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Biology

लाइव बैक्टीरिया में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के FLIM-FRET माप।

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61602
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1, 2,3, 1, 1, 2,3, 1, 1,4
1Université de Strasbourg, Laboratoire de Bioimagerie et Pathologies, UMR CNRS 7021, 2Université de Strasbourg, UMR 7242, ESBS, 3CNRS, UMR 7242, ESBS, 4Groupe Méthode Recherche Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Summary

हम यहां FLIM-FRET माप का उपयोग कर लाइव स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में दो अत्यधिक अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन के बीच प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल बैक्टीरिया तनाव निर्माण, बैक्टीरिया स्थिरीकरण, इमेजिंग और पोस्ट इमेजिंग डेटा विश्लेषण दिनचर्या भी शामिल है ।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) कोशिकाओं में विभिन्न प्रमुख प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) के साथ संयुक्त लाइव कोशिकाओं में PPIs के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करते हैं । FLIM-FRET FLIM छवि के प्रत्येक पिक्सेल पर एक FRET दाता के फ्लोरेसेंस आजीवन क्षय को मापने पर निर्भर करता है, पीपीआई और उनके स्थानिक सेलुलर संगठनों के बारे में मात्रात्मक और सटीक जानकारी प्रदान करते हैं । हम यहां FLIM-FRET माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जिसे हमने पीपीआई की महत्वपूर्ण विशेषताओं का खुलासा करने के लिए तकनीक की गुणवत्ता और मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए अत्यधिक अलग कॉपी नंबरों के साथ व्यक्त किए गए दो इंटरैक्टिंग प्रोटीन के विशेष मामले में लाइव स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में पीपीआई की निगरानी के लिए आवेदन किया। यह प्रोटोकॉल पीपीआई लक्षण वर्णन के लिए सभी आवश्यक चरणों का विस्तार से वर्णन करता है - हाल ही में विकसित उपकरणों का उपयोग करके अंतिम विश्लेषण तक बैक्टीरियल उत्परिवर्ती निर्माणों से शुरू होना जटिल फ्लिम-एफआरटी डेटा की सीधी व्याख्या के लिए उन्नत दृश्य संभावनाएं प्रदान करता है।

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) कोशिकाओं में विभिन्न प्रमुख प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है1. पीपीआई की भूमिकाएं प्रोटीन संरचना, समानता कार्यों और कोशिकाओं में स्थानों के आधार पर भिन्न होती हैं2। पीपीआई की जांच विभिन्न तकनीकों के माध्यम से की जा सकती है3। उदाहरण के लिए, सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन पीपीआई की पहचान या पुष्टि करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकरण अपेक्षाकृत सरल, मजबूत और सस्ती तकनीक है। हालांकि, पीपीआई का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब बातचीत करने वाले प्रोटीन में कम अभिव्यक्ति का स्तर होता है या जब बातचीत केवल विशिष्ट वातावरण में क्षणिक या प्रासंगिक होती है। पी एरुगिनोसा में पाइवरडीन मार्ग के विभिन्न एंजाइमों के बीच होने वाले पीपीआई का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है कि सामान्य लोहे के सह-कारकों वाले दमन फर के दमन से राहत मिलती है ताकि पाइओवरडीन मार्ग के सभी प्रोटीनों की अभिव्यक्ति को सेल4,5, 6में व्यक्त किया जा सके। मार्ग के सभी प्रोटीन के लिए यह आम विनियमन उनकी बातचीत को बढ़ावा देने की उम्मीद सेल में समय पर अभिव्यक्ति में परिणाम है। आकार, प्रकृति, अभिव्यक्ति के स्तर और इस मेटाबॉलिक मार्ग के प्रोटीन की संख्या के शब्द में विविधता पुनर्गठित प्रणालियों में अध्ययन के लिए मुश्किल बना6। इसलिए अपने सेलुलर वातावरण में पीपीआई की खोज उनके मूल संदर्भ में प्रोटीन के जैविक कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

फ्लोरेसेंस सहित केवल कुछ ही तरीके जीवित कोशिकाओं में पीपीआई की खोज की अनुमति देते हैं7. विभिन्न फ्लोरेसेंस मापदंडों के बीच जिन्हें मापा जा सकता है, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (यानी, एक फोटॉन उत्सर्जित करने से पहले एक फ्लोरोफोर औसत समय अपने उत्साहित राज्य में रहता है) जीवित कोशिकाओं में पता लगाने के लिए सबसे दिलचस्प मापदंडों में से एक होने की संभावना है। फ्लोरोफोर का फ्लोरेसेस जीवनकाल इसके पर्यावरण के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होता है और इसलिए फ्लॉफोर परिवेश के बारे में फ्लॉवरोफोर परिवेशकेबारे में रासायनिक या भौतिक जानकारी प्रदान कर सकता है । इसमें फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफईआरटी) की उपस्थिति शामिल है जो फ्लोरेसेंस की एक "स्वीकार्यता" की उपस्थिति में हो सकती है जो फ्लोरेसेंस "दाता" की थोड़ी दूरी पर स्थित है। ऊर्जा हस्तांतरण दाता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम(चित्रा 1A)के महत्वपूर्ण छोटा में परिणाम है, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए सीधे जीवित कोशिकाओं में बना । फ्लिम इसके अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान कर सकता है कि कोशिकाओं में बातचीत कहां होती है7,8. यह दृष्टिकोण उन स्थितियों में पीपीआई की जांच के लिए बेहद शक्तिशाली है जहां दो बातचीत करने वाले भागीदारों के फ्लोरोफोरस के साथ लेबलिंग संभव है।

FRET होने के लिए - दो फ्लोरोफोरस के बीच की दूरी पर महत्वपूर्ण स्थितियों की आवश्यकता8,9है। दो फ्लोरोफोरस को 10 एनएम से अधिक एक-दूसरे से दूर नहीं होना चाहिए। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए FLIM-FRET प्रयोगों को डिजाइन करते समय चेतावनी दी जानी चाहिए कि दाता और फ्लोरेसेंस के स्वीकारकर्ता को बातचीत परिसर में एक दूसरे के करीब स्थित होने का मौका मिले। हालांकि यह विवश लग सकता है, यह वास्तव में एक सच्चा लाभ है क्योंकि FRET की दूरी-निर्भरता यह सुनिश्चित करती है कि FRET के दौर से गुजर रहे दो लेबल वाले प्रोटीन को शारीरिक रूप से बातचीत करनी होगी(चित्रा 1A)। कोलोकैलाइजेशन प्रयोगों में पीपीआई के बारे में स्पष्ट उत्तर प्राप्त करने में कठिनाइयां (दो कोलोकैलाइज्ड प्रोटीन जरूरी बातचीत नहीं कर सकते हैं) इसलिए FLIM-FRET का उपयोग करके एक मुद्दा नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: FLIM-FRET विश्लेषण सिद्धांत। FLIM-FRET बहुआयामी छवि के प्रत्येक पिक्सेल में इस विशेष स्थान पर दर्ज फ्लोरेसेंस क्षय के बारे में जानकारी होती है (#counts = चैनल टी में पता लगाया फोटॉनों की संख्या) । (क)फ्लिम छवि का शास्त्रीय प्रतिनिधित्व आमतौर पर एक झूठी रंग लाइफटाइम इनकोडेड 2डी छवि (बाएं) होती है। दाता के मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी - जैसा कि रंग पैमाने में बदलाव से देखा जाता है - FRET की उपस्थिति में देखा जा सकता है और इस स्थानिक क्षेत्र में पीपीआई की उपस्थिति के बारे में जानकारीपूर्ण है। (ख)यूआरटी होने के लिए दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकारकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रम के बीच ओवरलैप आवश्यक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

FRET के लिए एक दूसरी आवश्यकता यह है कि दाता के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकारकर्ता के अवशोषणस्पेक्ट्रा 8 (चित्रा 1B)ओवरलैप करना चाहिए । दाता की फ्लोरेसेंस उत्तेजन तरंगदैर्ध्य पर होनी चाहिए जो स्वीकारकर्ता के प्रत्यक्ष फ्लोरेसेंस उत्तेजन में बहुत कम योगदान देती है। फ्लोरोफोरेस के सभी संयोजन संभव नहीं हैं और हम इसके अतिरिक्त 2लिम-FRET व्याख्याओं10की सुविधा के लिए मोनोएक्सपोनियल फ्लोरेसेंस क्षय के साथ दानदाताओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं। फ्लोरेसेंस प्रोटीन के कई जोड़े इन आवश्यकताओं को पूरा करते हैं, जिसमें लोकप्रिय ईजीएफपी-एमएचरी कपल11 (उपलब्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन FRET जोड़े की पैलेट पर समीक्षा के लिए12,13)शामिल हैं।

FLIM-FRET एक FLIM छवि(चित्रा 1A)के हर पिक्सेल में एक FRET दाता के फ्लोरेसेंस आजीवन क्षय को मापने की अनुमति देता है । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम निर्धारित करने के लिए दो प्रमुख तकनीकें हैं जो अधिग्रहण और विश्लेषण में भिन्न होती हैं: आवृत्ति-डोमेन(एफडी) 14 और समय-डोमेन (टीडी)। टीडी फ्लिम अधिक व्यापक है और गेटिंग विधियों15,स्ट्रीक कैमरा16 या समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन काउंटिंग (टीसीएसपीसी) तकनीकों 8 सहित विभिन्न संभावित पहचान विन्यासों के साथ संयुक्त एक स्पंदित रोशनी का उपयोग करके कियाजाताहै। एफडी और टीडी दोनों तकनीकों के लिए, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम को सीधे मापा नहीं जाता है, लेकिन जीवनभर (ओं) या बातचीत की उपस्थिति का अनुमान लगाने के लिए मापा गया डेटा के विश्लेषण की आवश्यकता होती है। टीसीएसपीसी तकनीकों के लिए, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला विश्लेषण कम से कम वर्ग पुनरावृत्ति पुनः-convolutions का उपयोग करके एकल या बहु घातीय कार्यों के साथ क्षय को फिट करने पर निर्भर करता है जो अवशिष्टों के भारित योग को कम करता है।

अंत में, FLIM-FRET दोनों एकल फोटॉन या मल्टीफोटॉन उत्तेजन का उपयोग करके किया जा सकता है। नवीनतम में फोकल प्लेन से ऑटोफ्लोरेसेंस और फोटोडैमेज को कम करने जैसे कई फायदे हैं। मल्टीफोटोन उत्तेजन 8 मोटी 3डी नमूनों में काम करने पर भी एक लंबी उत्तेजन गहराई की अनुमतिदेताहै। इसके विपरीत, एकल फोटॉन उत्तेजन आमतौर पर अधिक कुशल होता है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो-फोटॉन अवशोषण क्रॉस सेक्शन17सीमित होते हैं।

यहां, हम पीपीआई की महत्वपूर्ण विशेषताओं का खुलासा करने के लिए तकनीक की गुणवत्ता और मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए प्रतियों की अत्यधिक अलग-अलग संख्याओं के साथ व्यक्त किए गए दो इंटरैक्टिंग प्रोटीन (पीवीडीए और पीवीडीएएल) के विशेष मामले में लाइव पी. एएआरजीनोसा में पीपीआई के फ्लिम-एफपीटी मापों के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। पीवीडीए और पीवीडीएल प्रोटीन पाइवरडीन बायोसिंथेसिस में शामिल हैं। पीवीडीए एक एल-ऑर्निथिन एन5-ऑक्सीजनेज है और एल-एन5-फॉर्माइल-एन5-हाइड्रोक्सीऑर्निथिन को एल-ऑर्निथिन से हाइड्रोक्सिलेशन (पीवीडा) और फॉर्मिलेशन (पीवीडीएफ)18से संश्लेषित करता है। पीवीडीएल एक गैर-रिबोसोमल पेप्टाइड संश्लेषण (एनआरपीएस) एंजाइम है जो चार मॉड्यूल से बना है। पहला मॉड्यूल myristic एसिड के acylation उत्प्रेरित करता है। दूसरा मॉड्यूल एल-ग्लू की सक्रियता और इसके संघनन को myristic-coA को उत्प्रेरित करता है । फिर, तीसरा मॉड्यूल एल-टायर अमीनो एसिड को संघनित करता है जिसे डी-टायर में आइसोमराइज्ड किया जाता है। अंत में, चौथा मॉड्यूल एक एल-डाब (Diaminobutyric एसिड) अमीनो एसिड बांधता है जो acylated tripeptide एल-ग्लू/डी-टायर/एल-ढाब6के रूप में । पीवीडीएल इस प्रकार पाइवरडीन अग्रदूत के तीन पहले अमीनो एसिड के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार है। पीवीडीए प्रोटीन की पीवीडीए प्रोटीन की बातचीत आश्चर्य की बात है क्योंकि पीवीडीएल, पीवीडीएआई और पीवीडीजे के विपरीत, एल-एन5-फॉर्माइल-एन5-हाइड्रोक्सीऑर्निथिन के लिए विशिष्ट मॉड्यूल नहीं ले जाता है। इस बातचीत से पता चलता है कि पाइवरडीन अग्रदूत बायोसिंथेसिस के लिए जिम्मेदार सभी एंजाइमों को बड़े क्षणिक और गतिशील बहु-एंजाइमीय परिसरों में व्यवस्थित किया जाता है19,20।

इस रिपोर्ट में हम विस्तार से बताते हैं कि मूल रूप से दो बातचीत eGFP और mCherry लेबल प्रोटीन व्यक्त जीवाणु उपभेदों का निर्माण कैसे करें । हम कुशल फ्लिम-वीआरटी सेल इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी और शर्तों का भी वर्णन करते हैं। अंत में, हम छवि विश्लेषण के लिए एक कदम-दर-कदम ट्यूटोरियल का प्रस्ताव करते हैं जिसमें हाल ही में विकसित उपकरण शामिल है जो जटिल फ्लिम-एफआरटी डेटा की सीधी व्याख्या के लिए उन्नत दृश्य संभावनाएं प्रदान करता है। इस रिपोर्ट के साथ, हम न केवल साहसी बल्कि अधिकांश जीवविज्ञानियों को यह समझाना चाहते हैं कि FRET-FLIM एक सुलभ और शक्तिशाली तकनीक है जो मूल सेलुलर वातावरण में सीधे पीपीआई के बारे में उनके सवालों का समाधान करने में सक्षम है।

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. दो पीसीआर (पीसीआर 1 और 3) डीएनए दृश्यों (पी एरुगिनोसा PAO1 के जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें) ७०० आधार जोड़े अपस्ट्रीम और उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक के साथ पी एरुगिनोसा जीनोम में प्रविष्टि स्थल के अनुरूप क्षेत्रों के नीचे की । नीले और हरे रंग में प्राइमर के लिए प्रतिबंध साइटों को जोड़ें और लाल(चित्रा 2)में प्राइमर के लिए mCherry के साथ एक ओवरलैपिंग अनुक्रम जोड़ें।
    1. EGFP के साथ सी-टर्मिनस पर लेबल वाले पीवीडीए के लिए, नीले रंग में प्राइमर द्वारा स्टॉप कोडन के सापेक्ष 700 बीपी क्षेत्र अपस्ट्रीम को बढ़ाना, और हरे रंग में प्राइमर के साथ स्टॉप कोडन युक्त 700 बीपी डाउनस्ट्रीम क्षेत्र को बढ़ाना।
    2. एमसीएचरी के साथ एन-टर्मिनस पर लेबल किए गए पीवीडीएल के लिए, 700 बीपी क्षेत्र को पीवीडीएल जीन के ऊपर बढ़ाना, जिसमें स्टार्ट कोडन भी शामिल है, जो नीले रंग में प्राइमर द्वारा है, और हरे रंग में प्राइमर के साथ 700 बीपी डाउनस्ट्रीम क्षेत्र को बढ़ाता है।

Figure 2
चित्रा 2: पीवीडीए-एमएचरी के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली पीसीआर रणनीति और प्लाज्मिड निर्माण का अवलोकन। विवरण के लिए पाठ देखें - पीवीडीए लोहे के अधिग्रहण में शामिल एक माध्यमिक मेटाबोलाइट, साइडरोफोर पाइवरडीन के बायोसिंथेसिस में शामिल एंजाइम को एन्कोड करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक के साथ लाल रंग में प्राइमर के साथ eGFP एन्कोडिंग डीएनए (शुरू और बंद codons के बिना) बढ़ाना ।
  2. पीसीआर के साफ कॉलम(सामग्री की तालिका)पर पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।
  3. समानाख्य अनुपात में पीसीआर उत्पादों को मिलाएं और पीसीआर 1 और 3 (चित्रा 2में हरे और नीले रंग) के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिबंध साइट के साथ प्राइमर का उपयोग करके एक दूसरी पीसीआर प्रदर्शन करें।
  4. एगर उठे-1x TAE (Tris-Base Acetate EDTA pH 8.0) जेल में पीसीआर उत्पाद माइग्रेट करें, इसी बैंड को काटें और पीसीआर क्लीन अप किट(सामग्री की तालिका) केसाथ एम्प्लिकॉन निकालें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  5. इसी प्रतिबंध एंजाइमों21का उपयोग कर पीसीआर एम्प्लिकॉन और pEXG2 प्लाज्मिड को पचाएं ।
  6. लिगेट प्लाज्मिड और 90 एनजी प्लाज्मिड और आणविक अनुपात 1:1 (प्लाज्मिड:डालें) का उपयोग करके टी 4 डीएनए लिगाज़ के साथ डालें।
  7. लिगेशन उत्पाद और TOP10 के 100 माइक्रोन मिलाकर रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं ई कोलाई TOP10 कोशिकाओं में प्लाज्मिड निर्माण को बदलें। 60 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस हीट शॉक के साथ आगे बढ़ने से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर सक्षम बैक्टीरिया/प्लाज्मिड मिश्रण को इनक्यूबेट करें। इसके बाद ट्यूब को 10 मिनट तक बर्फ पर रख दें।
  8. बैक्टीरिया में lysogeny शोरबा (एलबी) का 1 मिलियनल जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. एलबी एगर पर प्लेट 100 माइक्रोन बैक्टीरिया जिसमें 15 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामिसिन होता है।
  10. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया।
  11. कॉलोनी पीसीआर द्वारा डालने की उपस्थिति को स्क्रीन करें: एक अलग ट्रांसफॉर्मेंट कॉलोनी से, प्लाज्मिड पर संकरण प्राइमर युक्त पीसीआर मिश्रण में जोड़े जाने वाले बैक्टीरिया की एक मिनट की मात्रा को इस तरह से उठाएं कि एक एगरल्ड जेल (डीएनए पॉलीमरेज) पर उत्पाद चलाकर एम्प्लिकॉन की उपस्थिति का पता लगाया जा सके। पीसीआर के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही कॉलोनी से, 15 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामिसिन युक्त ताजा प्लेट पर बैक्टीरिया की एक छोटी मात्रा को अलग करने और प्लाज्मिड निष्कर्षण के लिए उपयोग किए जाने के लिए स्थानांतरित करें। अंत में, प्लाज्मिड(सामग्री की तालिका)को अलग और शुद्ध करें और अनुक्रमण द्वारा डालने को सत्यापित करें।
  12. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में 20% ग्लाइसरोल के साथ एलबी में प्लाज्मिड युक्त टॉप10 बैक्टीरिया स्टोर करें और 1.5 एमएल ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध प्लाज्मिड।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है

2. पी एरुगिनोसा के क्रोमोसोमल जीनोम में फ्लोरोसेंट टैग प्रविष्टि(चित्रा 3)

  1. पी एरुगिनोसा,TOP10 और ई. कोलाई सहायक बैक्टीरिया,22रात भर मिलाते हुए कक्षीय मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबायोटिक के बिना पौंड के 5 एमएल में हर एक हो जाना । ई. कोलाई TOP10 से प्लाज्मिड को पीएओ1 तनाव में स्थानांतरित करके और प्लाज्मिड को समरूप पुनः संयोजन द्वारा जीनोम में एकीकृत करके पी एरुगिनोसा के जीनोम में फ्लोरोसेंट टैग प्रविष्टि उत्पन्न करें। वेक्टर को उत्तेजित करने वाली एक दूसरी क्रॉसिंग-ओवर घटना इसी उत्परिवर्ती उत्पन्न करती है।
  2. बैक्टीरियल कल्चर के 600 एनएम (ओडी600 एनएम)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें और पी एरुगिनोसा (500 माइक्रोल, की बराबर मात्रा में मिलाएं ओडी600 एनएम = 1.0) ई. कोलाई TOP10 pEXG2 (500 μL, OD600 nm = 1.0) और ई. कोलाई HB101 pRK600 helper (500 μL, OD600 nm = 1.0) के साथ 1.5 mL माइक्रोट्यूब में।
  3. बैक्टीरिया को गोली मारने के लिए 9,300 x ग्राम पर 5 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: अपकेंद्रित्र गति को समायोजित करने के लिए अपकेंद्रित्र जी-बल को प्रति मिनट रोटेशन (आरपीएम) में परिवर्तित करने के लिए ऑनलाइन टूल का उपयोग किया जा सकता है।
  4. बैक्टीरियल पेलेट रखें और सुपरनेट को त्याग दें।
  5. एलबी के 50 माइक्रोल में बैक्टीरिया युक्त गोली को फिर से रीसुंड करें।
  6. एलबी एगर (37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट) के बीच में मिश्रण का एक स्थान (~ 50 माइक्रोन) प्लेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे को इनक्यूबेट करें।
  7. एलबी के 1 एमएल में बाँझ टीका लूप और रिसिपेंड के साथ जगह को स्क्रैप करें।
  8. ई को खत्म करने के लिए 10 μg/एमएल क्लोराम्फेनिकोल युक्त पौंड एगर पर इस बैक्टीरियल सस्पेंशन की प्लेट 100μL। कोलाई (ई. कोलाई TOP10 pEXG2 और ई. कोलाई HB101 pRK600 सहायक क्लोराम्फेनिकोल के प्रति संवेदनशील हैं, लेकिन पी एरुगिनोसा स्वाभाविक रूप से प्रतिरोधी है) और 30 μg/mL gentamicin और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिन इनक्यूबेट ।
  9. 1 मिलील्ब में एक कॉलोनी को फिर से रीसुपेंड करें और कक्षीय झटकों 4h के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. 9,300 x ग्राम पर 3 मिनट सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट के 950 माइक्रोन को त्यागें। एलबी के 50 माइक्रोन में गोली को फिर से खर्च करें और सुक्रोज युक्त और एनएसीएल के बिना एलबी एगर पर मिश्रण को अलग करें।
  11. रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  12. जेंटामिसिन संवेदनशीलता की जांच करने के लिए एलबी एगर और एलबी एगर पर 15 मिलीग्राम/एमएल जेंटामिसिन युक्त अलग-थलग कॉलोनियां स्पॉट करें ।
  13. पीसीआर कॉलोनियों (डीएनए पॉलीमरेज) द्वारा ईजीएफपी या मचेरी प्रविष्टि और विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके अनुक्रमण सत्यापित करें।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट टैग प्रविष्टि द्वारा पी एरुगिनोसा उपभेदों के निर्माण का प्रोटोकॉल। विवरण के लिए पाठ देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. पायोवर्डीन माप

  1. रात भर कक्षीय मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर पौंड के 5 एमएल में बैक्टीरिया उगाएं।
  2. अपकेंद्रित्र द्वारा गोली बैक्टीरिया, धोने और उन्हें एसएम के 5 एमएल में विकसित (Succinate माध्यम, संरचना: 6 ग्राम∙L− 1 K2एचपीओ4,3 ग्राम∙एल− 1 KH2पीओ4,1 ग्राम∙एल− 1 (एनएच4)2 एसओ4,0.2 ग्राम ∙एल−1 एमजीएसओ4,7 एच2ओ और 4 जी∙एल−1 सोडियम सोसिनेट के साथ पीएच को 7.0 में समायोजित किया गया है) रात भर कक्षीय झटकों के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर। एसएम एक लोहा-वंचित माध्यम है - लोहे की अनुपस्थिति आम तौर पर लोहे की उपस्थिति में दमित पायोवर्डाइन मार्ग के प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करेगी।
  3. ओडी600 एनएम को मापें और ताजा एसएम माध्यम में फिर से बैक्टीरिया को पतला करें ओडी600 एनएम = 0.1 पर और रात भर कक्षीय मिलाते हुए उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं।
  4. प्रत्येक नमूने में बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए OD600 एनएम उपाय।
  5. पी एरुगिनोसा संस्कृति के 100 माइक्रोन युक्त क्वार्ट्ज क्यूवेट तैयार करें और एसएम (900 माइक्रोल) के 1 एमएल तक पूरा करें। एसएम मीडियम (ब्लैंक) के 1 एमएल युक्त क्वार्ट्ज क्यूवेट तैयार करें।
  6. यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, अवशोषण चोटी के अधिकतम पर अवशोषण को मापें। पीएच 7.0 पर, पाइवरडीन का अधिकतम अवशोषण ~ 400 एनएम पर होगा। ई = 19 000 एम -1 ∙ सेमी-1 के 400 एनएम पर मोलर विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करकेबियर-लैम्बर्टकानून का उपयोग करके नमूने में पाइवरडीन (एपीओ फॉर्म) एकाग्रता का निर्धारण करें।
    नोट: पायोवर्डीन को ~ 0.1 से ~ 1 (यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर निर्भर करता है) से अवशोषण की सीमा में मात्रा निर्धारित की जा सकती है जिसमें अवशोषण रैकरली एकाग्रता के साथ बढ़ता है।

4. बैक्टीरिया संस्कृति और कोशिकाओं के लिए शर्तों PvdA, PvdL और PvdJ व्यक्त करने के लिए

  1. 1 दिन, बैक्टीरिया के उपयुक्त ग्लिसरोल स्टॉक से पौंड के 5 एमएल के साथ एक ट्यूब टीका और एक कक्षीय शेखर इनक्यूबेटर में २०० आरपीएम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर रात में बैक्टीरिया हो जाना ।
  2. दूसरे दिन, 3 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा पैलेट कोशिकाएं और सुपरनैंट को त्यागें।
  3. एसएम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से रीसुस्पेंड करें।
  4. एक बार 4.2-4.3 कदम दोहराएं और 30 डिग्री सेल्सियस 200 आरपीएम पर रात भर एसएम में बैक्टीरिया उगाएं।
  5. 3 दिन, पतला 1/10 ताजा एसएम में बैक्टीरिया संस्कृति ।
  6. एक ही परिस्थितियों में रात भर फिर से पतला बैक्टीरिया बढ़ना।
    नोट: पाइवरडीन की उपस्थिति नेत्रहीन पता लगाया जा सकता है के रूप में यह पीले रंग में रंग-हरे रंग बढ़ती मीडिया । इससे पता चलता है कि पाइवरडीन पाथवे के प्रोटीन की अभिव्यक्ति सक्रिय हो गई है और कोशिकाओं में रुचि के एंजाइम व्यक्त किए जा रहे हैं ।

5. एगरेग्डेड पैड की तैयारी(चित्रा 4)

  1. एक सपाट क्षैतिज सतह पर माइक्रोस्कोप ग्लास-स्लाइड रखें। प्रारंभिक स्लाइड के प्रत्येक पक्ष पर चिपकने वाले टेप की दो परतों के साथ सबसे ऊपर दो ग्लास-स्लाइड की व्यवस्था करें।
    नोट: चिपकने वाले टेप के साथ स्लाइड्स पर फैलने के लिए meleted agarose को रोकने के लिए तीन गठबंधन स्लाइड के बीच एक 1-2 मिमी जगह रखें ।
  2. पिपेट और ग्लास-स्लाइड पर 1% पिघला हुआ एगर उठी की 70 माइक्रोल की एक बूंद डालना। ऊपर से एक चौथी स्लाइड जोड़ें ताकि एगर उठी बूंद को समतल किया जा सके और धीरे-धीरे दबाएं। एक मिनट के बारे में रुको।
  3. ऊपरी स्लाइड से दूर ले लो और एक पिपेट के साथ एक पिपेट के साथ 3 से 4 स्थानों में बैक्टीरिया के 3 μL के बारे में agarose पैड पर विभिन्न स्थानों पर छोड़ दें।
  4. एक माइक्रोस्कोपी ग्लास कवरलिप के साथ कवर (उदाहरण के लिए एक 22x22 मिमी #1.5 मोटाई) ।
    नोट: दो फोटॉन उत्तेजन के साथ काम करने के लिए कवरस्लिप की चपटीता और मोटाई महत्वपूर्ण है। नियंत्रित वर्दी फ्लैटनेस और कम ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ सटीक कवर्लिप्स आमतौर पर एक अच्छा विकल्प होते हैं।
  5. ग्लास स्लाइड पर कवरस्लिप को सील करने के लिए पिघले हुए पैराफिन के साथ कवरस्लिप को ठीक करें। कवरस्लिप के चारों कोनों को ठीक करके शुरू करें।

Figure 4
चित्रा 4: एगर उठे पैड की तैयारी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6. एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ इमेजिंग

नोट: हम एक घर में निर्मित दो फोटॉन उत्तेजन स्कैनिंग उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, जिसमें 60x 1.2NA जल विसर्जन उद्देश्य डी-स्कैन फ्लोरेसेंस संग्रह मोड में संचालित होता है। दो फोटॉन उत्तेजन तरंगदैर्ध्य 930 एनएम पर सेट किया गया है। यह एक टीआई द्वारा प्रदान किया जाता है: नीलमणि लेजर (80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर, ≈ 70 एफएस पल्स चौड़ाई) 10-20 मेगावाट पर काम कर रहा है। फ्लोरेसेंस फोटॉन एक 680 एनएम शॉर्ट पास फिल्टर और एक 525/50 एनएम बैंड-पास फिल्टर के माध्यम से एकत्र किए गए थे, इससे पहले कि एक फाइबर-युग्मित हिमस्खलन फोटो-डायोड एक समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) मॉड्यूल से जुड़े करने के लिए निर्देशित किया जा रहा है । माइक्रोस्कोप ट्रांसमिशन फ्लोरेसेंस लैंप से भी लैस है। कई FLIM-FRET माइक्रोस्कोप अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और कई इमेजिंग सुविधाएं फ्लिम-FRET माप करने में सक्षम सेटअप से लैस हैं।

  1. नमूने में बैक्टीरिया के मोनोलेयर पर उद्देश्य को ध्यान केंद्रित करने और ब्याज के क्षेत्रों का चयन करने के लिए फ्लोरेसेंस लैंप का उपयोग करें।
  2. जांच करें कि उत्तेजन लेजर शटर बंद है और लेजर से आने वाली अवरक्त प्रकाश अवरुद्ध है और माइक्रोस्कोप में प्रवेश नहीं करता है।
    सावधानी: सावधान ध्यान और लगातार सतर्कता आईआर स्पंदित पराबैंगनीकिरण के साथ काम करने दिया जाना चाहिए के रूप में लेजर प्रकाश आंखों द्वारा नहीं देखा जा सकता है, लेकिन किसी भी और क्षणिक प्रत्यक्ष प्रदर्शनी या लेजर प्रतिबिंब बेहद हानिकारक हो सकता है और अपरिवर्तनीय आंख नुकसान पैदा करते हैं । माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग करने से पहले स्थानीय लेजर सुरक्षा प्रक्रियाओं और प्रशिक्षण का उल्लेख करें।
  3. उद्देश्य का सामना कर रहे कवरस्लिप के साथ मंच पर माइक्रोस्कोपी स्लाइड रखें।
  4. जांच करें कि फ्लोरेसेंस लैंप चालन है।
  5. ईजीएफपी क्यूब का चयन करने के लिए फिल्टर क्यूब बुर्ज को चालू करें और फ्लोरेसेंस लैंप शटर खोलें।
  6. माइक्रोस्कोप के आईपीस की ओर फ्लोरेसेंस लाइट भेजें।
    सावधानी:सुनिश्चित करें कि उपयुक्त फिल्टर प्रकाश पथ में निपटाए जाते हैं ताकि फ्लोरेसेंस लैंप से आने वाली प्रत्यक्ष उत्तेजन प्रकाश को त्याग दिया जा सके जो आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है।
  7. माइक्रोस्कोप घुंडी का उपयोग कर बैक्टीरिया पर उद्देश्य ध्यान केंद्रित।
  8. मोटराइज्ड स्टेज को नियंत्रित करने वाली जॉयस्टिक का उपयोग करके नमूना में रुचि के क्षेत्र का चयन करें
    नोट: ध्यान केंद्रित अत्यधिक फ्लोरोसेंट नमूने के साथ आसान है फ्लोरेसेंस को आंखों से सीधे देखा जा सकता है।
  9. FLIM-FRET माप के लिए 2PE लेजर के लिए उत्तेजन स्विच करें।
  10. फ्लोरेसेंस उत्सर्जन पथ को डिटेक्टर की ओर वापस भेजें।
  11. 930 एनएम लेजर के लिए डिक्रोइक क्यूब के लिए चयन करने के लिए फिल्टर क्यूब बुर्ज को वापस चालू करें।
  12. लेजर पावर को 20 10 मीटर तक सेट करें।
  13. ब्याज के क्षेत्र का आकार 30 माइक्रोन सेट करें। यह ऑपरेशन गैल्वो-मिरर को संचालित करने वाले वोल्टेज को समायोजित करता है और उनके आंदोलनों(चित्र 5)की सीमा को परिभाषित करता है।
  14. डिटेक्टर चालू करें और नमूना स्कैनिंग शुरू करें - स्कैनिंग को नियंत्रित करने वाले स्टार्ट और स्टॉप बटन सुरक्षा कारणों से लेजर शटर के उद्घाटन और समापन को भी नियंत्रित करते हैं और नमूने की फोटोब्लैचिंग(चित्रा 5)को सीमित करते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के इंटरफेस का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. यदि आवश्यक हो, तो माइक्रोस्कोप ठीक फोकस नॉब को थोड़ा आगे बढ़ाकर फोकस को समायोजित करें।
  2. कंप्यूटर इंटरफेस से बारीक मंच ले जाकर इमेजिंग के लिए देखने के क्षेत्र चुनें। यह सेटअप पर माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर(चित्रा 5)में छवि पर क्रॉस को स्थानांतरित करके किया जा सकता है जो छवि के नए केंद्र को परिभाषित करेगा और मूव स्टेज को दबादेगा। अधिग्रहण के लिए देखने का एक अच्छा क्षेत्र 10-30 स्थिर बैक्टीरिया के साथ एक छवि से मेल खाती है, सभी सही ढंग से ध्यान केंद्रित (सभी बैक्टीरिया एक ही विमान पर हैं)। यदि एकल कोशिकाओं FLIM-FRET डेटा निकालने में रुचि रखते हैं, सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया अच्छी तरह से व्यक्तिगत हैं (छवि विभाजन बहुत आसान हो जाएगा)।
  3. एसपीसीएम सॉफ्टवेयर (डेटा अधिग्रहण के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर) खोलें और जांचें कि फोटॉन काउंट रेट बहुत अधिक नहीं है ताकि पाइल-अप प्रभाव से बचा जा सके जो आजीवन माप को प्रभावित कर सकता है। यदि आवश्यक हो, तो फोटॉन काउंट रेट कम रखने के लिए लेजर तीव्रता को कम करें (लेजर पुनरावृत्ति दर का लगभग 1%)।
    नोट: पाइल-अप प्रभाव समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) उपकरणों के मृत समय के कारण उच्च फोटॉन गिनती दरों पर खो फोटॉन के प्रभाव का वर्णन करता है । यदि पाइल-अप होता है, तो मापा गया औसत जीवनकाल कृत्रिम रूप से कम हो जाता है, संभवतः एक अतिरिक्त छोटा घटक जो तेजी से उत्सर्जक फोटॉनों को ओवरसैंपलिंग के कारण क्षय में दिखाई दे सकता है।
  4. अधिग्रहण संग्रह समय सहित अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करें (आमतौर पर पर्याप्त फोटॉन एकत्र करने के लिए 60 एस से 180 एस की आवश्यकता होती है)।
  5. स्टार्ट बटन दबाएं और अधिग्रहण पूरा होने का इंतजार करें।
  6. डेटा सहेजें।
  7. सैंपल को स्कैन करना बंद करें और डिटेक्टर बंद कर दें।
  8. नमूना में देखने के एक और क्षेत्र का चयन करें और चरण 6.14-6.22 दोहराने या चरण 6.1-6.22 दोहराने से एक नई माइक्रोस्कोपी स्लाइड छवि ।
    नोट: पी aeruginosa जीवित है और agarose पैड पर कमरे के तापमान पर 6-8 घंटे तक के लिए विभाजित कर सकते है (पिछले ~ 4 20 डिग्री सेल्सियस पर दोहरीकरण समय के लिए इसी) । आदर्श रूप से, बैक्टीरिया से पूरी तरह से ढके पैड को देखने से बचने के लिए FLIM-FRET माप करने के लिए बहुत लंबा इंतजार न करें।

7. डेटा विश्लेषण

Figure 6
चित्रा 6: SPCImage सॉफ्टवेयर के डेटा विश्लेषण खिड़की का मुख्य पैनल। तीव्रता छवि (ब्लू बॉक्स), लाइफटाइम इमेज (बैंगनी बॉक्स), लाइफटाइम हिस्टोग्राम (ऊपरी दाएं), चयनित स्थिति (ग्रीन बॉक्स) पर क्षय वक्र, और एक प्रतिनिधि पीवीडीए-ईजीएफपी क्षय के चयनित स्थिति (सियान बॉक्स) पर क्षय पैरामीटर एक घर पर एक बीएच SPC830 अधिग्रहण कार्ड का उपयोग कर लाइव पी एरुगिनोसा में दर्ज की गई दो-फोटॉन उत्साह-FLIM-FRET सेटअप । उपरोक्त छवि में इंगित पिक्सेल के प्रयोगात्मक क्षय वक्र, इसकी मोनो-एक्सपोनेन्शियल फिट (लाल वक्र) अपनी गणना इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन (ग्रीन कर्व) से क्षय को विघटित करने के लिए हरे पैनल में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. बुनियादी विश्लेषण
    1. SPCImage सॉफ्टवेयर चलाएं।
    2. सेव एसपीसीएम फाइल आयात करें। तीव्रता छवि सॉफ्टवेयर के बाएं ऊपरी पैनल(चित्रा 6 ब्लू बॉक्स) पर प्रदर्शित की जाती है।
    3. क्षय वक्र खिड़की(चित्रा 6 ग्रीन बॉक्स) की जांच करें जो तीव्रता छवि(चित्रा 6 ब्लू बॉक्स) में चयनित पिक्सेल के अनुरूप क्षय डेटा प्रदर्शित करता है। हर बार चैनल के फोटॉन नंबर नीले डॉट्स के रूप में दिखाए जाते हैं और क्षय के फिट को लाल रेखा के रूप में खींचा जाता है। ध्यान दें कि डेटा लोड करने के बाद सॉफ्टवेयर छवि के प्रतिभाशाली पिक्सेल प्रदर्शित करता है। कम तीव्रता वाले पिक्सल की जांच करने के लिए ब्लू क्रॉस को इमेज के पार ले जाएं। क्षय विंडो स्वचालित रूप से प्रत्येक नए पिक्सेल स्थिति पर ताज़ा हो जाएगी।
      नोट: लेजर स्कैनिंग सिस्टम के इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) को मापना बहुत मुश्किल है। FLIM डेटा में फ्लोरेसेंस क्षय घटता के बढ़ते किनारे से गणना की गई आईआरएफ का उपयोग क्षय deconvolution के लिए किया जा सकता है। यह एसपीसिमेज(चित्रा 6 ग्रीन कर्व) में डिफ़ॉल्ट रूप से किया गया विकल्प है।
    4. फिटिंग बॉक्स (टी 1 और टी 2 ग्रीन बॉक्स में) के शुरुआती और अंत चैनलों को स्थानांतरित करके फिटिंग रेंज को समायोजित करें। T1 बढ़ती क्षय के पहले कुछ चैनलों पर शुरू करना चाहिए और टी 2 क्षय के अंत में अंतिम चैनल को परिभाषित करते हैं और फोटॉन ों की गिनती ऑफसेट (यानी, क्षय बढ़ने से पहले गिना जाने वाले फोटॉनों के स्तर) के ऊपर कई फोटॉनों के साथ क्षय के अंतिम चैनलों में से एक के रूप में चुना जा सकता है।
    5. बिन वैल्यू बदलकर बिनिंग चुनें। वक्र क्षय बिन पैरामीटर द्वारा परिभाषित कर्सर स्थिति के चारों ओर आई पिक्सल के क्षेत्र के साथ चयनित पिक्सेल की फोटॉन गिनती को एकीकृत करता है (बिनिंग बढ़ाने से क्षय में फोटॉनों की संख्या में वृद्धि होगी और बहु-घातीय मॉडलों के लिए आवश्यक फोटॉन गिनती तक पहुंचने में सहायक हो सकता है)।
    6. थ्रेसहोल्ड वैल्यू को एडजस्ट करें। जिन पिक्सेल में सीमा मूल्य से अधिक कई फोटॉनों के साथ कम से कम एक चैनल नहीं है, उन्हें फिटिंग प्रक्रिया में शामिल नहीं किया जाएगा। बेशक अधिक पिक्सल की संख्या फिट करने के लिए, अब विश्लेषण ।
      नोट: FLIM डेटा में पिक्सल और टाइम चैनल की एक विशाल संख्या हो सकती है। सॉफ्टवेयर के अंतिम संस्करण जीपीयू (ग्राफिक्स प्रोसेसर यूनिट) का उपयोग करके समानांतर में बड़ी संख्या में पिक्सेल को संसाधित करने की अनुमति देते हैं, जो प्रसंस्करण के समय को बड़े पैमाने पर कम कर देता है। सबसे कम फ्लोरेसेंस तीव्रता (उदाहरण के लिए, निम्नतम अभिव्यक्ति स्तरों के साथ बैक्टीरिया उपभेदों के साथ) का प्रदर्शन करने वाले बैक्टीरिया निर्माणों के अनुरूप छवियों का उपयोग करके बिनिंग और दहलीज मापदंडों को समायोजित करना दिलचस्प हो सकता है। इससे यह सुनिश्चित होगा कि इन नमूनों में देखे गए संबंधित क्षय फ़िल्टरिंग मानदंडों को पूरा करेंगे और विश्लेषण में शामिल किए जाएंगे । इन मापदंडों तो सभी छवियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    7. समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, क्षय मापदंडों (सियान बॉक्स)। बदलाव को अलग-अलग होने दें, अधिकांश समय स्कैटर और ऑफसेट को शून्य पर तय किया जा सकता है यदि क्षय कार्यों पर एक नज़र डालें तो पता चलता है कि उनका योगदान नगण्य है। ऑफसेट क्षय के पहले चैनलों को देख अनुमान लगाया जा सकता है - ध्यान दें कि नमूना में कम फ्लोरेसेंस के कारण लंबे समय तक इमेजिंग आमतौर पर गैर-शून्य ऑफसेट में परिणाम होता है। बिखरने ज्यादातर मोटे नमूनों में होता है और अन्यथा नगण्य माना जा सकता है।
    8. फिट चलाने से पहले, फिटिंग एल्गोरिदम का चयन करें। शो/हाइड मॉडल ऑप्शनमें एल्गोरिदम सेटिंग्स विंडो खोलें । अधिकतम संभावना अनुमान (MLE) एल्गोरिदम(चित्रा 7A) काचयन करें ।
    9. क्षय मैट्रिक्स की गणना | क्लिक करके छवि की फिटिंग चलाएं। एक बार पूरा हो जाने के बाद, लाइफटाइम एन्कोडेड फ्लिम छवि लाइफटाइम इमेज पैनल(चित्रा 6 बैंगनी बॉक्स) में दिखाई देती है।
      नोट: क्षय वक्र खिड़की(चित्रा 6 ग्रीन बॉक्स) पर यह जीवन भर मूल्य है कि नीले पार ले जाकर छवि के प्रत्येक पिक्सेल से मेल खाती है देखने के लिए संभव है ।
      नोट: बड़ी संख्या में समान फ्लिम डेटा फ़ाइलों को स्वचालित रूप से संसाधित करने के लिए, एक बैच प्रोसेसिंग मोड का उपयोग किया जा सकता है।
    10. अवशेषों को देखते हुए फिट की गुणवत्ता की जांच करें (आदर्श रूप से 0 के आसपास बेतरतीब ढंग से वितरित) और 1 के करीब ची स्क्वायर वैल्यू।
    11. फिट डेटा को अलग-अलग प्रारूपों में निर्यात किया जा सकता है। फाइलों को टीएक्सटी फाइलों में निर्यात करने के लिए, फाइल | पर जाएं निर्यात। एक्सपोर्ट ऑप्शंस विंडो(चित्रा 7B)में सभी को चुनें और फिर एक्सपोर्टपर क्लिक करें ।
    12. अंत में विश्लेषण फ़ाइल को सहेजें। विश्लेषण फ़ाइलों को *.img फ़ाइलों के रूप में सहेजा जाता है और सीधे SPCImage में फिर से खोला जा सकता है।
      नोट: असंतुलित दाता/स्वीकारकर्ता मात्रा के विशेष मामलों में, FLIM-FRET प्रोटीन परिसरों बातचीत के मिश्रण में उप आबादी प्रकट कर सकते है-विशेष रूप से जब दो भागीदारों की सांद्रता बहुत अलग हैं, इस प्रकार जटिल और मुक्त प्रजातियों के मिश्रण में जिसके परिणामस्वरूप । गैर-इंटरैक्टिंग प्रजातियां (दाता के समान क्षय की विशेषता केवल क्षय) डेटा सेट में दाता जीवन काल के घटकों के स्थानिक विचरण को संभालने वाले लोगों से बातचीत करने से भेदभाव किया जा सकता है। इसी तरह, गैर-स्टोइकिओमेट्रिक बातचीत परिसरों के साथ या तो अधिक दानदाताओं या फ्लोरेसेंस के अधिक स्वीकार्यता के रूप में हो सकता है। ऐसे परिसरों के फ्लोरेसेंस क्षय आमतौर पर व्याख्या करना मुश्किल होता है। 20,23पीपीआई के स्टोइकोमेट्री और बाध्यकारी मोड के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए फ्लिम आरेख भूखंड का उपयोग किया जासकताहै। फ्लिम आरेख प्लॉट अपने आयाम के एक समारोह के रूप में सबसे कम जीवन भर घटक का एक चित्रमय प्रतिनिधित्व है। इसका उपयोग समान क्षय हस्ताक्षरों के साथ पिक्सेल की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के अभ्यावेदनों को आकर्षित करने के लिए, प्रायोगिक फ्लोरेसेंस क्षय को दो घातीय मॉडल के साथ फिट किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया के माध्यम से निम्नलिखित चरण एक मार्गदर्शक हो सकते हैं।
    13. केवल निर्माण दाता के डेटा का विश्लेषण करके शुरू करें। यह दाता के आजीवन मूल्य का निर्धारण करने की अनुमति देगा। आदर्श रूप में, दाता के लिए एक मजबूत आजीवन मूल्य प्राप्त करने के लिए दाता/स्वीकारकर्ता निर्माण के रूप में एक ही शर्तों में दर्ज कई छवियों पर इस मूल्य को मापने ।
    14. एक बार निर्धारित, एक दो घातीय मॉडल के साथ दाता/स्वीकारकर्ता निर्माण के फ्लोरेसेंस क्षय फिट । सियान क्षय पैरामीटर बॉक्स(चित्रा 6)में, घटकों की संख्या 2 सेट करें। चरण 1 में निर्धारित दाता के मजबूत आजीवन मूल्य के लिए टी 2 (पीएस) पैरामीटर को ठीक करें और इस पैरामीटर को ठीक करने के लिए बॉक्स की जांच करें।
      नोट: अधिक फिटिंग को सीमित करने, फिटिंग अभिसरण में सुधार करने और अधिक विश्वसनीय दो-घातीयफिट पैरामीटर 24,25,26 प्राप्त करने के लिएलंबेसमय तक रहने वाले जीवनकालकोठीक करना महत्वपूर्ण है।
    15. * आईएमजी फ़ाइल को सहेजें और चरण 7.1.11 में *.एएससी फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।

Figure 7
चित्रा 7: (क) घातीय मॉडल के साथ क्षय फिटिंग के लिए एल्गोरिथ्म सेटिंग्स। फिट मॉडल के रूप में एमएलई (अधिकतम संभावना एल्गोरिदम या अधिकतम संभावना अनुमान, एमएलई) का चयन करना, और (बी) निर्यात विकल्प खिड़की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. आर में FLIM छवियों का उन्नत विश्लेषण
    1. यदि आवश्यक हो तो आर (https://cran.r-project.org) और आरएफट्यूडियो (https://rstudio.com) स्थापित करें।
    2. RStudio खोलें और एक नई परियोजना बनाएं।
    3. परियोजना के मुख्य फ़ोल्डर में "डेटा" नामक फ़ोल्डर में सभी विश्लेषण *.एएससी फ़ाइल को स्थानांतरित करें।
    4. एक नई स्क्रिप्ट फ़ाइल खोलें (या पूरक स्क्रिप्ट FLIM_analysis खोलें। आर) ।
    5. https://github.com/jgodet/flimDiagRam फ्लिम डेटा विश्लेषण के लिए समर्पित फ्लिमडायगम पैकेज स्थापित करें। कार्यक्षेत्र में पैकेज को कॉल करें। (HowTo_FlimDiagRam नोटिस देखें)
      नोट: संकुल की स्थापना केवल एक बार किया जाना है । एक बार स्थापित होने के बाद, पैकेज किसी भी नए आर सत्र से बुलाया जा सकता है। गिथुब से आर पैकेज डाउनलोड करने के लिए 'devtools' पैकेज स्थापित करने की आवश्यकता है। 'देवटूल' की स्थापना में कई मिनट लग सकते हैं। FlimDiagRam पैकेज का उपयोग फ्लैम डेटा के मापदंडों और वितरणों का प्रतिनिधित्व करने, एकल व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर FLIM डेटा निकालने के लिए, शर्तों या उपभेदों में FLIM परिणामों की तुलना करने और FLIM आरेख प्लॉट जैसे उन्नत दृश्य उपकरणों का उपयोग करके FLIM डेटा का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
    6. कदम-दर-कदम टिप्पणी कोड का उपयोग करें और डेटा नीचे प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत सभी उप-आंकड़ों को स्वतंत्र रूप से पुन: पेश करने के लिए उपलब्ध कराया जाता है। यह ट्यूटोरियल https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf पर HowTo_FlimDiagRam नोटिस में पाया जा सकताहै। डेटा का विश्लेषण करने के लिए कोड को आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है।

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Representative Results

विभिन्न जीवाणु उपभेदों के लिए मापा फ्लोरेसेंस जीवन काल के अनुभवजन्य संचयी वितरण कार्य (ecdf) चित्र 8में दिखाए जाते हैं । यदि FRET होता है, तो ecdfs को कम रहने वाले जीवन काल(चित्रा 8ए, 8B)की ओर स्थानांतरित कर दिया जाता है। ध्यान दें कि जब दोनों प्रोटीनों की बातचीत के परिणामस्वरूप दो फ्लोरोफोरस के बीच लंबी दूरी होती है, तो कोई भी FRET(चित्रा 8C)नहीं हो सकता है। इस स्थिति को FLIM में दोनों भागीदारों के बीच बातचीत के अभाव से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है । इसलिए यह महत्वपूर्ण है, जब अंतर डाई दूरी आणविक मॉडल या परिसर के ज्ञात आर्किटेक्चर से भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, के लिए बातचीत की जांच करने की संभावना को अधिकतम करने के लिए विभिंन पदों पर प्रोटीन लेबलिंग पर विचार करें । इसी तरह, पीवीडीए (अत्यधिक व्यक्त) और गैर-रिबोसोमल पेप्टाइड सिंथेटेस पीवीडीएल (कोशिकाओं के अनुसार कुछ प्रतियां) के बीच प्रोटीन अभिव्यक्तियों में बड़े अंतर के कारण, एक ही पीवीडीए/पीवीडीएल परिसर में समान फ्लिम-FRET डेटा नहीं होता है। वास्तव में, असंतुलित स्टोइचियोमेट्री फ्लिम-एफआरटी डेटा की व्याख्या को जटिल बना सकती है। जिसके आधार पर प्रोटीन दाता के साथ लेबल किया जाता है, असंतुलित स्टोइसिओमेट्री रिकॉर्ड किए गए फ्लोरेसेंस लाइफटाइम डिस्ट्रीब्यूशन(चित्रा 8ए, 8B)में बाध्य दाता-लेबल वाले प्रोटीन की तुलना में मुफ्त के योगदान में अंतर पैदा करते हैं।

Figure 8
चित्रा 8: दाता में होने वाले परिवर्तनों के चित्रण का मतलब है FRET (एकल घातीय मॉडल) के जवाब में फ्लोरेसेंस लाइफटाइम डिस्ट्रीब्यूशन। पीवीडीए (ब्लू फॉर्म)(ए और बी)या पीवीडीजे (पीला रूप)(सी)प्रोटीन के साथ पीवीडीएएल (ग्रे फॉर्म) की बातचीत का प्रतिनिधित्व जो ईजीएफपी (हरा) या रीचेरी (लाल) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जाता है। अनुभवजन्य संचयी वितरण कार्य (कम रेखांकन) स्पष्ट रूप से फ्लोरेसेंस लाइफटाइम वितरण के बीच मतभेदों को उजागर कर सकते हैं। (क)फ्लोरेसेंस के दाता के साथ लेबल पीवीडीए की अधिकता की उपस्थिति में, eGFP दाताओं के मतलब आजीवन वितरण दाताओं का प्रभुत्व है कि FRET से गुजरना नहीं है, लेकिन यह भी कुछ mCherry-PvdL के साथ FRET के दौर से गुजर दानदाताओं के जीवनकाल को एकीकृत । इस स्थिति में, मिश्रण (हरा-नारंगी वक्र) का जीवनभर वितरण केवल अवेलेबल पीवीडीएल (ग्रीन कर्व) के साथ गठित उसी मिश्रण के आजीवन वितरण के करीब है। (ख)यदि लेबलिंग का क्रम बदल दिया जाता है और स्वीकार्यकर्ताओं के साथ लेबल किए गए पीवीडीए की अधिकता मौजूद है, तो मतलब आजीवन वितरण स्थानांतरित प्रजातियों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें संभवतः दानदाता शामिल हैं जो कई स्वीकारकर्ताओं (नारंगी वक्र) के साथ FRET से गुजरते हैं। इसलिए यह वितरण अवेलेबल पीवीडीए (ग्रीन कर्व) के साथ गठित एक ही परिसर से बहुत अलग है। (ग)यदि कोई FRET नहीं होता है क्योंकि प्रोटीन बातचीत नहीं करते हैं या क्योंकि इंटर-डाई दूरी परिसर में बहुत बड़ी है, तो जीवन भर के वितरण में परिवर्तन केवल दाता के लिए लगभग अधिरोपित है (पीवीडीजे-ईजीएफपी/मचेरी-पीवीडीएल के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम वितरण के अनुरूप हल्के हरे वक्र की तुलना पीवीडीजे-ईजीएफपी के अनुरूप हरे वक्र के अनुरूप) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 9 में देखे गए स्टोइकिओमेट्री के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए आरेख भूखंड का उपयोग किया जा सकताहै। पीवीडीए-ईजीएफपी/मचेरी पीवीडीएल म्यूटेंट में डोनर लेबल वाले पीवीडीए की मात्रा 1000 पीवीडीए की मात्रा से कहीं अधिक है। नमूने में मौजूद सभी दानदाताओं में से केवल कुछ ही पीवीडीएल के साथ बातचीत कर रहे हैं। औसत फ्लिम मूल्य वितरण के विपरीत, फ्लिम आरेख प्लॉट केवल दाताओं के क्षय घटक में निहित विशिष्ट जानकारी देता है। चित्रा 9 एमें, ~ 2.3 एनएस पर केंद्रित एक tau1 मूल्य देखा जा सकता है, जो मिश्रण में लगभग 30-40% प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करता है। एकल tau1 मूल्य से पता चलता है कि प्रत्येक PvdA-eGFP दाता केवल एक mCherry PvdL स्वीकारकर्ता के साथ स्थानांतरित कर सकते हैं ।

रिवर्स लेबलिंग (पीवीडीए-एमएचरी/ईजीएफपी पीवीडीएल) से, पीवीडीए की तुलना में पीवीडीएएल की कम संख्या के कारण अधिकांश ईजीएफपी पीवीडीएएल प्रोटीन पीवीडीए-एमसीएचरी के साथ बातचीत करने की उम्मीद है। इसकी पुष्टि अल्फा1 मानों द्वारा की जाती है जो उच्च मूल्यों की ओर स्थानांतरित होते हैं। इसके अलावा, tau1 मानों बहुत अधिक वितरित हो गया(चित्रा 9B)के साथ कम रहने वाली प्रजातियों के प्रेत के साथ जीवन काल के रूप में ~1.5 एनएस के रूप में कम है। इससे पता चलता है कि चित्रा 9 ए की स्थिति की तुलना में अतिरिक्त हस्तांतरण होते हैं और इस प्रकार, कई पीवीडीए प्रोटीन एक पीवीडीए प्रोटीन से बांध सकते हैं। नतीजतन, प्रत्येक परिसर के लिए, eGFP जीवनकाल mCherry प्रोटीन की संख्या और वितरण पर निर्भर करेगा जिसके साथ eGFP ऊर्जा स्थानांतरित कर रहा है। एक साथ लिया, डेटा का सुझाव है कि प्रत्येक PvdL प्रोटीन कई PvdA प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकते है

Figure 9
चित्रा 9: दानदाताओं (ए) या स्वीकारकर्ताओं (बी) और कई बाध्यकारी साइटों की अधिकता के मामले में FLIM आरेख भूखंडों । FLIM आरेख भूखंड एक दो घातीय फिट का उपयोग कर प्राप्त FRET के दौर से गुजर दाता के क्षय घटक में निहित विशिष्ट जानकारी देता है । पीवीडीए-ईजीएफपी/mCherry-PvdL उत्परिवर्ती(ए)में, एक ही tau1 मूल्य मनाया जाता है और क्षैतिज धुरी पर डेटा बिंदुओं की बिखरे हुए स्थिति द्वारा दिया गया इसका आयाम FRET में लगे दानदाताओं की आबादी के बारे में जानकारीपूर्ण है । पीवीडीए-एमएचरी/ईजीएफपी-पीवीडीएल सिस्टम(बी)में, tau1 मान बहुत अधिक वितरित किए जाते हैं, यह दर्शाता है कि एक पीवीडीएल (ग्रे फॉर्म) प्रोटीन कई पीवीडीए (ब्लू फॉर्म) प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

FLIM-FRET तीव्रता आधारित FRET इमेजिंग पर कुछ प्रमुख लाभ प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम फ्लोरोफोर का एक आंतरिक पैरामीटर है। नतीजतन, यह प्रकाश उत्तेजन की तीव्रता पर न तो फ्लोरोफोरस की स्थानीय सांद्रता पर निर्भर नहीं है। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम अतिरिक्त रूप से फोटो-ब्लीचिंग से भी खराब प्रभावित होता है। यह विशेष रूप से कोशिकाओं में पीपीआई सबूत के लिए दिलचस्प है जहां स्थानीय प्रोटीन सांद्रता उपकोशिकीय डिब्बों या क्षेत्रों में अत्यधिक विषम हो सकती है। FLIM-FRET उन सभी स्थितियों में भी दिलचस्प है जहां जटिल की एकाग्रता कम है क्योंकि प्रोटीन या प्रोटीन दोनों में से किसी एक की अभिव्यक्ति का स्तर कम होता है।

पीपीआई के संदर्भ में, जीवनकाल को छोटा करने के लिए जिम्मेदार FRET तंत्र और इसलिए बातचीत की प्रकृति के बारे में जानकारी केवल औसत जीवनकाल पर विचार करने का अनुमान लगाना मुश्किल है। दरअसल, औसत जीवनकाल का एक छोटा मध्यम FRET के साथ बातचीत प्रजातियों के एक उच्च अनुपात के कारण हो सकता है, या स्वीकारकर्ता के साथ एक छोटी दूरी पर बातचीत दाताओं के एक कम अनुपात के विपरीत पर । यह स्थिति तब और भी जटिल होती है जब असंतुलित स्टीचियोमेट्री के साथ जटिल होते हैं। ग्राफिकल विज़ुअलाइज़ेशन उपकरण कई आयामों के प्रतिनिधित्व की अनुमति देते हैं (आरेख भूखंड tau1, अल्फा और ) के मामले में परिसरों की प्रकृति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं। डेटा के वैकल्पिक ग्राफिकल अभ्यावेदन, जैसे फेसर आधारित विश्लेषण27,28 एक वेक्टर अंतरिक्ष में कच्चे FLIM डेटा के एक चित्रमय प्रतिनिधित्व का प्रस्ताव, इस संदर्भ में भी दिलचस्प हैं।

कैसे ब्याज के प्रोटीन टैग करने के लिए चुनना सफल FLIM-FRET प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है ।   सबसे गंभीर रूप से, टैग को प्रोटीन की बातचीत को संशोधित या बदल नहीं करना चाहिए। दुर्भाग्य से, दुर्लभ मामलों को छोड़कर जहां प्रोटीन की संरचनाओं को जाना जाता है या भविष्यवाणी की जा सकती है, ज्यादातर मामलों में एक परीक्षण और त्रुटि दृष्टिकोण के लिए मजबूर किया जाता है । ऊर्जा हस्तांतरण के अभाव में FLIM-FRET की व्याख्याओं इसलिए हमेशा संभावना है कि लेबल बातचीत बदल सकते है पर विचार किया है । इस कारण से, FLIM-FRET को इस अर्थ में एक पुष्टित्मक तकनीक के रूप में देखा जा सकता है कि यदि कोई बातचीत देखी जाती है, तो यह लेबल के अभाव में मौजूद होना चाहिए। एक बाहरी कार्यात्मक readout का निपटान - जैसे कि यह जांचना कि दोगुना लेबल वाले प्रोटीन को व्यक्त करने वाले उत्परिवर्तित उपभेदों द्वारा पाइवरडीन का उत्पादन जंगली प्रकार के उपभेदों के समान है - विशेष रूप से फ्लिम-एफआरटी परिणामों की व्याख्या करने के लिए उपयोगी है।

इमेजिंग पीपीआई का पता लगाने के लिए एक उच्च थ्रूपुट विधि नहीं है और अब तक संदिग्ध या भविष्यवाणी की पीपीआई की पुष्टि करने के लिए शोषण किया गया है । इस पुष्टित्मक संदर्भ में, विश्लेषण को डेटा से अधिक जानकारी के रूप में निकालने के लिए धक्का पीपीआई में शामिल तंत्र की गहरी समझ हासिल करने के लिए समझ में आता है । स्क्रीनिंग रणनीतियों के अनुकूल FLIM-FRET सेटअप को बदलने के लिए29,30,31 प्रयास किए जा रहे हैं। उन्नत आसानी से उपलब्ध और स्वचालित विश्लेषण विकसित करने से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों द्वारा उत्पादित बड़ी मात्रा में डेटा को संसाधित करने की संभावना सुनिश्चित होगी। इस संदर्भ में, कम से कम वर्ग विधियों का उपयोग करके फिटिंग प्रक्रियाओं को उच्च गणना आंकड़ों की आवश्यकता होती है, जो FRET का अनुमान लगाने के लिए खराब रूप से अनुकूलित हो सकते हैं। विभिन्न प्रकार के वैकल्पिक तरीकों को विकसित किया गयाहै,जिनमें गैर-फिटिंग विधियां (पैडिला-परेरा एट अल में समीक्षा की गई)शामिल हैं। ये विधियां गणना की गति में भिन्न होती हैं, उचित विश्लेषण, सटीकता, जटिलता और डेटा के प्रकार के लिए आवश्यक फोटॉनों की न्यूनतम संख्या जिसे कुशलतापूर्वक संसाधित किया जा सकता है। इंटरैक्टिंग डोनर34 या फेसर अप्रोच35,36,37 के न्यूनतम अंश जैसी तकनीकों में FRET-FLIM में उच्च गति अधिग्रहण करने की क्षमता है और अभी भी बड़ी मात्रा में डेटा को संसाधित करने या यहां तक कि वीडियो दर की गति तक पहुंचने के लिए मात्रात्मक है।

फ्लोरोसेंटी लेबल प्रोटीन के निर्माण की आवश्यकता जो कोशिकाओं में प्रोटीन के मूल कार्यों को परेशान नहीं करती है, गति को बढ़ाने और पीपीआई की संख्या का पता लगाने के लिए एक बड़ी चिंता का विषय है। वैकल्पिक नई लेबलिंग रणनीतियों, छोटे अणु फ्लोरोजेनिक जांच३८,३९ पर आधारित इस महत्वपूर्ण सीमा को दरकिनार करने के लिए एक तरीका हो सकता है । फ्लोरोसेंट जांच का निपटान फ्लिम-एफआरटी के साथ संगत और अन्य सेल घटकों (जैसे न्यूक्लिक एसिड या झिल्ली) को लेबल करने में सक्षम है, यह भी बातचीत की प्रकृति को व्यापक करेगा फ्लिम-FRET विशेषता कर सकता है।

एक करीबी भविष्य में, हमारा मानना है कि FLIM-FRET क्षेत्र में सबसे बड़ी सफलता डेटा प्रसंस्करण में नवाचार से परिणाम होगा । संकुचित संवेदन40 जैसे तरीकों को विरल क्षय डेटा से FLIM छवि के कुशल और सटीक पुनर्निर्माण को सक्षम करना चाहिए - संभवतः अधिग्रहण दर को और तेज करना जो तेजी से बदलती प्रक्रिया पर वास्तविक समय FLIM-FRET करने की अनुमति देगा। इसी तरह, पिक्सेल वर्गीकरण या प्रतिगमन, डेनोइसिंग या सिग्नल बहाली के बारे में FLIM डेटा पर लागू मशीन लर्निंग उत्कृष्ट छवि पुनर्निर्माण और विश्लेषण की अनुमति देगी जो FRET-FLIM विधियों41, 42के हित को और बढ़ाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम FLIM डेटा अधिग्रहण पर उनकी मूल्यवान सहायता के लिए और FLIM सेटअप के तकनीकी रखरखाव और विकास के लिए डॉ लुडोविक रिचर्ट को स्वीकार करते हैं। इस काम को प्रियतम डालना ला Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था । वीएन को प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (FRM-SPF201809006906) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। YM समर्थन के लिए संस्थान Universitaire डी फ्रांस (आईयूएफ) के लिए आभारी है और अतिरिक्त समय प्रदान करने के लिए अनुसंधान के लिए समर्पित किया जाएगा । आईजेएस और जेजी अपनी वित्तीय सहायता के लिए स्ट्रासबर्ग के ड्रग डिलिवरी पर संस्थान को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
525/50 nm band-pass filter F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter F75-680, AHF, Germany
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL ThermoFisher Scientific EP0714
E. coli TOP10 Invitrogen C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm Knitel glass MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL ThermoFisher Scientific F530S
Lysogeny broth (LB) Millipore 1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) Sigma-Aldrich 10034-99-8
Microscope slides (25×75mm) Knitel glass MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.50
NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel 740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Sodium Succinate (Disodium) Sigma-Aldrich 14160
SPCImage, SPCM software Becker & Hickl
Sterile inoculating loop Nunc 7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL ThermoFisher Scientific 15224017
TCSPC module SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL Falcon 352070

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जीव विज्ञान अंक 162 FRET-FLIM प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,बैक्टीरिया इमेजिंग फ्लोरेसेंस
लाइव बैक्टीरिया में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के FLIM-FRET माप।
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Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., Steffan, T., Gasser, V., Boutant, E., Réal, É., Schalk, I. J., Mély, Y., Godet, J. FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.. J. Vis. Exp. (162), e61602, doi:10.3791/61602 (2020).

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