우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.
점액 상피는 점액 생산 및 섬모 매개 클리어런스의 작용을 통해 이물질 입자를 제거하여 첫 번째 방어선을 제공합니다. 점액 상피의 많은 임상 관련 결함은 신체 내에서 깊은 곳에서 발생할 때 유추됩니다. 여기서, 우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 미세하게 분리된 다능성 선조에서 생성된 점액 상피에 대한 관성 3D 모델을 소개합니다. 점막 상피 오르가노이드는 깊은 자궁 세포에서 새로 생성된 상피로 덮여 있으며 나중에 24 시간 이내에 토착 표피와 구별 할 수없는 뚜렷한 패턴다분면 세포, 분비 세포 및 점액 생성 잔 세포로 장식됩니다. 구가노이드의 정면에서 나타나는 상피로 백월성에서 역학 세포 전환의 전체 순서는 고해상도 라이브 이미징에 의해 추적 될 수있다. 이러한 체외 배양, 자가 조직 점막 상피 오르가노이드는 세대의 고효율, 정의된 문화 조건, 수와 크기에 대한 제어 및 차별화된 상피의 재생 중에 라이브 이미징에 대한 직접적인 접근을 통해 점막 상피의 생물학을 연구하는 데 뚜렷한 이점을 제공합니다.
점막 상피의 상해, 감염 및 질병은 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 낭포성 섬유증, 기관지증 및 1차 실모성 운동장애1,2,3,4와같은 폐 질환에서 흔히 발견되는 점액의 생산 및 통관과 관련이있다. 최근 오르가노이드 기술의 발전은, 예를 들어, 점액상의 재생을 재구성하는 기관권이라고 불리는 기저세포 유래 폐 오르간로이드는 치료 전위1,5,6을가진 유망한 모델로 서 발생한다. 그러나, 그것의 사용은 현재 제한, 부분적으로 인해 정의 된 문화 조건의 부족 과 오르가노이드 생산에 낮은 효율. 인간 기도 및 개구리 표피에서 점동 상피는 조직 형태, 세포 조성 및 그 기능7,8,9,10,11,12에서현저하게 유사하다. 두 유기체 에서 점액 상피는 점액 과 항균 물질을 분비하여 일선 방어를 제공하고 섬모의 동기화 된 작용을 통해 유해한 입자와 병원균을 지웁니다.
여기서, 우리는 제노푸스 라예비증 배아의 다성능성 선조를 사용하여 점액 상피 오르가노이드를 생성하는 간단한 프로토콜을 설명한다13,14. 이전에는 외인성 성장 인자와 세포외 매트릭스가 없는 경우 초기 가스trula 단계에서 미세 수술로 분리된 깊은세포가 자발적으로 응집체로 조립되고 표면의 상피를 재생하며 24h 내에서 다분하게 결합하여 점액 상피로 성숙했다고 14. 급속한 발전 이외에, 이 프로토콜은 다성성 심층 외형 세포의 전이에 직접 접근할 수 있는 뚜렷한 기회를 제공하며,이는 그대로 배아와 텍토더름(동물 캡으로도 알려진)15,16, 16에서사용할 수 없는 중단된 상피 세포 전조자로 의재생 단계를 재구성하는 뚜렷한 기회를 제공한다. 생산된 오르가노이드의 수와 크기는 제노푸스 배아의 시작 물질을 제어하여 고효율로 확장가능합니다. 부동 배양에서 의 오르가노이드는 고해상도 이미징, 기계적 테스트, 약물 치료 및 유전 적특성화(14)를포함하여 추가 분석을 위해 원하는 단계에서 쉽게 분류및 전달될 수 있다. 배아 세포 응집물의 표면에 상피의 이 자발적인 조직 역학 중심의 재생은 점액 상피 오르가노이드를 초래하고 점액 상피의 생물학을 연구하기 위하여 새로운 3차원 (3D) 모형을 제공합니다.
X. laevis 배아의 깊은 외래 세포에서 생성된 점막 상피 오르가노이드는 체외에서 다능성 선조의 상피화 및 분화를 연구하는 강력한 도구입니다. 시험관내유기발생(13)에 널리 사용되는 널리 채택된 동물모자분석16및 그대로 외발성 외래를 활용하는 점막상피(15,17,22)의 발달과는대조적으로, 이 프로토콜에 제시된 깊은 텍토더름 유래 오르가노이드는 표면 의약의 조직 역학 중심의 재생 단계를 모니터링할 수 있는 뚜렷한 기회를 제공한다. 약 2마마에서, 새로 생성된 ZO-1 양성 상피세포(그림2)는오르가노이드의 정표면에 나타나기 시작하고 조직이 고화되거나 규정준수(14)를감소시키는 동안 전체 오르가노이드를 커버하기 위해 인구를 증가시킨다. 점액 생성 잔 세포에 대한 상피 및 후속 계보 사양의 재생은 하루 이내에 화학적으로 정의된 배양 배지에서 자발적으로 진행된다. 이러한 급속하게 발달하는 점액 상피 오르가노이드는 상피 재생의 점진적 단계 동안 실시간으로, 고해상도로 동적 세포 행동을 검사할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 또한 점막 상피 발달, 항상성 및 관련 질환2,9,23동안 발생하는 근본적인 질문에 대한 조사를 가능하게 한다. 특히,오르가노이드(14)에서 확인된 상피 잔류세포 전구체로 전환하는 동안 깊은 전구세포의 기계적 감도는 점액분분이 있는 고블세포가 과도하게 또는23일이상 생산되는 비정상적인 기저분과 관련된 호흡기 질환을 연결하는 역할을 할 수 있다.
이 프로토콜은 이러한 오르가노이드를 생성하는 간단한 접근 방식을 제공하지만 실험에서 성공을 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 동물 모자에서 깊은 외피 세포의 격리 동안 피상상성 세포의 오염을 방지하기 위해, 하나는 입체 범위에서 칼슘과 마그네슘이없는 DFA에 배치 된 동물 모자를 모니터링하고 동물 모자의 어두운 색소 표면 층의 분리를 시작하는 적절한 시기를 감지해야합니다. 조직이 너무 오랫동안 칼슘과 마그네슘이 없는 DFA에 보관되면 전체 조직이 해리되고 깊은 세포와 피상 세포를 구별하는 것은 깊은 자궁 내체 골재에 불가능할 것입니다. 깊은 이포더름 골재에 피상적 세포의 부재를 확인하기 위해, 우리는 형광으로 미세 수술 전에 NHS-로다민 (단계 1.414)와태아의 표면을 표시하는 것이 좋습니다; 이것은 그(것)들이 결과 유기체에 존재하는 경우에 표면 세포의 쉽게 식별을 허용할 것입니다. 상피 재생은 조직 역학(14)에의해 조절되기 때문에, 자가 조직 오르가노이드에 대한 의도하지 않은 힘 생성을 피하는 것이 필수적이다. 특히, 라이브 골재의 이미징 창(Step 5.1.2)과 의 자유로운 접촉을 허용하므로 TEM 그리드의 가장자리에 골재를 배치하여 라이브 이미징 중 이미징 챔버의 유리 바닥과의 접촉을 피하는 것이 좋습니다. 이 시험관 내–점막 상피에 대한 배양, 자체 조직 3D 모델은 상피의 재생 과 잔 세포의 혈통 사양의 재생 중에 발생하는 근본적인 질문에 대답하는 견인 도구로 작용할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
김랩과 랜스 데이비슨 의 의견과 성원에 감사드립니다. 이 작품은 기초과학연구소(IBS-R0250Y1)의 HYK에 대한 젊은 과학자 펠로우십에 의해 지원되었습니다.
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |