Summary
Aquí, describimos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para visualizar estructuras retinianas y oculares in vivo en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía.
Abstract
La tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) es útil para visualizar estructuras retinianas y oculares in vivo. En la investigación, SD-OCT es una herramienta valiosa para evaluar y caracterizar los cambios en una variedad de modelos de enfermedades y lesiones retinianas y oculares. En modelos de degeneración retiniana inducida por luz, SD-OCT se puede utilizar para rastrear el adelgazamiento de la capa de fotorreceptores a lo largo del tiempo. En modelos de glaucoma, SD-OCT se puede utilizar para controlar la disminución de la capa de fibras nerviosas de la retina y el grosor total de la retina y para observar las ventosas del nervio óptico después de inducir hipertensión ocular. En roedores diabéticos, SD-OCT ha ayudado a los investigadores a observar la disminución del grosor total de la retina, así como la disminución del grosor de capas retinianas específicas, particularmente la capa de fibra nerviosa de la retina con la progresión de la enfermedad. En modelos de miopía en ratones, SD-OCT se puede utilizar para evaluar parámetros axiales, como los cambios de longitud axial. Las ventajas de SD-OCT incluyen imágenes in vivo de estructuras oculares, la capacidad de rastrear cuantitativamente los cambios en las dimensiones oculares a lo largo del tiempo y su rápida velocidad de escaneo y alta resolución. Aquí, detallamos los métodos de SD-OCT y mostramos ejemplos de su uso en nuestro laboratorio en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía. Los métodos incluyen anestesia, imágenes SD-OCT y procesamiento de las imágenes para mediciones de espesor.
Introduction
La tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) es una modalidad de imagen precisa y de alta resolución que permite a los médicos e investigadores examinar las estructuras oculares de forma no invasiva. Esta técnica de imagen se basa en la interferometría para capturar imágenes retinianas tridimensionales in vivo a escala micrométrica 1,2. Se ha convertido en una de las modalidades de imagen más utilizadas en la investigación de la visión y en la clínica debido a la fácil detección y precisión de características patológicas como defectos estructurales y / o adelgazamiento de las capas retinianas y el líquido subretiniano3. En la investigación con modelos animales de trastornos relacionados con la visión, SD-OCT ha proporcionado análisis no invasivos esenciales de las relaciones entre estructura y función y sus orígenes histopatológicos4. Debido a su resolución (hasta 2-3 micras, dependiendo de la profundidad en el ojo5), SD-OCT tiene la capacidad de detectar incluso pequeños cambios en el grosor de la capa retiniana. Este tipo de análisis puede proporcionar información esencial para la progresión de la enfermedad y evaluar la eficacia de los métodos y tratamientos neuroprotectores para los trastornos relacionados con la visión.
SD-OCT es una alternativa no invasiva para examinar la estructura histológicamente, y se ha demostrado que los dos están correlacionados6. Si bien SD-OCT no alcanza la resolución celular, sí permite estudios longitudinales en animales. Esto es ventajoso porque la progresión de la enfermedad se puede rastrear en animales individuales a lo largo del tiempo en lugar de tener que sacrificar animales en puntos de tiempo específicos. A medida que las técnicas de imagen continúen mejorando, la tecnología SD-OCT también progresará, proporcionando una calidad de imagen mejorada, así como la capacidad de evaluar procesos biológicos como la función de los vasos sanguíneos de la retina con gran detalle. Incluso desde su llegada en 1991, la tecnología SD-OCT ha experimentado enormes avances en resolución, velocidad y sensibilidad7.
El presente estudio utiliza un sistema SD-OCT para cuantificar los cambios en las capas de la retina en modelos de roedores de degeneración retiniana, glaucoma y retinopatía diabética. El sistema SD-OCT utilizado aquí es un sistema OCT de dominio de Fourier que utiliza luz infrarroja cercana de baja potencia para adquirir, procesar y almacenar imágenes resueltas en profundidad en tiempo real. El sistema SD-OCT tiene una capacidad de imagen de profundidad extendida en la banda de longitud de onda de 800 nm, proporcionando una profundidad de 8 mm y una resolución de 4 μm. En la detección de dominio de Fourier, la señal de interferencia entre la luz dispersa del tejido y una trayectoria de referencia se transforma de Fourier para construir exploraciones axiales y/o perfiles de profundidad axial de intensidad dispersa8. Para los estudios aquí, el haz OCT se escanea sobre la estructura retiniana deseada mientras se adquieren escaneos axiales en serie. Normalmente, un patrón de escaneo adquiere la cuadrícula bidimensional (B-Scans) como una colección de líneas de escaneo lineales unidimensionales (A-Scans), que corresponden a imágenes transversales 2D utilizando un patrón de escaneo ráster. Para estudios centrados en la miopía en ratones, este sistema también se utiliza para medir las dimensiones de las estructuras oculares (por ejemplo, el grosor de la córnea, el grosor de la lente, la profundidad de la cámara vítrea y la longitud axial).
El sistema actual permite a los usuarios diseñar sus propios protocolos, creando escaneos que se pueden adaptar y seleccionar en función de las estructuras oculares de interés. Los escaneos principales presentados en estos protocolos definidos por el usuario hacen que esta técnica de imagen sea fácil de usar. Para el análisis de imágenes, hemos desarrollado una programación personalizada en un programa de modelado matemático. SD-OCT es una herramienta poderosa para identificar y cuantificar de forma no invasiva los cambios patomorfológicos en las estructuras oculares y monitorear la progresión de la enfermedad relacionada con la visión.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Asuntos de Veteranos de Atlanta y se ajustaron a la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publications,8ª edición, actualizada en 2011).
NOTA: El sistema SD-OCT utilizado para desarrollar el protocolo a continuación se describe en la Tabla de materiales. Si bien algunos de los procedimientos son específicos de este sistema en particular, el enfoque general puede adaptarse para otros dispositivos OCT y modelos animales. Además, en nuestro laboratorio, estos protocolos se usan comúnmente en ratones y ratas; sin embargo, el enfoque general se puede adoptar para diferentes modelos animales y dispositivos SD-OCT siempre que un individuo tenga la lente y las capacidades correctas en su dispositivo.
1. Configurar el equipo de tomografía de coherencia óptica
- Abra el software SD-OCT (Tabla de materiales).
- Defina quién está tomando la OCT, el estudio y el brazo de tratamiento (si corresponde). Nombra estas categorías de una manera que ayude a los investigadores a buscar los escaneos deseados más adelante durante el análisis de datos.
- En la pestaña Paciente/Examen , haga clic en Examinador de pruebas. Seleccione el nombre del examinador. Utilice el botón Configurar examinadores y médicos para agregar nuevos examinadores.
- Haga clic en Nombre del estudio para definir el estudio . Haga clic en la pestaña Estudio para agregar un nuevo estudio o modificar tratamientos en un estudio existente. Haga clic a la derecha de Seleccionar brazo de tratamiento para seleccionar un brazo de tratamiento .
- Haga clic en el botón Agregar paciente , que se utiliza para agregar un nuevo punto de tiempo para todo un grupo. Cuando aparezca la ventana, introduzca el número de identificación, el nombre y el apellido. Seleccione Hombre o Mujer. Introduzca la fecha de nacimiento.
- Haga clic en el botón Agregar examen para agregar las ratas individuales. Para identificar las ratas, haga clic en un examen. Haga clic en Editar examen. Introduzca el número de ID en el cuadro Introducir notas . Haga clic en el botón Guardar cambios .
- Conecte la lente adecuada al dispositivo (Figura 1B), seleccione la configuración correspondiente en el software y marque la posición del brazo de referencia asociada.
NOTA: El sistema SD-OCT descrito tiene lentes personalizadas, patrones de escaneo preestablecidos y configuraciones de brazo de referencia específicas para la especie animal y la región del ojo que se está fotografiando (retina o córnea, ratón o rata). Algunos de estos detalles son específicos del sistema SD-OCT descrito (ver tabla de materiales). Por ejemplo, no todos los dispositivos ofrecen ajuste manual de la longitud de la trayectoria del brazo de referencia . - En la pestaña Paciente/Examen, haga doble clic en el examen resaltado para pasar a la pestaña Imágenes y comenzar a tomar imágenes o simplemente haga clic en la pestaña Imágenes. Si hay un escaneo predeterminado, haga clic derecho para eliminarlo.
- Cargue un protocolo de análisis preestablecido haciendo clic en el botón Seleccionar un protocolo de la lista . Alternativamente, agregue escaneos individuales.
- Para modelos de ratas de glaucoma y retinopatía diabética y modelos de ratón de degeneración retiniana, elija un ajuste preestablecido que consta de cuatro imágenes: 2 exploraciones de OD y 2 exploraciones de SO. Para la miopía del ratón, elija un ajuste preestablecido que consta de 8 imágenes: 4 OD y 4 escaneos del sistema operativo.
NOTA: Las imágenes predefinidas se explicarán con más detalle en la Sección 3. Esto es algo que cada laboratorio hace por sí mismo o con el fabricante durante la instalación in situ.
2. Anestesiar al animal
- Administrar anestesia.
- Anestesiar ratas con ketamina (60 mg/kg) y xilazina (7,5 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
- Anestesiar ratones con ketamina (80 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
- Espere hasta que los animales estén completamente anestesiados y no respondan al pellizco del dedo del pie.
- Administrar gotas de dilatación de la pupila (tropicamida al 1%). Espere a que las pupilas se dilaten antes de tomar imágenes.
NOTA: La dilatación de las pupilas aumenta el campo de visión, pero no es un requisito. También se deben usar gotas anestésicas locales (córnea) (0,5% de tetracaína) para adormecer el ojo si algo va a tocar el ojo (por ejemplo, si se aplican lentes de contacto o se usa una guía). Una guía es un dispositivo que se coloca sobre el cabezal de escaneo y ayuda a los principiantes a alinear el ojo y el cabezal de escaneo. - Después de anestesiar al roedor, coloque al roedor en un sistema de alineación de roedores que pueda rotar al animal en un espacio tridimensional (Figura 1A, 1C y 1D). Proporcionar soporte térmico.
NOTA: Actualmente, utilizamos sistemas de alineación de roedores para ratones y ratas diseñados y vendidos con el dispositivo SD-OCT. - Aplique líquido (por ejemplo, solución salina o lágrimas artificiales) para mantener los ojos lubricados. Asegúrese de que el ojo no se seque durante la obtención de imágenes para que las propiedades ópticas del ojo se mantengan entre las exploraciones (cuando la córnea está húmeda, la retina se puede ver claramente).
- Asegúrese de mantener la humedad en el ojo opuesto cuando escanee el primer ojo para que no se seque.
- Use una toallita de tareas delicadas para eliminar el exceso de solución salina justo antes de la obtención de imágenes, ya que demasiado o muy poco lubricante en el ojo afectará la calidad de la imagen.
NOTA: No se recomienda el uso de gel lubricante estéril durante la OCT, ya que puede interferir con las imágenes. Si es necesario, se puede usar gel lubricante estéril después del procedimiento. También se puede aplicar una lente de contacto para garantizar una humedad adecuada en el ojo durante toda la prueba. En nuestra experiencia, una lente de contacto no proporcionó una mejora notable en la calidad de la imagen, pero las lentes de contacto ayudan a reducir el riesgo de secado de la córnea durante la sesión de imagen.
3. Imágenes de OCT de roedores
- Comience con un ojo (OS u OD) e imagine el ojo contralateral después.
- Coloque al animal utilizando los dos movimientos de rotación del sistema de alineación de roedores, de modo que la mirada sea horizontal y mirando hacia abajo el eje de la lente OCT (Figura 1D).
- Use la OCT en modo de ejecución libre para orientar la retina para la recopilación de datos. Utilice el modo Aim (haciendo clic en el botón Apuntar ) inicialmente para una visualización continua de escaneos B horizontales y verticales en tiempo real.
- Mueva la cabeza de la exploración más cerca del ojo hasta que la retina sea visible (como las lentes de retina de ratón y rata son de enfoque fijo, mover la lente hacia el ojo se enfoca más profundamente en la retina). Luego use el sistema de alineación de roedores para ajustar la posición del animal hacia arriba / abajo y gire / gire para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro, haga que el escaneo horizontal sea horizontal y el escaneo vertical vertical (Figura 1A).
- Ajuste la distancia de trabajo de modo que la imagen de la retina sea plana y no curva.
- Ajuste la posición del brazo de referencia para mantener la imagen cerca de la parte superior de la ventana de visualización. Tenga cuidado de no empujar demasiado lejos o la imagen del ojo se volteará sobre sí misma.
- Imágenes de la retina
- Para los modelos de glaucoma, degeneración retiniana y retinopatía diabética: Defina una exploración de volumen que conste de 1000 x 100 x 1 (exploraciones A x B exploraciones x exploraciones B repetidas) para el promedio. En ratas, realice una exploración de volumen de 3 x 3 mm. En ratones, tome un escaneo de volumen de 1.5 x 1.5 mm.
- Centrar el nervio óptico en el acceso horizontal y vertical para que el escaneo de volumen esté en el centro. Tómese el tiempo para asegurarse de que la cabeza del nervio óptico esté en el centro de la gammagrafía y recta a lo largo de los ejes nasal-temporal y superior-inferior (Figura 2). Escanee y vuelva a centrar para asegurarse de que esté exactamente en el centro, si es necesario. Repita esta exploración según sea necesario hasta que la cabeza del nervio óptico esté centrada y alineada a lo largo de ambos ejes. Haga clic en el botón Instantánea para tomar una foto.
NOTA: Algunos dispositivos SD-OCT tienen la opción de manipular ópticamente la curvatura del ojo (por ejemplo, la imagen se aplana) ajustando la distancia del ojo desde la fuente de luz con el brazo de referencia. Recomendamos aplanar y centrar las imágenes cuando se toman medidas directas de espesor a través de las capas retinianas para mejorar la precisión a lo largo de la dirección anterior-posterior. - Haga clic en el botón Guardar para guardar la imagen.
- Realice una exploración radial centrada en la cabeza del nervio óptico que sea de 1000 x 4 x 20 (exploración A x exploración B x exploración B repetidas). Use exploraciones B repetidas para mejorar la claridad de la imagen del ojo o la retina, lo que ayudará a interpretar regiones del ojo o capas de la retina durante el análisis de datos.
NOTA: Nuevamente, en ratas esta exploración radial es de 3 mm, mientras que en ratones la exploración radial es de 1.5 mm. - Guarde la imagen.
- Repita los pasos 3.1 a 3.2.5 en el ojo contralateral.
- Mediciones de longitud axial
- Para proyectos que involucran imágenes de todo el ojo, como la miopía del ratón, tome tres escaneos de todo el ojo y un escaneo de retina para cada ojo. Elija un ajuste preestablecido que consista en una exploración radial que sea de 500 x 20 x 1 y abarque todo el diámetro del ojo.
NOTA: Este ajuste proporciona una imagen de toda la longitud del ojo del ratón desde la córnea hasta la coroides. - Centrar la mitad del ojo y la retina en el campo de visión. Realice tres exploraciones radiales (exploraciones oculares completas): una exploración lineal B de 1000 x 5 x 2 y dos exploraciones lineales B adicionales de 1000 x 5 x 2 en el mismo lugar. Guarde las imágenes.
- Después, si lo desea, amplíe y tome un escaneo de volumen o rectangular (escaneo de retina) similar a la descripción en 3.2 que consiste en escaneos de 1000 x 20 A x escaneos B. Guarde el escaneo de volumen.
- Repita los pasos 3.3 a 3.3.3 en el ojo contralateral.
NOTA: Las mediciones de longitud axial solo son posibles en ojos pequeños (ratón o más pequeños) ya que la ventana de imágenes de los sistemas actuales no es lo suficientemente grande como para capturar un ojo más grande.
- Para proyectos que involucran imágenes de todo el ojo, como la miopía del ratón, tome tres escaneos de todo el ojo y un escaneo de retina para cada ojo. Elija un ajuste preestablecido que consista en una exploración radial que sea de 500 x 20 x 1 y abarque todo el diámetro del ojo.
4. Pasos posteriores a la obtención de imágenes
- Almacene los datos guardados en una nube, lo cual es una buena práctica para la gestión de datos y permite un fácil acceso para su posterior análisis. Realizar análisis de datos con software personalizado desarrollado en un programa de modelado matemático (Tabla de Materiales).
- Retire al roedor del sistema de alineación de roedores y administre una inyección intraperitoneal de atipamezol (1 mg / kg para ratas y ratones) para revertir los efectos de la xilazina, de modo que el roedor se despierte más rápidamente.
- Permita que los roedores se recuperen en una almohadilla térmica a fuego lento. Administre gotas de solución salina adicionales según sea necesario. Devuelva a los roedores a la jaula de su hogar cuando hayan recuperado la deambulación completa.
- Cierre el programa y apague la OCT.
5. Post-procesamiento de imágenes OCT
- Procese las imágenes utilizando un software personalizado desarrollado en un programa de modelado matemático para satisfacer las necesidades específicas de OCT (por ejemplo, medir el grosor de las áreas de interés marcando manualmente las imágenes).
- Dependiendo del propósito de la imagen (retina de ratón, retina de rata o miopía/longitud axial), utilice uno de tres programas diferentes:
- Para procesar la retina, seleccione las exploraciones OCT que desea cargar. Primero, defina el centro de la cabeza del nervio óptico con un simple clic.
- Observe cómo el programa genera líneas verticales que definen distancias a cada lado de la cabeza del nervio óptico. Tenga en cuenta que en la retina de rata, estas líneas están a 0,5 mm y 1,2 mm de distancia del centro de la cabeza del nervio óptico, para un total de 4 líneas verticales que representan los ejes nasal-temporal e inferior-superior del ojo dependiendo de la exploración radial B actualmente analizada.
NOTA: En la retina del ratón, estas líneas verticales están a 0,25 mm y 0,5 mm del centro de la cabeza del nervio óptico. - Delinee las siguientes capas a lo largo de cada línea:
La capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL), la capa plexiforme interna (IPL), la capa nuclear interna (INL), la capa plexiforme externa (OPL), la capa nuclear externa (ONL), la membrana limitante externa (ELM), los segmentos internos/segmentos externos (IS/OS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y el grosor total de la retina.
NOTA: La exploración radial no suele tener etiquetas nasales/temporales y superiores/inferiores cuando se abre. Los escaneos pueden crearse de tal manera que tengan una orientación n / t y s / i, y esos escaneos en particular se analizan más adelante. - Después de que se haya delineado una imagen y se haya cerrado el programa, exporte estas mediciones a un software de hoja de cálculo para el análisis de datos.
- Utilice estos valores de longitud y grosor del paso 5 para hacer comparaciones entre grupos, por ejemplo, determinando si hay diferencias regionales (n/t/s/i) o cambios longitudinales.
- Para las mediciones de la retina, primero determine si hay alguna diferencia en el eje nasal-temporal e inferior-superior a las distancias de 0,5 mm y 1,2 mm.
NOTA: Si no se observan diferencias en los cuadrantes, las mediciones de 0,5 mm y 1,2 mm pueden promediarse juntas. Este es un enfoque similar para las exploraciones de retina de ratón solo a 0,25 mm y 0,5 mm. - Para estudios de miopía, utilice este programa para evaluar los parámetros oculares a lo largo del eje óptico del ojo. Abra el programa de modelado matemático. Primero, seleccione una imagen para cargar.
- Después de cargar la imagen, marque manualmente cada escaneo (escaneos radiales y B). Marque los bordes anterior y posterior de la córnea, el cristalino, la cámara vítrea y la retina, de modo que el programa calcule el grosor de la córnea, el grosor de la lente, la profundidad de la cámara anterior y vítrea, el grosor total de la retina, la longitud axial total.
- Después de marcar, salga del programa que solicita un menú de guardado. Guarde los valores delineados en un software de hoja de cálculo y promedie los tres escaneos separados juntos.
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Representative Results
SD-OCT se considera exitosa si se obtienen imágenes de alta calidad de tal manera que las dimensiones oculares se puedan medir de manera confiable. Aquí, una variedad de usos de SD-OCT se ilustran utilizando modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía.
En un modelo de degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD), la exposición a la luz brillante (10.000 lux) induce la degeneración de las células fotorreceptoras en la retina9. Las imágenes representativas de SD-OCT revelan una capa nuclear externa más delgada, que contiene los cuerpos celulares fotorreceptores, en las retinas de ratones LIRD BALB / c en comparación con ratones no dañados (control) (Figura 3A y 3B). Después de cuantificar el grosor de la capa retiniana, se observó una diferencia significativa entre los ratones no dañados y LIRD para el grosor total de la retina (Figura 3C), el grosor de la capa nuclear externa (Figura 3D) y el grosor IS/OS (Figura 3E).
Para modelar experimentalmente el daño glaucomatoso, utilizamos un modelo de hipertensión ocular (OHT)10. En resumen, las ratas noruegas marrones (n = 35) recibieron una inyección de solución salina hipertónica en la vena limbo de un ojo, mientras que el ojo contralateral sirvió como control interno11. Para los estudios de glaucoma, cuantificamos el grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL). Después de 8 semanas de OHT, observamos una remodelación distinta en la cabeza del nervio óptico, incluida la ventosa del nervio óptico (Figura 4A y B). Luego cuantificamos el grosor de RNFL y encontramos adelgazamiento de RNFL después de 8 semanas de OHT en comparación con las mediciones basales (Figura 4C).
Para modelar la retinopatía diabética, se utilizaron ratas Goto-Kakizaki, un modelo poligénico no obeso de diabetes que desarrolla hiperglucemia a partir de las 2-3 semanas deedad12,13. Las retinas de ratas Goto-Kakizaki y ratas Wistar (controles no diabéticos) se obtuvieron imágenes utilizando SD-OCT (Figura 5A y 5B). A las 6 semanas de edad, la RNFL y el grosor total de la retina se redujeron en ratas Goto-Kakizaki en comparación con las ratas Wistar en la retina central (datos no mostrados) y la retina periférica (Figura 5C y 5D). Las mayores diferencias se observaron en los cuadrantes inferior y temporal de la retina (Figura 5C&5D).
Para evaluar los modelos de ratón para la miopía, se midió la longitud axial en ratones Bmal1-/-. Bmal1 es un gen reloj de interés porque los ritmos circadianos pueden desempeñar un papel en el desarrollo de la miopía14,15. La longitud axial del ojo de ratón Bmal1-/- (Figura 6B) es visiblemente más larga que el ojo de tipo salvaje (Figura 6A) en las imágenes de la OCT. La cuantificación de la longitud axial confirma que los ratones Bmal1-/- tienen longitudes axiales significativamente más largas a los 84 días de edad (Figura 6C), lo que demuestra que la falta del gen del reloj contribuye al desarrollo de la miopía.
Este protocolo generó imágenes de estructuras oculares en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía. Las imágenes fueron de calidad suficiente para poder cuantificar las dimensiones oculares, incluida la capa nuclear externa, la capa de fibras nerviosas retinianas, el grosor total de la retina y la longitud axial. Los resultados mostraron que se podían observar diferencias significativas en las dimensiones de las estructuras oculares in vivo utilizando SD-OCT.
Figura 1: Configuración del equipo SD-OCT.
(A) Imagen del sistema de alineación de roedores y el cabezal de escaneo OCT. (B) Imagen de lentes OCT de rata y ratón. (C) Imagen del sistema de alineación de roedores ratón que ilustra su capacidad para moverse en el espacio de 3 dimensiones. (D) Primer plano del sistema de alineación de roedores, específicamente las perillas que controlan su movimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Escaneo de muestra SD-OCT.
Imagen de una exploración en vivo de la retina del ratón justo antes de tomar una exploración de volumen o radial. (A) representa la alineación nasal-temporal, mientras que (B) muestra la alineación superior-inferior. Una vez que las retinas en estas dos imágenes están rectas en sus respectivos planos verticales u horizontales y el nervio óptico está centrado en ambas imágenes, se procede a adquirir la imagen SD-OCT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Uso de SD-OCT para rastrear el adelgazamiento de la capa de fotorreceptores a lo largo del tiempo en un modelo de ratón de degeneración retiniana.
(A) Exploración SD-OCT representativa de una retina (control) no dañada de un ratón BALB/c. (B) Exploración SD-OCT representativa de una retina de un ratón BALB/c de degeneración retiniana inducida por luz (LIRD). (C-E) Cuantificación del espesor total de la retina (C), el espesor de la capa nuclear externa (ONL) (D) y el espesor del segmento interno / segmento externo (IS / OS) (E) en ratones no dañados y LIRD Balb / c. Media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Usando SD-OCT medimos una disminución en el grosor de la capa de fibras nerviosas retinianas y observamos ventosas del nervio óptico después de inducir hipertensión ocular en un modelo de glaucoma en ratas.
(A) Exploración SD-OCT representativa de una cabeza de retina y nervio óptico de un ojo de rata tomada antes de inducir hipertensión ocular (Línea de base: OHT). (B) Exploración SD-OCT de la misma retina de rata después de 8 semanas de OHT (modelo experimental de glaucoma). (C) Cuantificación del grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL) al inicio del estudio en comparación con los ojos OHT. Media ± SEM. Estos datos han sido modificados de Feola et al.11Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Uso de SD-OCT para observar la disminución del grosor total de la retina, así como la disminución del grosor de capas retinianas específicas en un modelo de rata de diabetes.
(A) Exploración SD-OCT representativa de una retina de una rata Wistar (control de tipo salvaje). (B) Exploración SD-OCT representativa de una retina de una rata Goto-Kakizaki (diabética). Capas retinianas: capa de fibras nerviosas retinianas (RNFL), capa plexiforme interna (IPL), capa nuclear interna (INL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear externa (ONL), membrana limitante externa (ELM), segmentos internos/segmentos externos (IS/OS), epitelio pigmentario de la retina (EPR) y grosor total de la retina (TRT). (C-D) Cuantificación de RNFL (C) y espesor retiniano total (D) en retinas Wistar y Goto-Kakizaki donde la línea central es la media y el área sombreada es el SEM para los cuatro cuadrantes (Sup, Superior; Temporal, Temporal; Inf: inferior; Nas, Nasal) de la retina periférica (a 1,2 mm de la cabeza del nervio óptico). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Esta figura ha sido modificada de Allen et al.13Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Uso de SD-OCT para evaluar la longitud axial en un modelo de ratón de miopía.
Imágenes SD-OCT de ojo entero de ojos de ratón de tipo salvaje (A) y Bmal1-/- (B) a los 84 días de edad. Los ojos de los ratones Bmal1-/- tienen una longitud axial significativamente más larga que los ojos de tipo salvaje (C). AL: longitud axial; RT: grosor de la retina; VCD: profundidad de la cámara vítrea; LT: grosor de la lente; ACD: profundidad de la cámara anterior; TC: grosor corneal. La línea vertical larga indica los límites de longitud axial (superior e inferior indicados por la línea horizontal) para el ojo de tipo salvaje. La flecha corta indica la marca de longitud axial posterior para el ojo Bmal1-/- . Media ± SEM. La línea central en el centro de cada imagen (A&B) es un artefacto de saturación vertical. Por lo general, se usa como guía para centrar el ojo, pero si la exploración está bien alineada, se puede hacer desaparecer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las imágenes de alta resolución de estructuras oculares in vivo permiten la evaluación de los cambios retinianos y oculares a lo largo del tiempo. En este protocolo, se demostró que SD-OCT captura diferencias en estructuras oculares in vivo en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía.
El aspecto más crítico a la hora de realizar SD-OCT es obtener una imagen clara de la retina u otra estructura ocular de interés. Es importante tomarse el tiempo para asegurarse de que la retina esté perfectamente centrada y tenga una excelente claridad. La respiración pesada del roedor puede dar lugar a imágenes ruidosas (en realidad se puede ver que la retina se mueve en la pantalla). Esto sucede a veces si un animal no está completamente inconsciente después de la administración de anestesia. Para evitar este problema, se pueden promediar varias exploraciones B para ayudar a visualizar dónde están los límites de las capas de la retina, y luego se puede analizar la mejor imagen de exploración B individual.
Otro error común es que el ojo está demasiado seco o demasiado húmedo. Esto se puede verificar fácilmente aplicando una gota adicional de solución salina, absorbiéndola con una toallita de laboratorio y evaluando si la imagen mejoró en claridad. Una consideración a tener en cuenta al marcar los espesores de la capa retiniana en las imágenes SD-OCT es cómo marcar el RNFL. Si bien es posible diferenciar entre RNFL y GCL en algunos PTU de roedores, a menudo estas dos capas son indistinguibles. Para mantener la coherencia, marcamos toda la región RNFL (RNFL + GCL, cuando es visible) como RNFL. Algunos estudios informan que el RNFL y el GCL son capas separadas o combinan el GCL y la capa plexiforme interna16,17,18, aunque esta investigación se realizó típicamente en humanos, que tienen ojos mucho más grandes que los roedores. La notificación del grosor de RNFL es más típica en estudios con roedores11,13,19,20. Otra cuestión importante es que cambios muy leves en el marcado pueden causar un cambio muy grande, especialmente en la miopía debido al pequeño tamaño de las estructuras que se miden. Por ejemplo, una diferencia de 6 μm en la medición es igual a una dioptría de cambio en el error de refracción21. Debido a que los cambios leves hacen una gran diferencia en la medición, la claridad de la imagen es crítica.
Una limitación de este protocolo, y de SD-OCT en general, es que se requieren medios oculares claros para una buena imagen. Por ejemplo, las lesiones corneales, las anomalías del cristalino y las cataratas pueden impedir que los usuarios obtengan imágenes claras. Este es un problema en la imagen de retinopatía diabética, en particular, ya que las cataratas se desarrollan comúnmente en roedores diabéticos22. Si la catarata u otro problema ocular es pequeño, a veces es posible maniobrar la cabeza de la exploración alrededor de ella. Para interrupciones oculares más grandes, las imágenes de OCT retiniana son imposibles de obtener. Estas retinas aún podrían investigarse mediante histología, ya que la histología retiniana no depende de medios oculares claros.
Otra limitación es el hecho de que las lesiones hiperreflectantes, como los exudados y las hemorragias, así como los principales vasos retinianos, dan lugar a la sombra de las estructuras retinianas subyacentes y, por lo tanto, se pierden detalles de la morfología subyacente. En un caso con membrana neovascular coroidea y retinopatía diabética/edema macular donde el grosor de la retina era superior a 400 μm, fue difícil discernir la patología subyacente y la coroides23. Además, SD-OCT solo se puede usar para evaluar el grosor en ubicaciones específicas. SD-OCT también tiene una profundidad de penetración limitada para obtener imágenes de la coroides y para obtener imágenes de ojos enteros (todo el ojo se puede visualizar en un ratón, pero no en animales más grandes). Otra limitación es que los marcadores fluorescentes u otros marcadores no se pueden usar con SD-OCT como con la oftalmoscopia láser de barrido (SLO). Sin embargo, los dispositivos SLO típicos no permiten la visualización de las capas de la retina en sección transversal con la misma facilidad que se observa con SD-OCT. Finalmente, la resolución con SD-OCT no es perfecta. Sin embargo, se ha mejorado mucho con respecto a la resolución disponible al inicio de SD-OCT y continúa mejorando con el tiempo.
En conclusión, las ventajas y la importancia de la técnica SD-OCT son que permite la obtención de imágenes in vivo de las estructuras oculares y el seguimiento cuantitativo de los cambios en las dimensiones oculares a lo largo del tiempo, y que realiza esta obtención de imágenes con una velocidad de exploración rápida. Debido a la alta resolución de SD-OCT, se puede utilizar para detectar diferencias sutiles que no son observables a simple vista (Figura 4 y Figura 5). Además, SD-OCT es una herramienta útil para medir múltiples parámetros del ojo en una serie de modelos de enfermedades y lesiones. Solo en este protocolo, SD-OCT se utilizó para medir el grosor de la retina en modelos de degeneración retiniana y retinopatía diabética, grosor de la retina y ventosas en un modelo de glaucoma y longitud axial en un modelo de miopía. SD-OCT también se puede utilizar para medir la curvatura corneal 24, evaluar los cambios retinianos después de una lesión cerebral traumática y por explosión 19,25,26, identificar patología en la degeneración macular relacionada con la edad 27 y monitorear la salud de la retina durante y después de las inyecciones oculares 28 y la colocación retiniana de dispositivos protésicos como implantes subretinianos 29. Se puede utilizar en otros modelos animales como musarañas arbóreas30 y primates no humanos31 también. SD-OCT también se puede utilizar para localizar la patología de la retina en función del cuadrante (superior, inferior, nasal, temporal) y la ubicación (central frente a periférico). Los futuros dispositivos SD-OCT lograrán una resolución aún mayor. Además, la angiografía OCT permite obtener imágenes de la microvasculatura retiniana y coroidea mediante la utilización de la reflexión de la luz láser de la superficie de los glóbulos rojos a medida que se mueven a través de la vasculatura retiniana32,33.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Premios de Desarrollo de Carrera del Servicio de Investigación y Desarrollo de Rehabilitación del Departamento de Asuntos de Veteranos (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) a RSA, Premio al Mérito (RX002615) y Premio al Científico de Carrera de Investigación (RX003134) a MTP, Premio de Desarrollo Profesional (CDA-2, RX002342) a AJF, EY028859 a MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Investigación para prevenir la ceguera y Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
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