtım eğrisinin grafik geometrik S.D. ( s *) ve geometrik ortalaması ( ) artık önemli ölçüde değişmez, buda s * ve istatistiksel öneme sahip minimum sayıları gösterir. Prosedürdeki nişasta-metanol örneği için 250.000 granül boyutlandırmadaki örnekleme artıklığı, büyük boyutlu granül havuzundaki toplam ve hasarlı granüller için indirim yapmayı amaçlamaktadır. Toplam ve hasarlı veya kırık granüllerin tamamlanmış bir çalıştırmada veya iki birleştirilmiş tekrar çalıştırmasında toplam 250.000 granül sayısının% 50'sini oluşturduğunu varsaysak bile, grafik geometrik S.D. ve belirlenen dağılımın ortalaması, toplam sayımın yarısının sağlam granülleri tarafından tutturulacakları için önemli ölçüde etkilenmeyecekti. Ayrıca, hasarlı veya kırık granüllerin hacim boyutu ne kadar azalırsa, dağılım üzerinde o kadar az etkisi vardır. Bunun nedeni, daha küçük granüllerin daha büyük bir sayı yüzdesi, ancak toplam boyutlu granüllerin daha küçük hacim yüzdelerini almasıdır. Şekil 2'deaynı ortalama dağılım için sayı ve hacim kümülatif dağılımları arasındaki karşılaştırmada gösterildiği gibi, eşdeğer küre çapı 9.967 μm'den küçük veya buna eşit nişasta granülleri toplam sayının yaklaşık% 48.53'ünü, ancak toplam hacmin sadece% 5.854'ünü oluşturmuştır. Bu nedenle, 10 μm'den küçük hasarlı veya parçalanmış granüller diferansiyel hacim yüzdesi boyut dağılımı üzerinde çok küçük bir etkiye sahip olacaktır. Diğer bitki kaynaklarının nişasta örnekleri için, boyutlandırma analizleri için uygun bir toplam sayım, bir deneme çalışmasında görüntülenen boyut dağılımının grafik geometrik ortalamasının ( ) artık önemli ölçüde değişmediği minimum sayıyı iki katına çıkaran sayı olabilir.
Teknik olarak, boyutlandırma çalışması için en kritik adım, nişasta-elektrolit süspansiyonu için% 5 ila 8 nominal konsantrasyonda optimum bir aralık için uygun miktarda nişasta-metanol süspansiyonu elektrolit'e bırakmaktır. Hedefe ulaşmak için, nişastaki metanol süspansiyonunun düşme boyutu ve konsantrasyonunun deneme çalıştırmaları ile ayarlanması gerekebilir. Nişasta elektrolit süspansiyonlarının optimum aralıktan daha yüksek konsantrasyonları, boyutlandırma hassasiyetinin azalması ve kürtaj yapılmasına yol açan sık diyafram tıkanıklıkları risklerini artırır, bu da bir çalıştırmayı tamamlamayı çok zor hale getirebilir. Ancak, çok düşük bir konsantrasyon (örn. <2%) nişasta elektrolit süspansiyonunun çok fazla çalışmasını uzatabilir ve granüllerin rastgele olmayan örneklemesi nedeniyle çeşitli boyut kutularındaki granüllerin frekanslarını bozabilir ve bu da kabul edilemez bir hata oranına yol açabilir (ortalama CV > % 5) çoğaltma analizi için. Boyutlandırma koşusu için toplam sayı, nişasta-elektrolit süspansiyonunun optimal konsantrasyonu üzerinde, dolayısıyla eklenen nişasta-metanol miktarı ve konsantrasyonu üzerinde de büyük bir etkiye sahiptir. Bir koşu için toplam sayı ne kadar büyük olursa, koşunun tamamlanması için o kadar uzun süre ve böylece kürtaja yol açan diyafram tıkanıklıkları için daha fazla risk. Daha küçük boyutlardaki nişaste granülleri için daha küçük çaplı diyafram tüpleri kullanıldığında agregaların diyafram tıkanma sorunu daha da kötüleşir, bu da küçük nişaste granüllerinin (< 2 μm) analizini çok zorlaştırır. Bu gerçekten de prosedürün en büyük dezavantajı veya sınırlamasıdır. Diyafram tıkanıklığı sorunu bazı teknik araçlar kullanılarak belirli bir ölçüde hafifletilebilir. Nişasta-metanol süspansiyonunda agregaları (kaçınılmaz olarak daha hasarlı granüller de) ve/veya %2-5 nominal konsantrasyonlarda seyreltilmiş nişasta elektrolit süspansiyonunu parçalamak için daha fazla sonikasyon kullanabilirsiniz. Alternatif olarak, aynı nişasta-elektrolit süspansiyonundan kararlı s* için minimum toplam sayıyı ve nişasta tipi için boyut dağılımlarını (örneğin sweetpotato nişastası için yaklaşık 125.000 sayım) boyutlandırmanın teknik tekrar çalıştırmalarını kullanabilir ve tekrar çalıştırmalarının sonuçlarını birleştirebilirsiniz. Şekil 1'de gösterilen dört çoğaltma dağılımının (S1a, S1b, S2a ve S2b) her biri aynı nişasta-elektrolit süspansiyonundan 125.000 granül boyutlandırmanın iki birleştirilmiş teknik tekrar çalıştırmasındandı. Çoğaltma hata oranını kabul edilemez bir düzeye (örneğin, ortalama CV > % 5) yükseltebilecekleri için her iki yöntemin de iyi test edilmesi gerekir.
Benzer fizyolojik koşullar altında bitki kaynaklarından alınan nişasta örneklerinin teknik ve biyolojik çoğaltma boyutlandırma analizleri, belirlenen ortalama granül boyutu dağılımının tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu artırır. Pratik olarak, nişaste örneklerinin üç veya dört biyolojik çoğaltılması, belirli bir durum altında aynı dokudan bağımsız olarak çıkarılabilir. Ancak, daha önce hata oranlarında (ortalama için CV ve Standart Hatalar) ve s* dört biyolojik kopyanın dağılımlarından elde edilen ortalama granül boyutu dağılımı arasında önemli bir fark olmadığını gördük (yani, bir boyutlandırma x bir süspansiyon x 4 ekstrakt) ve iki biyolojik çoğaltmadan her biri iki teknik örneklemenin (yani, bir boyutlandırma x 2 nişastalı metanol süspansiyonları x 2 ekstrakt)28. Böylece, biyolojik çoğaltma örnekleri, en azından sweetpotato nişastası için ikiye düşürülebilir. Değiştirilebilen veya ayarlanabilen diğer adımlar ve teknik parametreler, yordamdaki adımların veya belirli parametrenin her birinin altında özellikle belirtilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Kooperatif Tarım Araştırma Merkezi ve Prairie View A&M Üniversitesi Tarım ve İnsan Bilimleri Koleji Entegre Gıda Güvenliği Araştırma Merkezi tarafından desteklenmektedir. Hua Tian'a teknik desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
