Summary
여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.
Abstract
정량적 라이브 세포 이미징의 현대 접근법은 통계 및 계산 모델링을 사용하여 생물학적 과정을 분류하고 비교할 수 있게 함으로써 세포 생물학을 탐구하는 데 필수적인 도구가 되었습니다. 세포 배양 모형 시스템은 높은 콘텐츠 화상 진찰을 위해 중대하더라도, 세포 형태학의 높은 처리량 연구 결과는 전 생체 권양이 살아있는 유기체 내의 세포에서 찾아낸 형태학적 복잡성을 재구성에 제한된다는 것을 건의합니다. 따라서, 손상되지 않은 유기체 내의 살아있는 세포를 이미지화하기 위해 확장 가능한 높은 처리량 모델 시스템이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 동시 동기 전폭 단계 동안 배아 Drosophila 멜라노가스터 발달의 다중 타임랩스 비디오를 획득하기 위해 고함량 이미지 분석기를 사용하는 프로토콜이다. 싱크로나이즈드 블라스트르름은 전통적으로 생물학적 사건을 이미징하기 위한 훌륭한 생체 내 모델로 작용해 왔습니다. 그러나, 정량적 및 고처리량 접근법을 위한 상당한 수의 실험 복제를 얻는 것은 실험반복당 단일 배아의 이미징에 의해 노동 집약적이고 제한되었다. 여기에 제시된 화상 진찰 및 미세 주입 접근은 고함량 화상 진찰 시스템, 또는 자동화된 다중점 취득을 할 수 있는 어떤 반전된 현미경든지 에 맞게 적응하는 방법입니다. 이 접근은 단 하나 화상 진찰 세션 안에, 원하는 취득 요인에 따라서 6-12 태아의 동시 취득을 가능하게 합니다.
Introduction
지난 30년 동안, 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 화상 진찰 기술 및 분자 프로브에 있는 발전은 세포의 복잡성 그리고 내부 작동의 우리의 이해를 발전시켰습니다. 기술의 이 진입로와 함께 높은 처리량 이미징 데이터의 수집을 위한 ex vivo 세포 배양 모델의 사용에 더 큰 의존도가 있습니다. 세포 배양 모델은 미세 유체 시스템을 통한 미세 환경 제어 및 여러 세포를 동시에 이미지화하는 기능을 포함하여 몇 가지 장점을 제공하여 고처리량 스크리닝1,2에필요한 정량적 접근 방식을 사용할 수 있게 한다. 그러나, 세포 형태학 및 그 규제3,4,5에혼동효과를 내는 2차원 유리 또는 플라스틱 표면과 같은 형태학적 연구의 맥락에서 세포 배양 모델과 관련된 유의한 단점도있다. 이러한 효과 세포 형태를 조절 하는 생물학적 프로세스의 연구에 관해서 거짓 또는 오해의 소지가 데이터를 제공할 수 있습니다.
대안은 그대로 유기체6의맥락에서 세포 형태를 연구하는 것이었지만, 소수의 적합한 손상 유기체는 이미징을 통해 전체 유기체를 살아 있게 하는 데 어려움을 겪고 큰 다세포 유기체 내부의 이미징과 관련된 어려움으로 인해 높은 처리량 정량적 라이브 세포 이미징을 용이하게 합니다. 그 결과, 그대로 유기체에 있는 세포 생물학 연구 결과는 일반적으로 견본 크기를 크게 제한하는 시간 지남에 단 하나 유기체를 관찰에 집중했습니다. 또한, 이러한 원-동물-시간 제한은 라이브 이미징을 화면 형태로 사용하기 어렵고 비용이 많이 들게 하고 샘플 수가 일반적으로 너무 작기 때문에 정량적 분석 도구를 적용하는 기능을 제한합니다. 따라서, 고함량 기반 정량적 접근법에 사용될 수 있는 다세포 모델 유기체에 대한 필요성이 발생한다.
이 프로토콜은 플레이트 기반 고함량 이미징을 위해 Drosophila 배아를 조정하여 정량 적 분석을 위한 충분한 크기의 실험 샘플 크기를 생성합니다. 드로소필라 멜라노가스터는 일반적으로 첫 번째 모델 유기체로 알려져 있다. Drosophila를 이용한 연구는 유전 정보의 전송, 세포 신호 경로의 식별 및 배아 발달의 유전 적 요구 사항을 포함하여 세포 및 분자 생물학에 있는 돌파구로 이끌어 냈습니다7,8,9. 또한, 드로소필라 배아는 세포 분부10,11,12동안 생체 내 마이크로투룰 역학을 탐구하는 데 사용되어 왔다. 작은 분자와 분자 프로브를 전달하기 위하여 미세 주입의 사용은 생체13,14에서세포 프로세스를 탐구하기 위한 Drosophila 배아 발달을 특히 강력하게 만드는 측두광을 제공합니다. 그러나, 전통적인 화상 진찰 접근으로 실험 반복의 상당수를 생성하는 것은 극단적으로 노동 집약적이며 고처리량 화상 진찰 스크린 및 정량 분석에 있는 한정된 사용이 있습니다. 우리의 접근 방식은 일반적으로 단하나 세포 분석을 위해 예약된 고함량 분석기를 사용하고 초기 Drosophila embryo의 syncytium에서 생체 내 이미징 분석에 적응합니다.
이 프로토콜은 수집, 단계 및 마이크로 주입 Drosophila 배아를 수집하는 데 사용되었다( ER) 미토시스 동안 내도성 망상 (ER)의 형태변화를 구동 하는 메커니즘을 탐구하는 15. 많은 연구가 세포 주기 동안 ER의 동적 특성을 설명했지만16,17,18,19,ER 형태에 걸쳐 여러 동요의 효과를 비교하기 어려웠다. 세포 분열에 걸쳐 ER 형태학의 변화를 구동하는 구성 요소를 식별하기 위해,이 프로토콜에 나열된 방법은 초기 Drosophila 배아에서 피질 싱크량 분열을 사용하여 미토알 ER 재구성에 미세 tubules 및 기타 사이토셀레탈 인자의 역할을 조사하는 데 사용되었다. 함께 촬영, Drosophila 지역 사회 내에서 유전 적 혼란의 가용성, 개발 하는 동안 정확한 시간에 약물과 분자 프로브를 마이크로 주입 하는 능력, 그리고 Drosophila와 함께 작업의 저렴 한 비용 높은 처리량 이미지 기반 스크리닝에 매우 순종. 여기에 설명된 방법은 Drosophila 배아(20)를사용하여 생체 내에서 다양한 세포 및 발달 과정을 연구할 수 있다. 특히, 이 프로토콜은 Drosophila 태아 피질의 100 미크론 이내및 연장된 기간 에 걸쳐 생기는 생물학 사건을 공부하기 위하여 잘 적응됩니다.
Protocol
참고: 미디어 및 솔루션 레시피에 대한 표 1을 참조하십시오.
1. 라이브 분석을 위한 배아 수집 케이지 설정 및 유지 관리21
- 신선한 배아 컬렉션 케이지에 신선한 파리를 채웁니다.
참고: 시판되는 컬렉션 케이지를 권장하지만, 수집 케이지는 빈 플라이병(21)으로쉽게 제작할 수 있습니다.- 많은 강아지가 스테이지 p14에서 어두워지기 시작하면 성인 파리를 병에서 버리거나 옮기십시오. 20°C에서 알이 놓인 후 약 14일 후에 발생하며22일후에 발생한다.
- 강아지가 12-24 시간 동안 병을 부화하고 채울 수 있도록합니다.
- 신선한 파리를 작은 컬렉션 케이지로 옮기면 새가 탈출하지 못하도록 컬렉션 케이지 개통 위에 작은 깔때기를 사용합니다. 최대 3병을 결합하여 200~500마리의 파리를 포함하는 밀집된 케이지를 생산합니다.
- (파리를 기절시키기 위해) 단단한 표면에 플라이 병을 반복적으로 눌러 수집 케이지로 날아갑니다. 그런 다음 컬렉션 케이지 깔때기 위에 플라이 병을 열고 반전합니다. 열린 병을 컬렉션 케이지에 몇 번 탭하여 파리를 컬렉션 케이지에 떨어뜨립니다.
- 오픈 플라이 병을 플러그에 빠르게 내려 놓아 닫습니다. 깔때기에서 플러그로 오픈 플라이 병을 옮기는 동안, 파리가 두드리는 소스에서 기어 오르는 경향이 있는 병 개구부가 아래쪽으로 가리키는지 확인합니다.
- 플라이 케이지 개구부를 향해 깔때기를 누르고 케이지를 단단한 표면에 반복적으로 눌러 내부의 파리를 기절시하십시오. 즉시 깔때기를 제거하고 플라이 케이지 개구부에 신선한 포도 판을 고정합니다. 라벨 테이프를 사용하여 포도 판을 고정하십시오. 이 과정을 반복하여 최대 3병을 결합하여 인구밀도가 높은 컬렉션 케이지를 생성합니다.
참고 : 또는, 파리는 CO2 또는 다른 비행 수면 에이전트를 사용하여 마취 될 수있다; 그러나, 이것은 단계 1.2에서 적응 기간을 증가시킬 것이다.
- 24-48h의 새로운 컬렉션 케이지에 적응합니다. CO2 또는 다른 수면 제제가 사용된 경우 수집 케이지를 최소 48시간 동안 수용합니다.
- 컬렉션 케이지의 포도 판을 하루에 두 번 효모 페이스트가 들어 있는 신선한 접시로 교체하십시오.
- 5일마다 신선한 컬렉션 케이지를 설치합니다.
2. 이미징을 위한 배아 수집 및 준비
- 동기화된 발달로 배아 획득
- 컬렉션 케이지의 포도 판을 중앙에 효모 페이스트가 들어 있는 신선한 접시와 교환합니다. 파리가 1시간 동안 배아를 놓도록 허용합니다. 오래된 포도 접시를 던지다.
참고 : 파리는 그들을 놓기 전에 배아를 비옥하게 할 수 있습니다. 첫 번째 수집 판은 이러한 사전 개발 된 배아의 많은 포함됩니다. 파리가 먼저 오래된 배아를 덤프하도록 허용하면 배아 간의 발달 동기화가 향상됩니다. - 포도 판을 중앙에 효모 페이스트를 넣은 신선한 접시를 교환하고 파리가 10분 동안 배아를 낳게 합니다. 오래된 포도 접시를 던지다.
참고: 차가운 접시에 배아 개발을 늦추지 않으려면 사용 전에 포도 판과 효모 페이스트를 실온으로 데우세요. - 포도 판을 신선한 접시와 교환 (효모 페이스트없이) 오래된 포도 판을 저장, 그것은 이미징을위한 배아가있다. 필요한 경우 2.1.2 단계 및 2.1.3 단계를 반복하여이 케이지에서 배아를 계속 수집하십시오.
- 컬렉션 케이지의 포도 판을 중앙에 효모 페이스트가 들어 있는 신선한 접시와 교환합니다. 파리가 1시간 동안 배아를 놓도록 허용합니다. 오래된 포도 접시를 던지다.
- 나이는 30-45 분 동안 배아를 수집하여 이미지 syncytial 부문(23)에한다.
참고: 배아 발달에서 싱크로티알 블라스트론 스테이지를 이미지화하려면 배아를 90분 이내에 현미경으로 장착해야 합니다. 처음으로 이 프로토콜을 시도할 때, 단계 2.2에서 나이 배아10-20 분은 단계 사이 를 설정하는 추가 시간을 제공하기 위하여. - DI 물에서 표백제 50%를 가진 초코리오네이트 배아.
- 숙성된 배아는 2.2단계에서 140nm 체로 디워터로 포도판을 채우고, 배아를 페인트 브러시로 부드럽게 털어내고, 배아로 물을 140nm체(도 1A)로붓는다.
참고: 이것은 싱크대 또는 1,000 mL 비커를 통해 수행 할 수 있습니다. - 분출병을 사용하여 DI 물로 배아를 적극적으로 헹구는 다. 마른 종이 타월에 체를 블롯하여 배아를 건조시. 종이 타월에 물 자국을 남기지 않고 멈출 때까지 체를 블롯하십시오(그림1B).
참고: 다음 단계에서 표백제 치료가 효과가 없는 것으로 배아에서 모든 효모 페이스트를 제거합니다. - DI 워터(1:1 표백제: DI 워터)로 희석된 50% 표백제로 빈 10cm 접시를 채웁니다. 체를 50% 표백제에 담그고 2분 45초간 찍어보세요. 체가 50% 표백제에 닿자마자 스톱워치를 시작합니다. 첫 15s에서 50% 표백제 3-4x 안팎의 체를 배아덩어리(도 1C)를이별한다.
- 분출병을 사용하여 DI 물로 배아를 적극적으로 헹구는 다. 마른 종이 타월에 체를 얼룩으로 배아를 건조시. 5배(그림1D)에대해 격렬한 헹구기 및 얼룩 건조 공정을 반복한다.
참고: 이것은 chorion 위에 남은 것을 제거하기위한 가장 중요한 단계입니다. 전체 DI 분출 병을 사용하고이 단계에서 병의 절반을 사용합니다. - 페인트브러시(21)를 이용하여 체에서 10cm 포도판으로 말린 배아를전달(도 1E)
참고 : 수동 디클로리화는 표백제 장식(24)의대안으로 사용할 수 있습니다.
- 숙성된 배아는 2.2단계에서 140nm 체로 디워터로 포도판을 채우고, 배아를 페인트 브러시로 부드럽게 털어내고, 배아로 물을 140nm체(도 1A)로붓는다.
그림 1: 배아 비반향. (A)배아는 DI H20 물마병, 페인트 브러쉬 및 140 nm 체를 사용하여 수집하였다. (B)배아는 DI H20 분출병을 사용하여 격렬하게 헹구고 종이 타월 위에 마른 얼룩을 뿌립니다. (C)배아의 굴곡은 2분 45초(D) 배아를50% 표백하여 DI H20 물쓰레기 병을 사용하여 격렬하게 헹구고 종이 타월위에 마른 얼룩을 발휘하였다. 이것은 과잉 초리온을 제거하기 위하여 4 번 반복되었습니다. (E)배아는 페인트 브러시를 사용하여 10cm 포도판으로 옮겨졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 커버립을 위한 배아 장착
- 오버헤드 거위 목 조명이 장착된 스테레오현미경으로, 달걀 피커 도구를 사용하여 포도 판의 깨끗한 부분에 15-20 개의 배아 두 줄을 구성합니다. 전방 및 후방 에 대하여 동일한 방향으로 그들의 복부 측에 배아를 정렬합니다. 달걀 피커가 미세 팁 스테인레스 스틸 핀셋을 45° 각도로 구부리도록 합니다. D/V 배아 오리엔테이션을 검토하려면 캄포스 오르테가 외20을참조하십시오.
참고: 배아가 3.5단계에서 커버 슬립에 눌러 이미징을 위한 등쪽 표면을 노출하기 때문에 복부 표면이 포도 판에 앉는 것이 중요합니다. 등쪽 표면은 복부 표면보다 훨씬 더 평평하기 때문에 등쪽 표면을 이미징하면 단일 Z 평면 내에 존재하는 핵의 수가 증가합니다. - 75mm x 25mm 실리콘 스페이서 커버슬립을 준비합니다.
참고: 미리 준비할 수 있습니다. 여러 개의 커버립을 준비하고 슬라이드 상자에 보관하여 깨끗하게 유지합니다.- 75mm x 25mm 커버슬립의 윤곽을 1.6mm 두께의 실리콘 스페이서 시트에 추적하고 가위를 사용하여 실리콘 스페이서를 잘라냅니다(그림2A).
- 면도날을 사용하여 스페이서(그림2A)에서40mm x 15mm 인셋을 잘라냅니다.
- 스페이서를 커버슬립에 부착하고 노출된 커버슬립 글래스 인셋(도2A)을아래로 헵탄 접착제의 10 μL 을 줄입니다.
참고: 내려놓고 줄무늬를 두면 동일한 z 평면에서 이미징 배아를 보장합니다.
- 3.2.3 단계에서 heptane 접착제가 건조되는 동안, 3단계에서 배아를 포함하는 포도 판의 직사각형 부분을 잘라냅니다.
- 면도날을 사용하여 두 행의 배아 주위에 사각형(40mm x 15mm 보다 작은)을 자른다. 사각형을 아직 제거하지 마십시오.
- 첫 번째 사각형 옆에 두 번째 사각형을 잘라냅니다. 스테인레스 스틸 주걱의 직선 가장자리를 사용하여 두 번째 사각형을 제거합니다.
- 스테인레스 스틸 주걱의 직선 가장자리를 첫 번째 직사각형 아래에 조심스럽게 밀어 제거합니다(그림 2B).
- 3.5cm접시(도 2C)의외부 측에 배아로 포도 플레이트 컷아웃을 놓습니다.
- 스테레오현미경하에서, 준비된 커버슬립을 배아 위로 낮추고 두 행의 배아를 접착제에 부드럽게 누릅니다(도2D).
- 배아를 마이크로 주입하는 경우 4.1 단계로 건너 뜁니다. 마이크로 주입하지 않을 경우 단계 3.7계속.
- 실리콘 스페이서 (상단의 중간)를 1:1 - 할로카본 오일 700 : 할로카본 오일 27로 채우면 배아를 덮습니다.
- 커버 슬립이 움직이지 않도록 하고 객관적인 렌즈의 경로에 테이프를 놓지 않도록 4슬라이드 플레이트 어댑터의 하단 가장자리를 양면 테이프로 정렬합니다. 이 테이프는 매우 중요합니다. 커버슬립이 어댑터에만 있는 경우 인수 전체에서 이동합니다. 4 슬라이드 플레이트 어댑터에 커버 슬립을 장착합니다.
그림 2: 커버슬립 준비 및 마운팅. (A)75mm x 25mm 커버슬립의 윤곽선이 1.6mm 두께의 실리콘 시트에 추적되었습니다. 가위를 사용하여 윤곽선을 잘라냅니다. 40mm x 15mm 인셋은 실리콘 스페이서에서 절단된 다음 커버슬립에 장착되었습니다. 인세트의 중앙 아래로 15 μL을 줄입니다. (B)15-20배아 2열은 40mm x 15mm 미만의 지역에서 포도판상에 편곡된 후 면도기와 스테인리스 스틸 주걱을 사용하여 그 부위를 절단하였다. (C)포도판을 잘라 내어 빈 3.5 cm 접시 의 상단에 놓였다. (D)스테레오현미경하에서(A)로부터의 커버슬립이 낮아지고 배아가 접착제의 줄무늬에 붙어 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 배아 건조 및 마이크로 주입
- 커버슬립을 슬라이드 위에 놓고 다수 및 미세 주입 중에 커버슬립의 바닥이 더러워지는 것을 방지합니다.
참고: 커버 슬립은 슬라이드가 부착되지 않고 이미지화됩니다. 따라서 이미징에는 반전된 현미경이 필요합니다. - 방의 온도에 따라 5-10 분 동안 배아를 desiccate. 대표적인 결과에서 이미징에 사용되는 배아는 건조제(도3A)를통해 실리카 젤 비드의 1:1 층을 포함하는 챔버에서 20°C에서 7분 동안 건조시켰다.
- 탈수 직후, 1:1 - 할로카본 오일 700: 할로카본 오일 27로 배아를 덮습니다. 실리콘 스페이서를 맨 위쪽으로 채웁니다.
참고: 높은 점도 할로카본 오일과 낮은 점도 할로카본 오일을 혼합하는 것이 중요합니다. 순수 할로카본 오일 700(고점도)은 세포 주기 진행을 30분 후 적용으로 느려집니다. 할로카본 오일 700과 할로카본 오일 27의 1:1 혼합물은이 유물을 고정. - 주입제로 미세 주입 바늘을 적재한 다음 마이크로 인젝터에 하나를 장착하고 압력을 받아 열어 두습니다.
참고: 귀중한 시약으로 전체 분석 작업을 수행하기 전에 4.4 단계를 몇 번 연습하십시오. 이것은 미세 주입 과정에서 가장 어려운 단계입니다.- 확장 된 로딩 팁을 사용하여 2 μL의 주입제로 미세 주입 바늘을로드합니다. 하나의 미세 주입 바늘이 필요하지만, 2 또는 3 바늘을 준비하여 여분의 짐을 가까이 두는 것이 좋습니다.
참고: 확장된 로딩 팁에 대한 사양에 대한 재료 표를 참조하십시오. 마이크로 주입 바늘은 우리의 미세 주입 기술의 독특한 특성으로 인해 확장 된 적재 팁없이로드 할 수 없습니다, 이는 팁을 열기 전에 밀봉 및로드 바늘의 내부 공기 압력을 구축에 의존. - 마이크로 인젝터에 바늘을 장착하고 플런저를 팁 의 중간쪽으로 우울시합니다. 목표는 유리 모세관(도4A)의내부기압을 증가시키는 것이다.
참고: 미네랄 오일없이 플런저 미네랄 오일 기반 마이크로 인젝터를 사용합니다. 미네랄 오일로 압력을 구축하는 대신 플런저를 사용하여 기압을 구축하십시오. - 유리 바늘을 유리 슬라이드에 내리고 새로운 #9 면도기를 사용하여 바늘 끝을 열어 두십시오. 바늘을 45° 각도로 잘라 날카로운 열린 팁을 생성합니다. 주사는 바늘에서 흐르지 않고 팁의 바닥으로 흘러 내려가야합니다. 바늘 끝에 20 μL의 할로카본 오일을 조심스럽게 넣고 45°에서 다시 잘라냅니다. 인젝트는 빠르게 흐르기 시작해야 합니다.
- 플런저를 철회하여 즉시 공기 압력을 낮추지만 주사 사이의 배아 막으로 바늘이 막히는 것을 방지하기 위해 연속 유량을 유지합니다. (그림4B).
참고: 인젝트가 명확하다면, 할로카본 오일안팎의 미세 주입 바늘을 들어 올리고 스테레오현미경하에서 인젝트 액적에 대한 형성 속도를 관찰하여 인젝트 유량을 볼 수 있습니다. 한 번에 몇 번의 클릭으로 플런저를 우울하게 하여 기압을 조정한 다음, 할로탄소 오일안팎으로 미세 주입 팁을 찍어 새로운 물방울 포스트 조정을 위한 형성 속도를 확인합니다. - 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 시야 중앙에 배치한 다음 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 들어 올리고 그 아래에서 유리 슬라이드를 제거하십시오. 바늘은 지금 주입을 위해 보정됩니다.
- 확장 된 로딩 팁을 사용하여 2 μL의 주입제로 미세 주입 바늘을로드합니다. 하나의 미세 주입 바늘이 필요하지만, 2 또는 3 바늘을 준비하여 여분의 짐을 가까이 두는 것이 좋습니다.
그림 3: 탈수 챔버 다이어그램. (A)이것은 탈수 챔버의 다이어그램입니다. 챔버는 건조기층 위에 실리카 젤 구슬의 1:1 층으로 구성되어 있습니다. 탈수를 수행하기 위해 배아는 단일 웰 플레이트 뚜껑 위에 배치되었습니다. 건조 챔버는 7 분 폐쇄되었습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 마이크로인젝드 배아
- 미세 주입 바늘 아래에 스테레오 현미경 단계에 배아를 배치하지만 바늘을 낮추지 마십시오.
- 50배 배율로 배아에 집중하십시오.
- 그것은 배아와 같은 초점 평면에 올 때까지 바늘을 낮춥니다. 한 손으로 슬라이드를 이동하고 다른 손으로 마이크로 인젝터를 작동, 배아의 한 행을 주입.
- 바늘을 들어 올리고 슬라이드를 180° 회전하여 배아의 두 번째 행을 미세 주입 바늘에 노출시킵니다. 바늘을 낮추고 배아의 두 번째 행을 주입합니다.
참고: 10분 이내에 이 작업을 수행하십시오. 일부 주입되지 않은 배아는 대조군으로 사용하십시오.
그림 4: 미세 주입 바늘 제제. (A)이 그림에서바늘의 마젠타 강도는 기압을 대표한다. 적재된 바늘을 마이크로인젝터에 장착하고 플런저를 50% 연장하여 바늘 내부의 기압을 증가시켰다. 장착 하기 전에 플런서를 최대 로러 지 는지 확인 합니다. (B)바늘 끝은 압력하에서 절단되었고 플런저는 기압과 유량을 감소시키기 위해 철회되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 고함량 분석기에서 이미징
- 이 분석기를 실행하기 전에 슬라이드 어댑터에 대한 플레이트 맵을 만듭니다. 플레이트 맵 관리자 메뉴에 있는 플레이트 홀더 편집기를 사용하여 사용자 지정 플레이트 어댑터의 치수를 입력합니다.
참고: 상용 플레이트 어댑터용으로 맞춤 플레이트 맵이 만들어졌습니다(재료 표참조). 플레이트 맵에는 다음 설정이 포함되어 있습니다. 슬라이드 두께 : 1000 μm, 바닥 높이 : 1.607 mm, 바닥 높이 가변성 : 100 μm, 기판 재료: 유리, 커버슬립 두께: 150 μm, 커버슬립 위치: 바닥 – 행: 1 ~ 간격: 56.987 mm, 컬럼: 4 – 간격 28.391, 크기 및 모양: 직사각형, 너비 23.00 mm, 높이: 73.00 mm, A1 21.29 mm- 74 mm로 상쇄 - 현미경에 슬라이드 어댑터를 로드하고 미리보기 기능을 사용하여 커버슬립의 밝은 필드 10배 이미지를 타일로 장식합니다.
- 행의 위쪽 또는 하단에서 배아를 선택한 다음 목표를 선택하고 60x(NA 0.95)로 전환합니다. 원하는 형광 채널에 적합한 노출을 결정합니다.
참고: 라이브 셀 이미징의 경우 레이저 강도를 25% 미만으로 유지합니다. - 메인 대시보드에서 미리 보기 기능을 사용하여 두 배아 행을 모두 포함하는 형광 60x 이미지를 타일로 지정합니다.
- 메인 대시보드에서 비닝 드롭다운 메뉴를 선택하고 비닝을 1 x 1로 설정하여 최적의 해상도를 확인합니다.
- z 스택 설정 탭을 사용하여 z 스택에 대한 매개 변수를 정의합니다.
- z 스택 설정 탭에서 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 상단 및 아래쪽 z 스택 제한을 정의합니다. 상단 및 하단 제한이 정의되면 녹색 연필 아이콘을 선택하여 z 스택 위치를 저장합니다. 5.6.5 단계에서 사용되는 z 스택 위치를 유의하십시오.
- z 스택 설정 탭에서 z 단계 입력 상자는 z 슬라이스 사이의 간격을 정의합니다.
참고: 총 슬라이스 수는 5.6.1 및 5.6.2를 배양하여 결정됩니다. - 메인 대시보드에서 형광 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 모드 드롭 다운 메뉴를 사용하여 이미징 모드를 3D로 설정합니다.
- 기본 대시보드에서 레이저 자동 초점 상자를 선택하여 자동 초점을 비활성화합니다.
- 기본 대시보드에서 5.6.1 단계의 z 스택 위치로 초기 포커스를 정의한 다음 초기 포커스 상자를 선택하여"각 시간 지점에서 초점 재설정"기능을 비활성화합니다.
- 필드 탭에서 필드 배치 드롭 다운 메뉴를 사용하여 사용자 지정 점을사용하도록 설정한 다음 화살표를 사용하여 이미징을 위한 지점을 선택합니다.
참고: 인수(5.8단계) 간의 시간 간격은 동시에 이미지화할 수 있는 사용자 지정 포인트 수를 결정합니다. - 타임 시리즈 탭에서 타임 시리즈 피쳐를 사용하도록 설정하려면 구매 타임 시리즈 상자를 선택한 다음 총 시간 점을 정의합니다.
참고: 6 사용자 지정 점 x 5 z 슬라이스 x 80 스택 = 2,400 개의 이미지, 이미지 당 2,400 이미지 x 8.2 MB = 19.68 GB 디스크 공간. - 기본 대시보드에서 이름 입력 상자를 사용하여 획득 설정의 이름을 지정한 다음 파일 및 저장을 선택하여 획득 설정을 저장합니다.
- 메인 대시보드에서 스캔 버튼을 선택하여 인수를 실행합니다.
6. 포스트 이미지 처리
- Xdce 파일을 피지에 드래그하고 놓아 이미지 시리즈를 다차원 하이퍼스택으로 엽니다.
- 하이퍼스택을 tif 파일로 저장합니다.
- 최대 강도 투영을 만들고 tif 파일로 저장합니다.
- 최대 강도 투영 라이브러리를 조립하고 데이터 추출 및 분석을 위한 파이프라인을 구축합니다.
Representative Results
이 프로토콜에 제시된 접근은 Drosophila 태아(15)에있는 미토시스 도중 풍요로움 Reticulum (ER) 재구성에 있는 microtubules의 역할을 검토하기 위하여 이용되었습니다. 미토시스 동안 ER의 구조는 극적인 재구성을 표시하지만 이러한 변화를 유도하는 힘은 제대로 이해되지 않습니다. 최근에는 ER 성형 단백질의 가족이28마이크로투부(28)와가까운 근접성으로 알려진 ER 튜블러25,26,27,28의형성을 촉진하는 것으로 나타났다. ER 형태학에 대한 미세 투부의 롤을 연구하기 위해 프로토콜에 제공된 방법은 미토시스 중 ER 재구성에 대한 여러 미세 주입 약물 치료의 효과를 정량적으로 비교하기 위해 데이터를 생성하는 데 사용되었습니다. 새로운 미세투불 중합화를 방지하는 콜시친은 도 5 및 도 6에도시된 바와 같이 미토시스 중 ER의 재구성을 대폭 감소시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 여기에서 기술된 접근은 32개의 태아를 위한 시간 바퀴 화상 진찰 데이터의 생산을 가능하게 했습니다. 평균 및 최대 강도 측정은 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용하여 관심의 12,800 지역에서 생산되었다, 이는 또한 약물 치료 사이의 비교를 만들기위한 필수적인 설명과 감염 통계를 생성. 분자 프로브의 가용성과 미세 주입의 용이성으로 인해, 여기에 설명된 방법은 형광 강도 정량화를 통해 다양한 생물학적 과정을 연구하기 위해 쉽게 적응할 수 있다.
그림 5: 미토시스 중 스핀들 폴에서 Rtnl1-GFP 및 ReepB-GFP 농축의 대표적인 이미지. (A)세포 주기 10에서 미토시스 중 ReepB-GFP의 60x 필드. 파란색 사각형은 패널 B-E에 사용되는 뷰 필드를 나타냅니다. 패널 A는 임계값 이진 필터로 처리됩니다. 이 필터는 설정된 임계값 미만의 픽셀에서 데이터를 제외하기 때문에 패널 B-E에 적용되지 않았습니다. (B,D) ReepB-GFP제어, 콜시친. (C,E) Rtnl1-GFP제어, 콜시친. 이 그림은 디아즈 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 미토시스 중 스핀들 폴에서 Rtnl1-GFP 및 ReepB-GFP 농축량. 10프레임에 걸친 20개의 스핀들 및 20개의 세포질 ROI는 다음 조건에서 32개의 배아를 위해 분석되었다. (A)Rtnl1-GFP. 대조군 배아에 대한 10% DMSO 대조군 주사는 비주입 시료에 비해 농축(T210의 모든 샘플에 대한 p&0.001)의 0.1배 증가를 보였다(T210의 모든 샘플에 대해 p&001). (B)ReepB-GFP 배아를 10% DMSO로 주입하여 대조군역할을 한다. 대조군 배아는 비주입 샘플에 비해 농축(T210의 모든 샘플에 대한 p&0.001)의 0.1배 증가를 보였다(T210의 모든 샘플에 대해도 1E;p&t&001). (C)5 μM 콜시친을 주입한 Rtnl1-GFP 배아. 여기서 우리는 대조군 (A)에 비해 스핀들 (P & T210의 모든 샘플에 대한 0.001)에 Rtnl1-GFP 농축의 감소를 측정 (P & 0.001 T210에서 모든 샘플에 대한). (D)5 μM 콜시친을 주입한 ReepB-GFP 배아. 우리는 제어 (B)에 비해 스핀들 (T210의 모든 샘플에 대한 p&0.001)에 ReepB-GFP 농축의 감소를 측정 (P&0.001 T210에서 모든 샘플에 대한). 이 그림은 디아즈 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1. 효모 페이스트21 | 2. 포도 접시21 | 3화 헵탄 접착제24 |
| 1.1 활성 건조 효모 7 그램을 원식 50ml에 넣습니다. 디 워터 9밀리리터를 넣고 금속 주걱으로 균등하게 섞습니다. | 2.1 솔루션 만들기: 250ml 플라스크에 140ml의 DI 물에 6그램의 한고를 넣고 오토클레이브를 만듭니다. | 3.1 유리 반짝임 유리병을 50인치 양면 테이프로 채웁니다. |
| 1.1 활성 건조 효모 7 그램을 원식 50ml에 넣습니다. 디 워터 9밀리리터를 넣고 금속 주걱으로 균등하게 섞습니다. | 2.2 용액 만들기 b: 에탄올 2ml에 메틸 파라벤 0.1 그램을 섞은 다음 이 솔루션을 60ml의 자몽 주스 농축물에 추가합니다. | 3.2 헵탄 20ml를 넣고 파라필름으로 유리 신발바이알을 밀봉합니다. 실온에서 하룻밤 동안 회전합니다. |
| 2.3 오토클레이브 용액 직후, 용액 b에 섞어서 혼합물을 10 x 35mm 퍼티 접시에 붓습니다. (포도 접시 35개) | 3.3 접착제를 2 15ml 원물 튜브로 옮기고 3000 RPM에서 15분 동안 원심분리하여 플라스틱 테이프 이물질을 제거합니다. | |
| 2.4 포도 판을 플레이트 뚜껑을 닫고 밤새 실온에서 놓도록 허용합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 놓은 후 4C°로 보관하십시오. | 3.4 접착제 상체를 1.5ml 마이크로 센심 분리기 튜브로 이송하여 보관합니다. |
표 1: 미디어 및 솔루션 레시피.
Discussion
여기에서 기술된 프로토콜은 Drosophila 배아 발달에 있는 각종 단계에서 생물학 사건을 공부하기 위한 높게 다재다능하고 쉽게 적응합니다. 이 프로토콜은 오랜 기간 동안 발생하는 생물학적 과정을 연구하는 데 적합합니다. 예를 들어, 세포화29,30 또는 Drosophila31에서이종학로마티닌 도메인의 형성에 대한연구는,32이러한 프로세스가 오랜 기간 동안 발생하기 때문에 이 프로토콜에 설명된 방법을 활용하는 혜택을 누릴 수 있다. 또한, 시료 크기는 확대를 감소시켜 확대하여 확대하여 동기화부(33) 또는 위화기간(34)의타이밍과 같은 광학 적 분해능이 덜 필요한 질문을 연구할 수 있다. 마찬가지로, 20배의 목적은 두 개의 배아가 하나의 이미징 평면 내에서 촬영될 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 방법은 배아 발달을 정량적 분석을 위한 모델 시스템으로 서생물학적 질문을 하는 동적 플랫폼을 제공합니다.
이 프로토콜에는 3개의 중요한 단계가 있습니다. 50%의 표백제에서 후불양은 배아가 5배(2.3.4)로 격렬하게 헹구고 건조하는 것이 필수적이다. 이 단계는 남은 작은 초리온 조각을 제거합니다. 남은 초리온은 배아를 이미징 할 때 시야를 방해할 것입니다. 유리 커버슬립(3.5)에 배아를 장착할 때, 배아를 균일한 압력으로 접착제에 눌러야 한다. 이것은 같은 z 평면에 배아를 배치합니다. 미세 주입 바늘을 열 면, 바늘의 유량을 조정 하기 위해 플런저를 즉시 철회 하는 것이 중요 하다 또는 모든 주입을 잃게 됩니다.
우리의 연구는 두 가지 요인에 의해 제한되었다. 첫 번째 요소는 자동화된 세분화 프로세스가 없는 것이었습니다. 그러나 MATLAB을 사용하여 수동 세분화 스크립트를 설계했습니다. 유전적으로 인코딩된 스핀들 마커를 사용하면 이 과정이 자동화될 수 있습니다. 미래에 우리는 CNN-RFP21,Rtln1-GFP 및 CNN-RFP를 생산하고 싶습니다. ReepB-GFP 형질 화선은 자동화된 스핀들 세분화를 가능하게 합니다. MATLAB 스크립트 및 분석 파이프라인에 대한 자세한 내용은 Diaz 외15의보충 자료를 참조하십시오. 둘째, 우리는 또한 35s의 우리의 취득 간격에 의해 제한되었습니다, 이는 우리가 단지 6 개의 배아를 동시에 이미지할 수 있었습니다. 더 긴 획득 간격을 통해 더 많은 배아를 동시에 이미지화할 수 있습니다. 약물 전달 처리량은 투과 단계로 미세 주입을 대체하여 증가 할 수 있지만, 우리는 우리의 샘플 크기가 이미 취득 간격에 의해 제한되었기 때문에 이것이 불필요하다는 것을 발견했습니다.
이 프로토콜은 Drosophila 배아 발달을 이미지하기 위하여 이용되었지만, 전반적인 접근은 C. elegans,성게 및 제노푸스와같은 그밖 다세포 모형 시스템에서 배아 발달을 공부하기 위한 적응성이 있습니다. 배아는 수집 또는 수정을 통해 쉽게 동기화되기 때문에 정량 분석에 매우 유용합니다. 또한 배아는 시야에서 이동하거나 수영하지 않아 간단한 멀티포인트 획득 가능한 소프트웨어를 사용하여 정량적 분석을 위한 여러 시간 경과 비디오를 생성할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 높은 함량 분석기를 사용했지만, 멀티 포인트 획득 할 수있는 모든 반전 현미경 시스템은 본원에서 언급 된 방법과 결합 될 수있다.
유사한 결과는 반전된 공초점 현미경을 할 수 있는 멀티포인트 획득을 사용하여 얻을 수 있다; 그러나, 높은 함량 분석기의 장점은 샘플 크기를 증가하여 시간에 덜 해결이 필요한 질문을 연구함에 따라 나타납니다. 높은 함량 분석기를 사용하는 것이 명백한 장점은 기존 시스템의 슬라이드 1개에 비해 4개의 개별 슬라이드를 동시에 이미지화할 수 있다는 점입니다. 각 슬라이드에 4개의 슬라이드와 40개의 배아의 전체 세트를 가진, 160개의 태아는 취득 간격이 프레임 사이 적어도 15 분 인 한, 몇 시간 동안 심을 수 있습니다. 고함량 분석기를 사용하는 또 다른 중요한 장점은 형광 강도 기반 측정에 필요한 외부 광원으로부터 샘플이 완전히 밀봉된다는 것입니다. 마지막으로, 연구에 사용되는 고함량 분석기는 5.5메가픽셀 CMOS 카메라를 탑재하여 60배율의 관대한 221.87 μm 시야를 제공합니다. 이 더 큰 시야를 통해 우리는 획득 지점당 배아의 절반을 이미지화할 수 있었습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
UD, WFM 및 BR은 국가 과학 재단 (NSF) 과학 기술 센터인 셀룰러 건설 센터가 보조금 계약에 따라 DBI-1548297의 지원을 받습니다. BR은 NSF 커리어 어워드인 1553695를 통해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
| 100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
| 250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
| 3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
| 4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
| ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
| Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
| Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
| Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
| Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
| DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
| Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
| Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
| Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
| Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
| Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
| Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
| Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
| Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
| W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
| Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
| EQUIPMENT | |||
| Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
| Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
| Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
| GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
| Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
| Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |
References
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