我们描述了一个简单的方案,从从 Xenopus laevis 胚胎分离的深层皮球细胞中开发粘膜上皮器官。多能祖细胞再生上皮杯细胞前体,并允许实时跟踪器官表面细胞过渡的开始和进展。
粘膜上皮通过粘液生产和硅基介质间隙去除异物颗粒,从而提供了第一线。粘膜上皮的许多临床相关缺陷在体内深处发生时被推断。在这里,我们介绍了一个可处理的3D模型,用于从 Xenopus laevis 胚胎中微外科分离的多能祖体产生的粘膜上皮。粘膜上皮器官覆盖着来自深层异体细胞的新生成的上皮,随后用不同图案的多分细胞、分泌细胞和粘液产生的杯状细胞装饰,这些细胞在24小时内与原生表皮无法区分。在器官的面体表面出现的动态细胞从中层到上皮的完整序列可以通过高分辨率实时成像来跟踪。这些体外培养、自组织粘膜上皮器官在研究具有高效生成、明确培养条件、控制数量和大小以及在分化上皮再生期间直接获得活体成像的粘膜上皮生物学方面具有明显优势。
粘膜上皮的损伤、感染和疾病与粘液的生产和清除受损有关,这些粘液经常出现在肺疾病中,如慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、支气管结裂和原发性硅酸肌病 1、2、3、4。例如,最近器官技术的进步,基底细胞衍生的肺器官称为气道层,它重述了粘膜上皮的再生,成为具有治疗潜力1、5、6的有希望的模型。然而,其使用目前是有限的,部分原因是缺乏明确的培养条件和器官生产效率低下。人类气道和青蛙表皮的粘膜上皮在组织形态、细胞组成及其功能7、8、9、10、11、12方面非常相似。在这两种生物体中,粘膜上皮通过分泌粘液和抗菌物质提供一线防御,并通过硅丝的同步作用清除有害的颗粒和病原体。
在这里,我们描述了一个简单的协议,使用Xenopus laevis胚胎13,14的多能祖体生成粘膜上皮器官。此前,我们报告14,在没有外源生长因子和细胞外基质的情况下,从早期胃膜分离的深细胞从早期胃膜中自发聚集成聚合体,在其表面再生上皮,并在24小时内通过交算多生生细胞和其他附属细胞成熟成粘膜上皮。除了快速发展,该协议提供了一个独特的机会,直接访问多能深层外皮细胞过渡到上皮杯状细胞祖细胞祖细胞,重新夺回被破坏的上皮14的再生步骤,这是不能从完整的胚胎和外皮(也称为动物帽)15,16,17。通过控制Xenopus胚胎的起始材料,所生产的器官的数量和大小可以高效扩展。浮动培养物中的有机物可以很容易地在所需的阶段进行分类和转移,以便进行进一步分析,包括高分辨率成像、机械测试、药物治疗和遗传表征14。这种自发的、组织力学驱动的胚胎细胞表面上皮再生,可产生粘膜上皮器官,为研究粘膜上皮生物学提供了一个新的三维(3D)模型。
由X.laevis胚胎深层外皮细胞产生的粘膜上皮器官是研究体外多能祖细胞的上皮化和分化的有力工具。与广泛采用的动物帽测定16用于体外器官发生13和粘膜上皮15,17,22的发展,利用完整的外皮,在该协议中呈现的深层异体衍生器官提供了一个独特的机会,监测表面上皮14的组织力学驱动的再生阶段。在大约2hpa,新生成的ZO-1阳性上皮细胞(图2)开始出现在器官的脂肪表面,并增加其数量,以覆盖整个器官组织凝固或减少符合性14。产生粘液的杯具细胞的上皮和后续血统规格的再生在一天内自发地在化学定义的培养培养中进行。这些快速发展的粘膜上皮器官提供了一个平台,用于在上皮再生的渐进步骤中实时、高分辨率地检查动态细胞行为。它们还能够调查在粘膜上皮发育、平衡和相关疾病2、9、23期间出现的基本问题。特别是,在向器官14中识别的上皮杯状细胞前体过渡过程中,深层祖细胞的机械敏感性可能有助于将与异常基底分化相关的呼吸系统疾病联系起来,其中粘液分泌的杯状细胞过度或生产不足23。
虽然该协议提供了一个简单的方法来生成这些器官,有几个关键步骤,在实验中取得成功。为了防止在从动物帽分离深层外皮细胞过程中对表面上皮细胞进行污染,应监测置于立体镜下无钙和镁 DFA 中的动物帽,并检测开始分离动物帽中深色表面层的正确时间。如果组织在无钙和无镁的 DFA 中保存太久,整个组织将分离,区分深层细胞和表面细胞,则深度外皮聚集体是不可能的。为了确认深层外皮聚集物中缺乏表面细胞,我们建议在显微手术前用NHS-罗达明(步骤1.414)荧光标记胚胎的脂肪表面;这将允许容易识别表面细胞,如果它们存在于由此产生的器官中。由于上皮再生是由组织力学14调节的,因此必须避免自组织器官产生意外的力量。特别是,我们建议在实时成像过程中避免与成像室的玻璃底部接触,将集料放置在 TEM 网格的边缘,因为这样可以自由接触实时聚合的成像窗口(步骤 5.1.2.)。这种体外培养的、自行组织的粘膜上皮3D模型将作为一个可操作的工具,回答上皮再生过程中出现的基本问题和杯具细胞的谱谱规范。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢金实验室和兰斯戴维森的成员的评论和支持。这项工作得到了基础科学研究所(IBS-R0250Y1)青年科学家研究金HYK的支持。
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |