हम ज़ेनोपस लेविस भ्रूण से अलग गहरे एक्टोडर्म कोशिकाओं से म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। बहुपेंट प्रोजेनिटर एपिथेलियल गोबलेट सेल अग्रदूत को पुनर्जीवित करते हैं और ऑर्गेनॉइड की सतह पर कोशिका संक्रमण की दीक्षा और प्रगति की लाइव ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं।
म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम बलगम उत्पादन और सिलिया-मध्यस्थता निकासी की कार्रवाई के माध्यम से विदेशी कणों को हटाकर रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम में कई चिकित्सकीय प्रासंगिक दोष अनुमानित होते हैं क्योंकि वे शरीर के भीतर गहरे होते हैं। यहां, हम मल्टीपॉटेंट प्रोजेनिटर से उत्पन्न म्यूकोसिलीरी एपिथेलियम के लिए एक ट्रैक्टेबल 3 डी मॉडल पेश करते हैं जो ज़ेनोपस लेविस भ्रूण से सूक्ष्म रूप से अलग थे। म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड को गहरे इक्टोडर्म कोशिकाओं से नए उत्पन्न एपिथेलियम से कवर किया जाता है और बाद में अलग-अलग पैटर्न वाली बहुआयामी कोशिकाओं, गुप्त कोशिकाओं और बलगम-उत्पादक गोबलेट कोशिकाओं से सजाया जाता है जो 24 घंटे के भीतर देशी एपिडर्मिस से अविवेच्य होते हैं। मेसेन्चिमल से एपिथेलियल तक गतिशील कोशिका संक्रमण के पूर्ण दृश्यों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग द्वारा ट्रैक किया जा सकता है। ये इन इन विट्रो सुसंस्कृत, स्व-आयोजन म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड पीढ़ी में उच्च दक्षता के साथ म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियम के जीव विज्ञान का अध्ययन करने में अलग-अलग लाभ प्रदान करते हैं, संस्कृति की स्थिति को परिभाषित करते हैं, संख्या और आकार पर नियंत्रण, और विभेदित एपिथेलियम के उत्थान के दौरान लाइव इमेजिंग के लिए सीधी पहुंच।
म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम की चोट, संक्रमण और रोग बिगड़ा उत्पादन और बलगम की निकासी से जुड़े होते हैं जो अक्सर फेफड़े के विकारों जैसे क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस, ब्रोंकिकेसिस, और प्राथमिक सिलियरीडाइस्किनेशिया1,2,3, 4में पायाजाताहै। ऑर्गेनॉइड तकनीक में हाल ही में एक अग्रिम, उदाहरण के लिए, बेसल सेल ने फेफड़ों के ऑर्गेनॉइड को ट्रेकोस्फीयर कहा जो म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियम के पुनर्जननको चिकित्सीय क्षमता1,5,6के साथ एक आशाजनक मॉडल के रूप में उत्पन्न करता है। हालांकि, इसका उपयोग वर्तमान में सीमित है, क्योंकि परिभाषित संस्कृति की स्थिति की कमी और ऑर्गेनॉइड प्रोडक्शंस में कम दक्षता है। मानव वायुमार्ग और मेंढक एपिडर्मिस में म्यूकोसिलीरी एपिथेलियम ऊतक आकृति विज्ञान, सेलुलर संरचना और इसकेकार्य7,8,9,10, 11,12में उल्लेखनीय रूप से समान हैं। दोनों जीवों में, म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम बलगम और रोगाणुरोधी पदार्थों को स्रावित करके पहली पंक्ति की रक्षा प्रदान करता है और सिलिया की समकालिक कार्रवाई के माध्यम से हानिकारक कणों और रोगजनकों को साफ करता है।
यहां, हम ज़ेनोपस लेविस भ्रूण13, 14के बहुपेंट प्रोजेनिटर का उपयोग करके म्यूकोसिलीरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पहले, हमने14 की रिपोर्ट दी थी कि बहिर्जात विकास कारकों और बाह्य मैट्रिक्स के अभाव में, माइक्रोसर्जिकल रूप से अलग-थलग गहरे कोशिकाओं को प्रारंभिक गैस्ट्रुला चरण से अनायास ही एकत्रित किया जाता है, इसकी सतह पर एपिथेलियम को पुनर्जीवित किया जाता है, और 24 घंटे के भीतर बहुसांशित और अन्य सहायक कोशिकाओं को इंटरकल करके म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम में परिपक्व होता है। तेजी से विकास के अलावा, यह प्रोटोकॉल सीधे एपिथेलियल गोब्लेट सेल जनकों में बहुपंत गहरी ectoderm कोशिकाओं के संक्रमण तक पहुंचने के लिए एक अलग अवसर प्रदान करता है जो एक बाधित एपिथेलियम14 के पुनर्जनन चरणों को पुनः प्राप्त करता है जो अक्षुण्ण भ्रूण और ectoderm (जिसे पशु कैप के रूप में भी जाना जाता है)15,16,17से उपलब्ध नहीं हैं। उत्पादित ऑर्गेनॉइड की संख्या और आकार ज़ेनोपस भ्रूण से शुरुआती सामग्रियों को नियंत्रित करके उच्च दक्षता के साथ स्केलेबल हैं। फ्लोटिंग संस्कृति में ऑर्गेनॉइड को आसानी से हल किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए वांछित चरण में स्थानांतरित किया जा सकता है, जिसमें उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग, यांत्रिक परीक्षण, दवा उपचार और आनुवंशिक लक्षण वर्णन14शामिल हैं। भ्रूणीय कोशिका की सतह पर एपिथेलियम का यह सहज, ऊतक यांत्रिकी-चालित पुनर्जनन म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड में परिणाम देता है और म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल प्रदान करता है।
एक्स लेविस भ्रूण की गहरी ectoderm कोशिकाओं से उत्पन्न म्यूकोसिलीरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड विट्रो में बहुपसंत जनकों के एपिथेलिलाइजेशन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। इन विट्रो ऑर्गेनोजेनेसिस13 के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यापक रूप से अपनाए जाने वाले पशु कैप परख16 और म्यूकोसिलिएरी एपिथेलिया15,17,22 के विकास के विपरीत जो अक्षुण्ण ectoderm का उपयोग करते हैं, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत गहरे ectoderm-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड सतह एपिथेलियम14के ऊतकों के यांत्रिकी संचालित पुनर्जनन चरणों की निगरानी करने के लिए एक अलग अवसर प्रदान करते हैं। लगभग 2 एचपीए में, नए उत्पन्न जेडओ-1 सकारात्मक एपिथेलियल कोशिकाएं(चित्रा 2)ऑर्गेनॉइड की एपिकल सतह पर दिखाई देने लगती हैं और पूरे ऑर्गेनॉइड को कवर करने के लिए अपनी जनसंख्या में वृद्धि करती हैं क्योंकि ऊतक जमना या अनुपालन14को कम करता है। बलगम उत्पादक गोबलेट कोशिकाओं के लिए एपिथेलियम और बाद में वंश विनिर्देशों का पुनर्जनन एक दिन के भीतर रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति मीडिया में अनायास आगे बढ़ता है। ये तेजी से विकसित होने वाले म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड एपिथेलियल पुनर्जनन के प्रगतिशील चरणों के दौरान, उच्च-संकल्प में वास्तविक समय में गतिशील कोशिका व्यवहार की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। वे म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम विकास, होयोस्टेसिस और संबंधित रोगों2, 9, 23के दौरान उत्पन्न होने वाले मूलभूत प्रश्नोंकीजांच करने में भी सक्षम होते हैं। विशेष रूप से, ऑर्गेनॉइड14 में पहचाने गए एपिथेलियल गॉबलेट सेल अग्रदूतों में संक्रमण के दौरान गहरी जनक कोशिकाओं की यांत्रिक संवेदनशीलता असामान्य बेसल भेदभाव से जुड़े श्वसन रोगों को जोड़ने का काम कर सकती है जहां बलगम-स्राव वाली गोबलेट कोशिकाएं अधिक या कम उत्पादित23हैं।
हालांकि यह प्रोटोकॉल इन ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है, प्रयोगों में सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। पशु टोपी से गहरी ectoderm कोशिकाओं के अलगाव के दौरान सतही एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रदूषण को रोकने के लिए, एक स्टीरियोस्कोप के तहत कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त डीएफए में रखा पशु टोपी की निगरानी करनी चाहिए और पशु टोपी के अंधेरे-वर्णक सतही परत के अलगाव को शुरू करने के लिए सही समय का पता लगाना चाहिए । यदि ऊतक को कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त डीएफए में बहुत लंबे समय तक रखा जाता है, तो पूरे ऊतक गहरे और सतही कोशिकाओं के बीच अलग और भेद करेंगे, फिर गहरे ectoderm समुच्चय के लिए असंभव होगा। गहरे ectoderm समुच्चय में सतही कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट रूप से माइक्रोसर्जरी से पहले एनएचएस-रोडामाइन (चरण 1.414)के साथ भ्रूण की एपिकल सतह को लेबल करने की सलाह देते हैं; यदि वे परिणामी ऑर्गेनॉइड में मौजूद हैं तो यह सतह कोशिकाओं की आसान पहचान की अनुमति देगा। चूंकि एपिथेलियल पुनर्जनन ऊतक यांत्रिकी14द्वारा विनियमित है, इसलिए स्वयं-आयोजन ऑर्गेनॉइड के लिए अनपेक्षित बल उत्पादन से बचना आवश्यक है। विशेष रूप से, हम TEM ग्रिड के किनारों पर समुच्चय रखकर लाइव इमेजिंग के दौरान इमेजिंग चैंबर के ग्लास बॉटम के साथ संपर्क से बचने का सुझाव देते हैं क्योंकि यह लाइव समुच्चय की इमेजिंग विंडो (चरण 5.1.2.) के साथ मुफ्त संपर्क के लिए अनुमति देता है। यह इन विट्रो–म्यूकोसिलीरी एपिथेलियम के लिए स्व-संगठित 3डी मॉडल एपिथेलियम के पुनर्जनन और गोबलेट कोशिकाओं के वंश विनिर्देश के दौरान उत्पन्न होने वाले मूलभूत प्रश्नों का उत्तर देने के लिए एक ट्रैक्टेबल उपकरण के रूप में काम करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम किम लैब और लांस डेविडसन के सदस्यों को उनकी टिप्पणियों और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को इंस्टीट्यूट फॉर बेसिक साइंस (आईबीएस-आर0250वाई1) से एचवाईके के लिए यंग साइंटिस्ट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |