אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.
אפיתל Mucociliary מספק את קו ההגנה הראשון על ידי הסרת חלקיקים זרים באמצעות הפעולה של ייצור ריר וסיווג סיווג סיליה-מתווכת. פגמים רבים רלוונטיים קלינית באפיתל mucociliary הם להסיק כפי שהם מתרחשים עמוק בתוך הגוף. כאן, אנו מציגים מודל תלת-מימדי נשלף לאפיתל ריקוצילי המופק מנביאים רב-תכליתיים שהיו מבודדים מיקרוכירורגית מעוברי קסנופוס לאבי. אורגנואידים אפיתל mucociliary מכוסים אפיתל שנוצר לאחרונה מתאי ectoderm עמוקים ומאוחר יותר מעוטרים בתאים מרובי דפוס שונים, תאי הפרשה, ותאי גביע ייצור ריר כי הם לא ניתן להבחין בין האפידרמיס היליד בתוך 24 שעות. הרצפים המלאים של מעברי תאים דינמיים מ mesenchymal לאפיתל כי להגיח על פני השטח apical של אורגנואידים ניתן לעקוב על ידי הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה. אלה במבחנה, ארגון עצמי אורגנואידים אפיתל mucociliary מציעים יתרונות ברורים בלימוד הביולוגיה של אפיתל mucociliary עם יעילות גבוהה בדור, תנאי תרבות מוגדרים, שליטה על מספר וגודל, וגישה ישירה להדמיה חיה במהלך התחדשות האפיתל המבדיל.
פציעה, זיהום, ומחלה של אפיתל רימוני קשורים ייצור לקוי ואישור של ריר אשר נמצא לעתים קרובות בהפרעות ריאתיות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית, אסטמה, סיסטיק פיברוזיס, bronchiectasis, ו dyskinesia ciliaryהראשי 1,2,3,4. התקדמות לאחרונה בטכנולוגיית אורגנואיד, למשל, התא בסיס נגזר אורגנואיד ריאות הנקרא tracheosphere המהסכם את ההתחדשות של אפיתל mucociliary להתעורר כמודל מבטיח עם פוטנציאל טיפולי1,5,6. עם זאת, השימוש בו מוגבל כיום, בין השאר בשל היעדר תנאי התרבות המוגדרים ויעילות נמוכה בהפקות אורגנואידים. אפיתל Mucociliary באפידרמיס דרכי הנשימה והצפרדע האנושי דומים להפליא מורפולוגיה רקמות, הרכב התא,ואת הפונקציה שלה 7,8,9,10,11,12. בשני האורגניזמים, אפיתל mucociliary מספק הגנה קו ראשון על ידי הפרשת ריר וחומרים מיקרוביאליים ומנקה חלקיקים מזיקים ופתוגנים באמצעות הפעולה המסונכרנת של cilia.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור אורגנואידים אפיתל mucociliary באמצעות האבות הרב-תכליתיים של עוברי Xenopus laevis 13,14. בעבר, דיווחנו14 כי בהיעדר גורמי גדילה אקסוגניים והמטריצה החוץ תאית, תאים עמוקים מבודדים מיקרוכירורגית מן ectoderm שלב gastrula מוקדם באופן ספונטני להרכיב לתוך אגרגטים, לחדש את האפיתל על פני השטח שלה, ולהבשיל לתוך אפיתל mucociliary על ידי intercalating רב תאים אביזר אחרים בתוך 24 שעות. בנוסף להתפתחות המהירה, פרוטוקול זה מציע הזדמנות ברורה לגישה ישירה למעברים של תאים ectoderm עמוק רבפוטנטי לתוך אבות תאי גביע אפיתל המשנים את צעדי ההתחדשות של אפיתלמשובש 14 אשר אינם זמינים עוברים שלמים ectoderm (המכונה גם כובע בעליחיים) 15,16,17. המספר והגודל של האורבנואידים המיוצרים ניתנים להרחבה ביעילות גבוהה על ידי שליטה בחומרים ההתחלתיים של עוברי קסנופוס. אורגנואידים בתרבות צפה ניתן למיין בקלות ומועבר בשלב הרצוי לניתוחים נוספים, כולל הדמיה ברזולוציה גבוהה, בדיקות מכניות, טיפול תרופתי, אפיוןגנטי 14. זה ספונטני, מכניקת רקמות מונעת התחדשות של האפיתל על פני השטח של אגרגטים תא עוברי תוצאות אורגנואידים אפיתל mucociliary ולספק מודל תלת מימדי רומן (3D) כדי ללמוד את הביולוגיה של האפיתל mucociliary.
אורגנואידים אפיתל Mucociliary המופק מתאי ectoderm עמוקים של העובר X. laevis הם כלי רב עוצמה כדי ללמוד את האפיתל והבידול של נביאים רב עוצמה במבחנה. בניגוד למאגר כובע בעליחיים מאומץ נרחב 16 המשמש במבחנה organogenesis13 ופיתוח אפיתליה mucociliary15,17,22 המנצלים את ectoderm שלם, אורגנואידים נגזר ectoderm עמוק המוצג בפרוטוקול זה מציעים הזדמנות ברורה לפקח על שלבי התחדשות מונחה מכניקת רקמות של אפיתלפני השטח 14. בסביבות 2 hpa, החדש שנוצר ZO-1 תאי אפיתלחיוביים (איור 2)מתחילים להופיע על פני השטח apical של אורגנואידים ולהגדיל את האוכלוסייה שלהם כדי לכסות את האורגניואיד כולו כמו הרקמה להתגבש או מפחית אתהתאימות 14. ההתחדשות של האפיתל ומפרטי תוחם הבאים עבור תאי גביע ייצור ריר להמשיך באופן ספונטני בתקשורת תרבות המוגדרת כימית בתוך יום. אורגנואידים אפיתל mucociliary המתפתחים במהירות לספק פלטפורמה לבחון התנהגויות תאים דינמיים בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה, במהלך צעדים מתקדמים של התחדשות אפיתל. הם גם מאפשרים חקירה של שאלות בסיסיות המתעוררות במהלך פיתוח אפיתל mucociliary, הומוסטאזיס,ומחלות קשורות 2,9,23. בפרט, הרגישות המכנית של תאי אב רבי עמוק במהלך המעבר מבשרי תא גביע אפיתל שזוהו באורגנואידים14 עשוי לשמש לקשר מחלות נשימה הקשורות בידול בסיס חריג שבו תאי גביע הפרשת ריר הם מעל- או מתחת מיוצר23.
בעוד פרוטוקול זה מציע גישה פשוטה כדי ליצור אורגנואידים אלה, ישנם מספר צעדים קריטיים להצלחה בניסויים. כדי למנוע זיהום של תאים אפיתל שטחיים במהלך הבידוד של תאים ectoderm עמוקים מכובע בעלי החיים, יש לפקח על כובע בעלי החיים להציב בסידן- ומגנזיום ללא DFA תחת סטריאוסקופ ולזהות את הזמן הנכון ליזום את ההפרדה של שכבה שטחית כהה פיגמנט של כובע בעלי החיים. אם הרקמה נשמרת ב- DFA ללא סידן ומגנזיום במשך זמן רב מדי, הרקמה כולה תנתק ותבדיל בין תאים עמוקים וחלניים יהיה בלתי אפשרי עבור אגרגטים ectoderm עמוק. כדי לאשר את היעדרם של תאים שטחיים בצרפיectoderm עמוקים, אנו ממליצים באופן פלורסנטי תיוג פני השטח apical של העובר עם NHS-rhodamine (שלב1.4 14)לפני מיקרוכירורגיה; זה יאפשר זיהוי קל של תאי פני השטח אם הם קיימים באורגן שנוצר. מאז התחדשות אפיתל מוסדר על ידימכניקת רקמות 14, זה חיוני כדי למנוע ייצור כוח לא מכוון עבור אורגנואידים ארגון עצמי. בפרט, אנו מציעים להימנע ממגע עם תחתית הזכוכית של תא ההדמיה במהלך הדמיה חיה על-ידי הצבת אגרגטים בקצוות רשתות TEM כפי שזה מאפשר מגע חופשי עם חלון ההדמיה של אגרגטים חיים (שלב 5.1.2.). זה במבחנה–תרבותי, מודל 3D מאורגן עצמית עבור אפיתל mucociliary ישמש ככלי לגרירה כדי לענות על השאלות הבסיסיות המתעוררות במהלך התחדשות של אפיתל מפרט תולדות של תאי גביע.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מעבדת קים ולאנס דוידסון על הערותיהם ותמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מדען צעיר HYK מהמכון למדע בסיסי (IBS-R0250Y1).
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |