Summary
ここでは、FLIM-FRET測定を用いて、生きた 緑膿菌 中の2つの高度に異なる発現タンパク質間のタンパク質相互作用を特徴付けるプロトコルについて説明する。このプロトコルには、細菌株構造、細菌固定化、イメージングおよびポストイメージングデータ分析ルーチンが含まれます。
Abstract
タンパク質相互作用(PPI)は、細胞内の様々な主要プロセスを制御します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)とフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)を組み合わせることで、生細胞におけるPPIに関する正確な情報を提供します。FLIM-FRETは、FLIM画像の各ピクセルにおけるFRETドナーの蛍光寿命減衰を測定することに依存しており、PPIとその空間細胞組織に関する定量的かつ正確な情報を提供します。ここでは、PPIの重要な特徴を明らかにする技術の質と堅牢性を実証するために、非常に異なるコピー番号で発現する2つの相互作用タンパク質の特定のケースで生きた シュードモナス緑膿症 でPPIを監視するために適用したFLIM-FRET測定のための詳細なプロトコルを提案する。このプロトコルは、PPI特性評価に必要なすべてのステップを詳細に記述しています - 細菌変異体構造から、複雑なFLIM-FRETデータの簡単な解釈のための高度な視覚化の可能性を提供する最近開発されたツールを使用して、最終分析まで。
Introduction
タンパク質相互作用(PPI)は、細胞1における様々な主要プロセスを制御する。PPIの役割は、タンパク質組成、親和性機能、細胞2内の位置によって異なります。PPIは、異なる技術3を介して調査することができます。例えば、共免疫沈降法は、PPIを同定または確認するための比較的シンプルで堅牢で安価な技術です。しかし、相互作用するタンパク質の発現レベルが低い場合や、相互作用が一過性または特定の環境でのみ関連する場合は、PPIの研究は困難な場合があります。P.緑膿菌におけるピオーバージン経路の異なる酵素の間で起こるPPIを研究するには、一般的な鉄共因子リプレッサーファーの抑制が緩和され、ピオーバージン経路のすべてのタンパク質の発現が細胞4、5、6に発現することを可能にする必要がある。経路のすべてのタンパク質に対するこの一般的な調節は、それらの相互作用を促進することが期待される細胞内のタイムリーな発現をもたらす。この代謝経路のサイズ、性質、発現量およびタンパク質の数の用語の多様性は、再構成された系6における研究を困難にする。したがって、細胞環境におけるPPIの探索は、タンパク質の本来の文脈における生物学的機能をさらに理解するために重要です。
生細胞7でPPIを探索できる蛍光を含む方法はごくわずかです。測定できる異なる蛍光パラメータの中で、蛍光寿命(すなわち、蛍光色素が光子を放出する前に励起状態にとどまる平均時間)は、生きている細胞で探索する最も興味深いパラメータの1つである可能性が高い。蛍光の寿命は、その環境に非常に敏感であり、FLIMは、蛍光動物の環境に関する化学的または物理的な情報を提供することができます8.これには、蛍光「ドナー」の短い距離に位置する蛍光の「アクセプタ」の存在下で起こり得るフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)の存在が含まれる。エネルギー移動は、ドナー蛍光寿命の有意な短縮(図1A)を生細胞でタンパク質相互作用を直接探索するための強力なアプローチである蛍光生涯イメージング顕微鏡(FLIM)を作る。FLIM は、セル7、8での対話の場所に関する空間情報を提供することもできます。このアプローチは、2 つの相互作用するパートナーの蛍光標識を使用する可能性がある状況で PPI を調査する場合に非常に強力です。
FRET が発生するには - 2 つのフルオロフォア間の距離の重大な条件が必要です8,9.2つの蛍光色素は、10nm以上離れてはなりません。したがって、蛍光のドナーとアクセクサが相互作用複合体内で互いに近接位置することを確実にするために、FLIM-FRET実験を設計する際には注意が必要です。これは制約に見えるかもしれませんが、FRETの距離依存性により、FRETを受けている2つの標識タンパク質が物理的に相互作用しなければならないのは確かに本当の利点です(図1A)。したがって、共局在化実験でPPIに関する明確な回答を得ることの難しい(2つの共局化タンパク質は必ずしも相互作用しない)、FLIM-FRETを使用して問題とはなりません。
図1:FLIM-フレット解析原理FLIM-FRET多次元画像の各ピクセルには、この特定の場所で記録された蛍光減衰に関する情報が含まれています(#counts = チャネルtで検出された光子の数)。(A) FLIM イメージの古典的な表現は、通常、偽色の有効期間エンコードされた 2D イメージ (左) です。色調の変化によって見られるドナーの平均蛍光寿命の減少は、FRETの存在下で観察することができ、この空間領域におけるPPIの存在について有益である。(B)FRETが発生するためにはドナー発光スペクトルとアクソクザの吸収スペクトルとの重複が必要である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
FRETの第2の要件は、ドナーの発光スペクトルとアクセクサの吸収スペクトルが8(図1B)と重なるべきことである。ドナーの蛍光励起は、アクセクサの直接蛍光励起にほとんど寄与しない波長にあるべきである。フルオロフォアのすべての組み合わせが可能であるとは限らず、FLIM-FRET解釈を容易にするために単一指数蛍光崩壊を有するドナーを優先的に使用することを推奨する。蛍光タンパク質のいくつかのカップルは、人気のeGFP-mCherryカップル11を含むこれらの要件を満たしています(利用可能な蛍光タンパク質FRETペアのパレット上のレビューについては、12,13を参照してください)。
FLIM-FRETは、FLIM画像のすべてのピクセルでFRETドナーの蛍光寿命減衰を測定することを可能にする(図1A)。取得と分析において異なる蛍光寿命を決定する2つの主要な技術があります:周波数領域(FD)14と時間領域(TD)。.TD FLIMはより広く普及し、格子方式15、ストリークカメラ16、または時間相関単一光子計数(TCSPC)技術8を含む異なる可能な検出構成と組み合わせたパルス照明を使用して行われる。FDとTDの両方の技術では、蛍光寿命は直接測定されませんが、測定されたデータの分析を必要とし、寿命または相互作用の存在を推定する必要があります。TCSPC 手法では、最も広く使用されている分析は、残差の加重合計を最小化する最小二乗反復反復関数を使用して、単一または多重指数関数で減衰を適合させることに依存します。
最後に、FLIM-FRETは単一の光子または多光子の励起を使用して両方を行うことができる。最新の焦点面から自己蛍光および光損傷を減らすのようないくつかの利点がある。多光子励起は、厚い3Dサンプル8で作業する場合、より長い励起深さを可能にします。逆に、蛍光タンパク質の二光子吸収断面が17に制限されるため、単一光子励起は通常より効率的である。
ここでは、PPIの重要な特徴を明らかにする技術の質と堅牢性を実証するために、非常に異なる数のコピーで発現する2つの相互作用タンパク質(PvdAおよびPvdL)の特定の場合における生きたP.緑素症におけるPPIのFLIM-FRET測定のためのプロトコルを提案する。PvdAおよびPvdLタンパク質は、ピオーバージン生合成に関与しています。PvdAはL-オルニチンN5-オキシゲナーゼであり、ヒドロキシル化(PvdA)およびホルミネーション(PvdF)18によってL-オルニチンからL-N5-ホルミルN5-ヒドロキシオルニチンを合成する。PvdLは、4つのモジュールから構成される非リボソームペプチド合成(NRPS)酵素です。最初のモジュールは、ミリスティック酸のアシル化を触媒します。第2のモジュールは、L-Gluの活性化とミリスティックcoAへの凝縮を触媒します。そして、第3のモジュールは、D-Tyrで異性体化されるL-Tyrアミノ酸を凝縮する。最後に、第4のモジュールは、L-Dab(ジアミノ酪酸)アミノ酸を結合して、アシル化トリペプチドL-Glu/D-Tyr/L-Dab6を形成する。PvdLは、ピオーバージン前駆体の3つの最初のアミノ酸の合成を担う。PvdLとPvdLとのPvdAタンパク質の相互作用は、PvdIおよびPvdJとは逆に、L-N5-ホルミルN5-ヒドロキシオルニチンに特異的なモジュールを持たないとして驚くべきものです。この相互作用は、ピオーバージン前駆体生合成を担う全ての酵素が、大きな一過性および動的多酵素複合体19,20に配置されることを示唆している。
本報告では、eGFPとmCherry標識タンパク質の2つをネイティブに発現する細菌株を構築する方法を詳細に説明する。また、効率的なFLIM-FRET細胞イメージングのためのサンプル調製および条件についても説明する。最後に、複雑なFLIM-FRETデータの簡単な解釈のための高度な視覚化の可能性を提供する最近開発されたツールを含む画像解析のためのステップバイステップチュートリアルを提案する。このレポートでは、冒険的なだけでなく、ほとんどの生物学者に、FRET-FLIMはネイティブセルラー環境でPPIに関する質問に直接対処できるアクセス可能で強力な技術であることを納得させたいと思います。
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Protocol
1. プラスミド建設
- 2つのPCR(PCR1および3)DNA配列(P.緑素吸塩PAO1のゲノムDNAを使用)を上流および下流の700塩基対で増幅し、高忠実度DNAポリメラーゼを有するP.エルギノーサゲノム中の挿入部位に対応する領域の上流および下流に。制限部位を青と緑のプライマーに追加し、mCherry を使用した重複するシーケンスを赤のプライマーに追加します (図 2)。
- eGFPでC末語で標識されたPvdAの場合、プライマーによるストップコドンに対して上流700bpの領域を青色で増幅し、ストップコドンを含む700bp下流領域を緑色でプライマーで増幅する。
- mCherryでN末語で標識されたPvdLの場合、開始コドンを含むPvdL遺伝子に上流の700bp領域を青色のプライマーで増幅し、プライマーを緑色にして700bp下流領域を増幅する。
図2:PvdA-mCherryの構築に用いられるPCR戦略とプラスミド構造の概要 詳細については、テキストを参照してください - pvdAは、鉄の取得に関与する二次代謝産物であるシデロフォアピオーバージンの生合成に関与する酵素をコードしています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- eGFPコードDNA(開始および停止コドンなし)を、高忠実度DNAポリメラーゼで赤のプライマーで増幅します。
- PCR 製品を PCR クリーンアップカラム (材料表) で精製します。
- 重複PCR産物を等モル比で混合し、PCR 1および3に使用される制限部位を有するプライマーを用いて2番目のPCRを実行する( 図2の緑と青)。
- PCR産物をアガロース-1x TAE(トリスベース酢酸EDTA pH 8.0)ゲルで移行し、対応するバンドを切断し、PCRクリーンアップキットでアンプリコンを抽出します(材料表)。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。 - 対応する制限酵素21を用いてPCRアンプリコンおよびpEXG2プラスミドを消化する。
- 90 ngのプラスミドと分子比1:1(プラスミド:インサート)を使用して、ポリゲートプラスミドとT4 DNAリガーゼを挿入します。
- 化学に有能な細胞のプラスミド構造を変換し、TOP10のライゲーション生成物と100 μLを混合することにより 、大腸菌 TOP10細胞。60 sの42°C熱ショックを進行する前に、氷の上で有能な細菌/プラスミド混合物を30分間インキュベートします。その後、チューブを氷の上に10分間置きます。
- 細菌に1mLのリソゲニーブロス(LB)を加え、37°Cで1時間インキュベートします。
- 15 μg/mL のゲンタマイシンを含む LB 寒天に100 μL の細菌をプレートします。
- 37°Cで一晩インキュベートする。
- コロニーPCRによるインサートの存在をスクリーニング:1つの単離された形質転換体コロニーから、アガロースゲル(DNAポリメラーゼ)上で製品を実行することによってアンプリコンの存在を検出できるように、プラスミド上にハイブリダイズするプライマーを含むPCRミックスに添加される微量の細菌をピックアップする( DNAポリメラーゼ)。PCRに使用したのと同じコロニーから、15 μg/mLゲンタマイシンを含む新鮮なプレートに少量の細菌を移して、単離し、プラスミド抽出に使用します。最後に、プラスミド(材料表)を分離して精製し、シーケンシングによって挿入物を検証します。
- 1.5 mLマイクロチューブに20%のグリセロールを-80°Cで、精製プラスミドを1.5mLチューブで-20°CでLBに含むTOP10細菌を保存します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます
2. P. 緑素吸塩の染色体ゲノムへの蛍光タグ挿入 (図3)
- 成長 P.緑素吸皮症、TOP10および 大腸菌 ヘルパー菌は、一晩22の軌道揺れの下で30°Cで抗生物質なしでLBの5mLのそれぞれ1つ。 P.緑素吸 塩のゲノムに蛍光タグ挿入を生成し、プラスミドを大腸菌TOP10からPAO1株に移し、相同組換えによってプラスミドをゲノムに統合します。ベクトルを切り出す 2 番目の交差イベントは、対応するミュータントを生成します。
- 細菌培養物の600 nm(OD600 nm)で光学密度を測定し、等量の Pを混合します。 大腸 菌(500μL、OD600 nm = 1.0)、 大腸菌 TOP10 pEXG2(500 μL、OD600 nm = 1.0)および 大腸菌 HB101 pRK600ヘルパー(500 μL、OD600 nm= 1.0)を1.5mLマイクロチューブで提供。
- 遠心分離機は、細菌をペレットに9,300 x g で5分。
注: オンライン ツールを使用すると、遠心力を 1 分あたりの回転数 (rpm) に変換して遠心分離速度を調整できます。 - 細菌ペレットを保持し、上清を捨てます。
- 細菌を含むペレットをLBの50 μLに再懸濁する。
- LB寒天の真ん中に1個のスポット(約50μL)を入れ(37°Cで予熱)し、37°Cで5時間インキュベートします。
- 滅菌接種ループでスポットをスクラップし、LBの1 mLで再中断します。
- この細菌懸濁液のプレート100 μLは、 大腸菌 (大腸菌 TOP10 pEXG2および 大腸菌 HB101 pRK600ヘルパーはクロラムフェニコールに敏感であるが 、P.アエルギノーサ は自然に耐性がある)および37μg/mLmicaで37日で、10μg/mLのクロラムフェニコールを含むLBアガー上に存在する。
- 1 mL LB で 1 コロニーを再懸濁し、軌道振盪 4h の下で 37 °C でインキュベートします。
- 遠心分離機 3 分で 9,300 x g、950 μL の上清を捨てます。 LBの50 μLにペレットを再懸濁し、スクロースを含むLB寒天で、NaClなしで混合物を分離する。
- 30°Cで一晩インキュベートする。
- 15 mg/mL ゲンタマイシンを含むLB寒天およびLB寒天上の単離されたコロニーを発見し、ゲンタマイシン感受性をチェックする。
- PCRコロニー(DNAポリメラーゼ)によるeGFPまたはmCherry挿入を確認し、特定のプライマーを使用してシーケンシングを行います。
図3:蛍光タグ挿入による P.緑分化菌 株の構築のプロトコル。 詳細については、テキストを参照してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
3. ピウオーバージン測定
- 一晩で軌道揺れの下で30°CでLBの5mLで細菌を成長させます。
- ペレット菌は遠心分離、洗浄、SM(コハク酸ミディアム、SMの5mLで増殖) 構成: 6 g∙L-1 K2HPO4,3 g∙L-1 KH2PO4,1 g∙L-1 (NH4)2 SO4,0.2 g∙L-1 MgSO4,7 H2O および 4 g∙ L-1ナトリウムコハク酸 NaOH を加えて pOh を加えて 7.0 に調整し、一晩で軌道下で 30 °C. SMは鉄を奪われた媒体である - 鉄の不在は、通常、鉄の存在下で抑圧されたピオーバージン経路のタンパク質の発現を活性化する。
- OD600 nm = 0.1の新鮮なSM培地でOD600 nm と希釈細菌を再び測定し、一晩の軌道揺れの下で30°Cで増殖させます。
- OD600 nm を測定して、各サンプル中の細菌の量を決定します。
- 100 μLの P.緑素吸皮を 含むクエヴェットを準備し、SM(900 μL)の1 mLに完了します。1 mLのSM培地(ブランク)を含むクオーツキュベットを準備します。
- UV可視分光光度計を用いて、吸収ピークの最大値で吸光度を測定する。pH 7.0では、ピオーバージンの吸収の最大値は〜400nmで起こります。e = 19 000 M-1の ∙cm-1の 400 nm でのモルの絶滅係数を使用して、ビア・ランバート法を使用してサンプル中のピオーバージン (アポ形) 濃度を決定します。
注:ピバージンは、吸光度が濃度とともに直線的に増加する〜0.1〜〜1(UV可視分光光度計に応じて)の吸光度の範囲で定量することができます。
4. 細菌の培養と細胞がPvdA、PvdLおよびPvdJを発現するための条件
- 1日目に、細菌の適切なグリセロールストックからLBの5mLでチューブを接種し、軌道シェーカーインキュベーターで200rpmで30°Cで夜に細菌を増殖させます。
- 2日目、ペレット細胞は3000xgで3分間遠心分離し、上清を捨てる。
- 細胞をSMの10 mLで再懸濁する。
- ステップ 4.2~4.3 を 1 回繰り返し、SM で細菌を一晩 30 °C 200 rpm で増殖させます。
- 3日目に、新鮮なSMで菌培養を1/10に希釈します。
- 同じ条件で再び一晩希釈細菌を成長させます。
注:ピオーバージンの存在は、成長しているメディアを黄色緑色で着色するので、視覚的に検出することができます。ピオーバージン経路のタンパク質の発現が活性化され、目的の酵素が細胞内で発現していることを示す。
5. アガロースパッドの調製 (図4)
- 平らな水平面に顕微鏡のガラススライドを置きます。最初のスライドの両側に2層の粘着テープをトッピングした2枚のガラススライドを並べ替えます。
注:3つの整列したスライドの間に1〜2mmのスペースを保ち、メレットアガロースが最終的に粘着テープでスライドに広がるのを防ぎます。 - ピペットを、ガラススライド上に1%溶かしたアガロースの70 μLの液滴を注ぎます。上部に4番目のスライドを追加してアガロースの液滴を平らにし、軽く押し下げます。1分ほど待ちます。
- 上のスライドを外し、約3μLの細菌を、アガロースパッド上の異なる場所の3〜4箇所にピペットで落とします。
- 顕微鏡のガラスカバースリップ(例えば、22x22 mm#1.5厚)で覆います。
注: カバーリップの平坦度と厚さは、2 光子励起を操作する場合に重要です。制御された均一平坦度および低い自己蛍光を有する精密カバーリップは、通常、良い選択である。 - カバースリップを溶かしたパラフィンで固定し、カバースリップをガラススライドに密封します。カバースリップの四隅を固定して開始します。
図4:アガロースパッド調製。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
6. 2光子顕微鏡によるイメージング
注:私たちは、60x 1.2NAの水浸し目的を持つ自家製2光子励起走査反転顕微鏡を使用しています。2光子励起波長は930nmに設定されています。Ti:Sapphireレーザー(80 MHzの繰り返し速度、≈70 fsパルス幅)で10〜20 mWで動作することによって提供されます。蛍光光子は、時間相関単一光子カウント(TCSPC)モジュールに接続された繊維結合雪崩フォトダイオードに向けられる前に、680 nmのショートパスフィルタと525/50 nmのバンドパスフィルタを介して収集しました。顕微鏡はまた透過の蛍光ランプが装備されている。現在、いくつかのFLIM-FRET顕微鏡が市販されており、多くのイメージング施設にFLIM-FRET測定を行うことができるセットアップが装備されています。
- 蛍光灯を使用して、サンプル中の細菌の単層に焦点を当て、対象領域を選択します。
- 励起レーザーシャッターが閉まっており、レーザーから来る赤外線が遮断され、顕微鏡に入らないか確認してください。
注意:レーザー光は目では見えないが、一過性の直接博覧会やレーザー反射でさえ非常に有害であり、不可逆的な眼の損傷を引き起こす可能性がありますので、注意深く、一定の警戒心を払ってIRパルスレーザーを使用する必要があります。顕微鏡のセットアップを使用する前に、現地のレーザー安全手順とトレーニングを参照してください。 - 内視鏡スライドをステージ上に置き、カバーリップを目的に向けます。
- 蛍光灯が点灯していることを確認します。
- フィルターキューブタレットを回してeGFPキューブを選択し、蛍光灯シャッターを開きます。
- 顕微鏡の接眼部に向かって蛍光灯を送ります。
注意: 目にダメージを与える可能性のある蛍光灯から来る直接励起光を廃棄するために、適切なフィルタがライトパスに配置されていることを確認してください。 - 顕微鏡ノブを使用して細菌に目的を集中させます。
- 電動ステージを制御するジョイスティックを使用して翻訳することにより、サンプル内の関心領域を選択します。
注:蛍光性の高いサンプルを使用すると、蛍光を目で直接見ることができるため、焦点を合わせる方が簡単です。 - FLIM-FRET測定用の2PEレーザーの励起を切り替えます。
- 蛍光放射経路を検出器に向かって送り返します。
- フィルターキューブタレットを戻して、930 nmレーザー用の二色キューブを選択します。
- レーザーパワーを20mWに設定します。
- 対象領域のサイズを 30 μm に設定します。この操作は、ガルボミラーを動作する電圧を調整し、その動きの範囲を定義します(図5)。
- 検出器をオンにしてサンプルのスキャンを開始 - スキャンを制御する開始ボタンと停止ボタンは、安全上の理由からレーザーシャッターの開閉を制御し、サンプルの光の切り落としを制限します(図5)。
図5:顕微鏡制御ソフトウェアのインターフェースの概略表現この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 必要に応じて、顕微鏡のファインフォーカスノブを少し動かして焦点を調整します。
- コンピュータインターフェイスからステージを細かく移動して、イメージングの視野を選択します。これは、画像の新しい中心を定義する顕微鏡制御ソフトウェア(図5)で画像上の十字を移動し、 ステージの移動を押すことでセットアップできます。取得のための良い視野は、10-30不動細菌を持つ画像に対応し、すべてが正しく焦点を合わせている(すべての細菌が同じ平面上にある)。単一細胞FLIM-FRETデータを抽出することに興味がある場合は、細菌が十分に個別化されていることを確認してください(画像のセグメンテーションははるかに簡単になります)。
- SPCMソフトウェア(データ収集用の商用ソフトウェア)を開き、寿命測定に影響を与える可能性のある積み重ね効果を避けるために、光子の数が高すぎないことを確認します。必要に応じて、レーザー強度を下げて光子のカウントレートを低くします(レーザー繰り返し率の約1%)。
注:積み重ね効果は、時間相関単一光子カウント(TCSPC)デバイスのデッドタイムのために、高い光子数率で失われた光子の影響を記述します。Pile-Up が発生すると、測定された平均寿命は人工的に短くなり、高速発光フォトンのオーバーサンプリングにより減衰に現れる可能性のあるコンポーネントが短くなる可能性があります。 - 取得収集時間を含む取得パラメータを調整します(通常、60~180 sは十分なフォトンを収集する必要があります)。
- [スタート]ボタンを押して、取得が完了するのを待ちます。
- データを保存します。
- サンプルのスキャンを停止し、検出器をオフにします。
- サンプルで別の視野を選択し、手順6.14-6.22を繰り返すか、手順6.1~6.22を繰り返して新しい顕微鏡スライドを画像化します。
注 :P.緑分化 は、アガロースパッドの室温で最大6〜8時間生きて分割することができます(20°Cで最後に〜4倍の時間に対応)。理想的には、完全に細菌で覆われたパッドを観察しないように、FLIM-FRET測定を行うためにあまりにも長く待たないでください。
7. データ分析
図 6: SPCImage ソフトウェアのデータ分析ウィンドウのメイン パネル.強度画像(青いボックス)、生涯画像(紫色のボックス)、生涯ヒストグラム(右上)、選択した位置の減衰曲線(緑色のボックス)、および家庭用2枚光子励起FLIM-FRETのbh SPC830取得カードを使用してライブ P.エルギノーザ で記録された代表的なPvdA-eGFP減衰の選択された位置(シアンボックス)での減衰パラメータ。上の画像で指しているピクセルの実験的減衰曲線は、その計算された器械応答関数(緑色の曲線)から減衰をデコンボルチングするその単一指数フィット(赤曲線)が緑色のパネルに見える。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 基本分析
- SPCImage ソフトウェアを実行します。
- 保存した SPCM ファイルをインポートします。強度イメージは、ソフトウェアの左上パネルに表示されます(図6 青いボックス)。
- 減衰曲線ウィンドウ (図 6 緑色のボックス) を調べて、輝度イメージで選択したピクセルに対応する減衰データを表示します (図 6 青のボックス)。各時間チャネルのフォトン番号は青い点で表示され、減衰のフィット感は赤い線で描かれます。データを読み込んだ後、ソフトウェアは画像の最も明るいピクセルを表示します。画像に青い十字を移動して、低輝度のピクセルを調べます。Decay ウィンドウは、新しいピクセル位置ごとに自動的に更新されます。
注:レーザースキャンシステムのインストゥルメンタル応答機能(IRF)の測定は非常に困難です。FLIMデータの蛍光減衰曲線の立ち上がりエッジから計算されたIRFは、減衰デコンボリューションに使用できます。これは SPCimage でデフォルトで行われるオプションです (図 6 の緑色の曲線)。 - フィッティングボックスの開始チャンネルと終了チャネル(緑のボックスのT1とT2)を移動して、フィッティング範囲を調整します。T1は、上昇減衰の最初の数チャンネルから始まり、T2は減衰の終わりに最後のチャネルを定義し、フォトンカウントオフセット(すなわち、減衰が上昇する前に数える光子のレベル)の上にフォトンの数を持つ崩壊の最後のチャネルの1つとして選択することができます。
- ビンの値を変更して、ビンを選択します。カーブ減衰は、選択したピクセルのフォトンカウントと、bin パラメータで定義されたカーソル位置の周囲の i ピクセルの領域を統合します(ビニングを増やすと、減衰中のフォトン数が増加し、多指数モデルに必要なフォトン数に達するのに役立ちます)。
- しきい値を調整します。しきい値より多いフォトン数を持つチャネルが少なくとも 1 つもないピクセルは、フィッティング手順に含まれません。もちろん、ピクセル数が多いほど、解析は長くなります。
注: FLIM データには、膨大な数のピクセルとタイム チャネルを含めることができます。ソフトウェアの最後のバージョンでは、GPU(グラフィックスプロセッサユニット)を使用して多数のピクセルを並列に処理できるため、処理時間が大幅に短縮されます。最も低い蛍光強度を示す細菌構造に対応する画像を使用して、ビニングと閾値パラメータを調整することは興味深いことがあります(例えば、発現レベルが最も低い細菌株を有する)。これにより、これらのサンプルで観測された関連する減衰がフィルタリング基準を満たし、解析に含められます。これらのパラメータは、すべての画像に使用できます。 - 必要に応じて、減衰パラメータ(シアン ボックス)を調整します。シフトを変化させ、減衰関数を見ると、その寄与が無視できる場合、ほとんどの時間の散乱とオフセットをゼロに固定できます。オフセットは、崩壊の最初のチャネルを見て推定することができます - サンプルの低い蛍光による長時間のイメージングは、通常、ゼロ以外のオフセットになります。散乱は主に厚いサンプルで発生し、そうでなければ無視できると考えることができます。
- フィットを実行する前に、フィッティングアルゴリズムを選択します。 [モデルオプションの表示/非表示]でアルゴリズム設定ウィンドウを開きます。最尤推定(MLE)アルゴリズムを選択します (図 7A)。
- [減衰行列の計算] をクリックして、イメージのフィッティング|実行します。完了すると、生涯エンコードされた FLIM イメージが生涯イメージ パネルに表示されます (図 6紫色のボックス)。
注: 減衰曲線ウィンドウ (図 6 緑色のボックス) では、青い十字を動かして、画像の各ピクセルに対応する有効期間の値を確認できます。
注: 多数の類似した FLIM データ ファイルを自動的に処理するために、バッチ処理モードを使用できます。 - 残差(理想的には0の周りにランダムに分布)と1に近いカイ四角値を見て、フィットの品質を確認してください。
- 適合データは、異なる形式でエクスポートできます。txt ファイルのファイルをエクスポートするには、[ ファイル] | エクスポート.[ エクスポート オプション] ウィンドウ (図 7B)で [ すべて選択 ] をクリックし、[ エクスポート] をクリックします。
- 最後に、分析ファイルを保存します。解析ファイルは *.img ファイルとして保存され、SPCImage で直接開くことができます。
注:特に不均衡なドナー/アクセクター量の場合、FLIM-FRETは相互作用タンパク質複合体の混合物中の亜集団を明らかにすることができます - 特に2つのパートナーの濃度が非常に異なっている場合、複雑な種と自由な種の混合物をもたらします。非相互作用種(ドナーのみの崩壊に非常によく似た崩壊を特徴とする)は、データセット全体のドナー生涯成分の空間的不変性を仮定して相互作用する種から区別することができる。同様に、非ストイチオメトリック相互作用複合体は、より多くのドナーまたは蛍光のより多くのアクセクターのいずれかと形成され得る。このような複合体の蛍光崩壊は、通常、解釈するのが難しい。FLIM 図プロットを使用して、PPI20,23のストイチオメトリーと結合モードに関する重要な情報を提供できます。FLIM 図プロットは、最短寿命成分をその振幅の関数としてグラフィカルに表現したものです。これは、同様の減衰シグネチャを持つピクセルを視覚化するために使用できます。このような表現を描くためには、実験的な蛍光崩壊は2つの指数モデルを取り付ける必要があります。次の手順は、このプロセスのガイドです。 - まず、ドナーのみの建設のデータを分析します。これは、ドナーの生涯価値を決定することができます.理想的には、ドナー/アクセクサの構造と同じ条件で記録された複数の画像に対してこの値を測定し、ドナーの堅牢な生涯価値を取得します。
- 一度決定, 2指数モデルとドナー/アクセクサ構造の蛍光崩壊を適合させます.シアンの減衰パラメータ ボックス (図 6)で、コンポーネントの数を 2 に設定します。ステップ 1 で決定されたドナーの堅牢な有効期間値に t2(ps) パラメータを修正し、このパラメータを修正するボックスをオンにします。
注: オーバーフィットを制限するために寿命の長い τ2 を修正し、フィッティング収束を改善し、より信頼性の高い 2 指数フィット パラメータ24、25、26を得ることが重要です。 - *imgファイルを保存し、ステップ7.1.11のようにデータを *.asc ファイルとしてエクスポートします。
図 7: (A) 指数モデルで減衰を適合させるアルゴリズム設定適合モデルとして MLE (最高尤アルゴリズムまたは最尤推定、MLE) を選択し 、(B) エクスポートオプションウィンドウを選択します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- RのFLIM画像の高度な分析
- 必要に応じて R (https://cran.r-project.org) と RStudio (https://rstudio.com) をインストールします。
- RStudio を開き、新しいプロジェクトを作成します。
- プロジェクトのメインフォルダにある「データ」というフォルダ内のすべての解析 *.asc ファイルを移動します。
- 新しいスクリプト ファイルを開きます (または、補助スクリプト FLIM_analysisを開きます。R)。
- flim データ分析https://github.com/jgodet/flimDiagRam用の専用 flimDiagRam パッケージをインストールします。ワークスペースでパッケージを呼び出します。(HowTo_FlimDiagRam通知を参照)
注: パッケージのインストールは 1 回だけ行う必要があります。インストール後、パッケージは新しい R セッションから呼び出すことができます。github から R パッケージをダウンロードするには、'devtools' パッケージをインストールする必要があります。devtools のインストールには数分かかることがあります。 flimDiagRam パッケージを使用して、FLIM データのパラメーターと分布を表し、単一の個別化セルのレベルで FLIM データを抽出し、条件またはひずみで FLIM 結果を比較し、FLIM 図プロットのような高度な視覚化ツールを使用して FLIM データを探索することができます。 - ステップバイステップのコメントコードを使用すると、データは、以下の「代表結果」セクションに記載されているすべてのサブ数値を個別に再現するために利用可能になります。このチュートリアルは、https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdfのHowTo_FlimDiagRam通知で見つけることができます。コードは、データを分析するために簡単に転置することができます。
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Representative Results
異なる細菌株について測定された蛍光寿命の経験的累積分布関数(ecdf)を図8に示す。FRET が発生すると、ecdfs は短寿命に向かってシフトされます (図 8A,8B)。なお、2つのタンパク質の相互作用が2つの蛍光動物間の長距離化を生じると、FRETが発生しきれないことに注意してください(図8C)。この状況は、FLIM の 2 つのパートナー間の相互作用の欠如と区別できません。したがって、色素間距離が分子モデルまたは複合体の既知のアーキテクチャから予測できない場合は、相互作用を探査する機会を最大化するために異なる位置でタンパク質にラベルを付けることを検討することが重要です。同様に、PvdA(高発現)と非リボソームペプチド合成酵素PvdL(細胞当たり少数コピー)のタンパク質発現の差が大きいため、同じPvdA/PvdL複合体は類似のFLIM-FRETデータを生み出さない。実際、不均衡な量論はFLIM-FRETデータの解釈を複雑にする可能性があります。どのタンパク質がドナーと標識されているかに応じて、アンバランスのストイチオメトリーは、記録された蛍光寿命分布における結合ドナー標識タンパク質と比較して、遊離の寄与の違いにつながる(図8A,8B)。
図8:ドナーで起こる変化の図は、FRET(単一指数モデル)に応答して蛍光寿命分布を意味する。PvdA(青色の形態)(AおよびB)またはPvdJ(黄色の形態)(C)eGFP(緑色)またはmCherry(赤)蛍光タンパク質とのPvdL(灰色の形態)の相互作用の表現。経験的累積分布関数(下のグラフ)は、蛍光寿命分布の違いを明確に示すことができます。(A) 蛍光のドナーで標識された過剰なPvdAの存在下では、eGFPドナーの平均生涯分布は、FRETを受け取らず、FRETを受けている少数のドナーの生涯をmCherry-PvdLと統合するドナーによって支配される。この状況では、混合物の寿命分布(緑色オレンジ曲線)は、ラベルなしPvdLのみで形成された同じ混合物の寿命分布(緑色曲線)に近い。(B) ラベルの順序が変更され、アクセプターで標識された過剰なPvdAが存在する場合、平均寿命分布は、複数のアクセプターを持つFRETを受けるドナー(オレンジ曲線)を含む、移動種によって支配される。したがって、この分布は、ラベルなしPvdA(緑色の曲線)で形成された同じ複合体とは大きく異なります。(C)タンパク質が相互作用しないために FRET が発生しない場合、または色素間距離が複合体内で大きすぎるために、生涯分布の変化はドナーのみの変化とほとんど超インポスブルである(PvdJ-eGFP/mCherry-PvdL の蛍光寿命分布に対応する光緑色曲線を PvdJ-eGFP に対応する緑色曲線と比較する)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図表プロットを使用して、 図 9に示すように、ストイチオメトリーに関する重要な情報を提供できます。PvdA-eGFP/mCherry PvdL変異体では、ドナーラベル付きPvdAの量はmCherry PvdLの量よりもはるかに高く、サンプル中に存在するすべてのドナーの中で、そのうちのほんの一部がPvdLと相互作用している。 図9Aでは、〜2.3nsを中心とする単一のタウ1値が観察され、混合物中の種の約30〜40%を表す。単一のτ1値は、各PvdA-eGFPドナーが1つのmCherry PvdLアクセパクタでのみ転送できることを示唆している。
逆標識(PvdA-mCherry/eGFP PvdL)から、ほとんどのeGFP PvdLタンパク質はPvdA-mCherryと相互作用すると予想されます。これは、より高い値に向かってシフトされるalpha1値によって確認されます。さらに、tau1値は、生存期間が〜1.5ns以下の短命種の出現により、はるかに分布(図9B)となりました。これは、 図9A の状況と比較して追加の転写が起こり、したがって、複数のPvdAタンパク質が単一のPvdLタンパク質に結合する可能性があることを示唆している。その結果、各複合体について、eGFPの寿命は、eGFPがエネルギーを移動しているmCherryタンパク質の数と分布に依存します。まとめると、データは各PvdLタンパク質が複数のPvdAタンパク質と相互作用できることを示唆している
図9:過剰のドナー(A)またはアクセプタ(B)および複数の結合部位の場合のFLIM図プロット。 FLIM 図プロットは、2指数適合を使用して取得したFRETを受けるドナーの崩壊成分に含まれる特定の情報を提供します。PvdA-eGFP/mCherry-PvdL変異体(A)では、単一のタウ1値が観察され、横軸上のデータポイントの散乱位置によって与えられるその振幅は、FRETに従事するドナーの集団について有益である。PvdA-mCherry/eGFP-PvdLシステム(B)では、tau1値ははるかに分布しており、1つのPvdL(灰色の形態)タンパク質が複数のPvdA(青色形態)タンパク質と相互作用する可能性があることを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
FLIM-FRET は、強度ベースの FRET イメージングに対していくつかの重要な利点を提供します。蛍光寿命は、蛍光の本質的なパラメータである。その結果、光励起の強度に依存しない蛍光色素の局所濃度に依存しない。蛍光寿命はまた、光漂白によっても影響を受けにくい。特に、局所タンパク質濃度が細胞内の区画または領域全体で非常に不均質である可能性がある細胞内のPPIを証明することは興味深いものです。FLIM-FRETは、両方のタンパク質またはタンパク質の1つの発現レベルが低いため、複合体の濃度が低いすべての状況でも興味深いものです。
PPIの文脈では、FRETメカニズムは寿命の短縮を担当し、したがって相互作用の性質に関する情報は、平均寿命のみを考慮すると推測するのが難しい。実際、平均的な寿命の短縮は、中程度のFRETと相互作用する種の割合が高いか、アクセクサと短い距離で相互作用するドナーの低い割合と反対に起因する可能性があります。不均衡なストイチオメトリーを持つ複合体が形成されると、この状況はさらに複雑になります。複数の次元を表現できるグラフィカルな視覚化ツール (図のプロット τ1 の場合は、アルファおよび
目的のタンパク質にタグを付ける方法を選択することは、FLIM-FRET実験を成功させるための重要なポイントです。 最も重要なのは、タグはタンパク質の相互作用を変更または変更してはならない。残念ながら、タンパク質の構造が既知であるか予測できるまれなケースを除いて、ほとんどの場合、1つは試行錯誤アプローチを余儀なくされます。したがって、エネルギー伝達がない場合のFLIM-FRETの解釈は、ラベルが相互作用を変える可能性を常に考慮する必要があります。このため、FLIM-FRETは、相互作用が観察された場合、標識の不在の中に存在するべきであるという意味で確認的手法と見なすことができる。二重に標識されたタンパク質を発現する変異株によるピオーバージンの産生が野生型株に似ているかどうかを確認するような外部機能読み出しの処分は、FLIM-FRETの結果を解釈するのに特に有用である。
イメージングは PPI を検出するためのハイスループットな方法ではなく、これまで、疑わしい PPI または予測された PPI を確認するために利用されてきました。この確認的な文脈では、分析をデータからできるだけ多くの情報を抽出させることは、PPIに関与するメカニズムをより深く理解するのに理にかなっています。スクリーニング戦略に適合したFLIM-FRETセットアップを回すために、29、30、31のいくつかの試みが行われています。高度な容易な利用および自動化された分析を開発することはハイ スループットのスクリーニング方法によって作り出される大量のデータを処理する可能性を保障する。このコンテキストでは、高カウント統計を必要とする最小二乗法を使用したフィッティング手順は、FRET の推定に適していない可能性があります。非適合法を含む、さまざまな代替方法が開発されています16,32(Padilla-Parraら. 2011 33でレビュー).これらの方法は、計算速度、適切な分析、精度、複雑さ、効率的に処理できるデータの種類に必要な光子の最小数が異なります。相互作用するドナー34、またはフェーザアプローチ35、36、37の最小割合のような技術は、FRET-FLIMで高速取得を実行し、大量のデータを処理したり、ビデオレート速度に達するために定量的である可能性があります。
細胞内のタンパク質の本来の機能を乱さない蛍光標識タンパク質を構築するという要件は、探索されるPPIの速度と数を拡大するための主要な懸念事項です。低分子蛍光原性プローブ38、39に基づく代替の新しいラベリング戦略は、この重大な限界を回避する方法であってもよい。FLIM-FRETと互換性があり、他の細胞成分(核酸や膜など)に標識することができる蛍光プローブを処分すると、FLIM-FRETが特徴付けることができる相互作用の性質も広がります。
近い将来、FLIM-FRET分野における最大のブレークスルーは、データ処理の革新から生じると考えています。圧縮センシング40のような方法は、まばらな崩壊データからのFLIM画像の効率的かつ正確な再構築を可能にする必要があります - おそらく急速に変化するプロセスでリアルタイムFLIM-FRETを実行することを可能にする取得速度をさらにスピードアップします。同様に、ピクセル分類や回帰に関するFLIMデータに適用される機械学習は、脱ノイズまたは信号復元により、FRET-FLIM法41,42の関心をさらに高める優れた画像再構成および分析を可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、FLIMデータ収集及びFLIMセットアップの技術的なメンテナンスと開発に関する彼の貴重な支援のためにルドヴィック・リヒャレット博士を認める。この作品は、フォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・アン・チミー(https://icfrc.fr/)からの助成金によって資金提供されました。VNは、フォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・メディカル(FRM-SPF201809006906)によって資金提供されています。YMは、フランス大学(IUF)の支援と研究に専念する追加の時間を提供してくれたことに感謝しています。IJSとJGは、ストラスブールの薬物送達研究所の財政支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
References
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