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Biology

ऑरोरा किनेज की वास्तविक समय की निगरानी लाइव कोशिकाओं में संरचनात्मक FRET Biosensors का उपयोग करके एक सक्रियण

Published: July 30, 2020 doi: 10.3791/61611
Automatic Translation
1, 1, 1
1Univ Rennes, CNRS, IGDR (Genetics and Development Institute of Rennes), UMR 6290, F-35000 Rennes, France

Summary

Multifunctional Ser/Thr kinase AURKA की सक्रियता को Thr288 पर इसके ऑटोफॉस्फोराइलेशन द्वारा हॉलमार्क किया जाता है। FRET पर निर्भर फ्लोरोसेंट जांच इसके निष्क्रिय और सक्रिय राज्यों के बीच भेदभाव कर सकती है। यहां, हम जांच इंजीनियरिंग के लिए कुछ रणनीतियों को चित्रित करते हैं, साथ ही साथ पूरे माइटोसिस में किनेज सक्रियण का पालन करने के लिए एक तेजी से FRET प्रोटोकॉल के साथ।

Abstract

उपकला कैंसर अक्सर Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA के overexpression द्वारा हॉलमार्क किए जाते हैं। AURKA एक multifunctional प्रोटीन है जो Thr288 पर अपने ऑटोफॉस्फोराइलेशन पर सक्रिय होता है। AURKA बहुतायत माइटोसिस में चोटियों, जहां यह माइटोटिक स्पिंडल की स्थिरता और निष्ठा और माइटोसिस की समग्र दक्षता को नियंत्रित करता है। हालांकि संरचनात्मक स्तर पर अच्छी तरह से विशेषता है, सेल चक्र में AURKA के सक्रियण की एक सुसंगत निगरानी की कमी है। एक संभावित समाधान में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड Förster के अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) बायोसेंसर का उपयोग करना शामिल है ताकि AURKA के ऑटोफॉस्फोराइलेशन में पर्याप्त स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सके। यहां, हम Thr288 ऑटोफॉस्फोराइलेशन का पता लगाने वाले FRET बायोसेंसर को इंजीनियर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और माइटोसिस के दौरान इस संशोधन का पालन कैसे करें। सबसे पहले, हम संभावित दाता / स्वीकर्ता FRET जोड़े का अवलोकन प्रदान करते हैं, और हम स्तनधारी कोशिकाओं में AURKA FRET बायोसेंसर के संभावित क्लोनिंग और सम्मिलन विधियों को दिखाते हैं। फिर, हम एक कस्टम-निर्मित सेटअप पर प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) द्वारा तेजी से FRET माप के लिए एक चरण-दर-चरण विश्लेषण प्रदान करते हैं। हालांकि, यह प्रोटोकॉल उपलब्ध वैकल्पिक वाणिज्यिक समाधानों पर भी लागू होता है। हम एक AURKA-आधारित बायोसेंसर के लिए सबसे उपयुक्त FRET नियंत्रण पर विचार करके निष्कर्ष निकालते हैं, और इस उपकरण की संवेदनशीलता को और बढ़ाने के लिए संभावित भविष्य के सुधारों को उजागर करके।

Introduction

Aurora kinase A/AURKA एक multifunctional serine/threonine kinase है, जो पूरे सेल चक्र में और विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में सक्रिय है1। कैंसर में इसके व्यापक स्पैटिओटेम्पोरल सक्रियण को समझना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि AURKA को अक्सर उपकला और हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं में अतिरंजित किया जाता है, जिसमें रोगी वर्तमान में उपलब्ध उपचारों के लिए खराब प्रतिक्रिया दिखाते हैं2।

संरचनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि AURKA एक निष्क्रिय से एक सक्रिय किनेज में परिवर्तित होने के लिए दो चरणों से गुजरता है। सबसे पहले, Thr288 का ऑटोफॉस्फोराइलेशन किनेज की गतिज जेब की संरचना को बदलता है और इसे 3,4,5,6 सक्रिय करता है। यह कदम मानव कोशिकाओं में AURKA की उत्प्रेरक गतिविधि को बढ़ाता है और ज़ेनोफस laevis3,6,7 में, पूर्ण गतिविधि के लिए किनेज को भड़काता है। एक बार सक्रिय होने के बाद, Xklp2 (TPX2) के लिए लक्ष्यीकरण प्रोटीन के साथ AURKA की बातचीत एक दूसरे संरचनात्मक परिवर्तन 5 को प्रेरित करती है। यह आगे संशोधन AURKA को सेल 5,8,9,10 में अपने सब्सट्रेट ्स की ओर पूर्ण एंजाइमेटिक गतिविधि तक पहुंचने की अनुमति देता है।

लगभग दो दशकों के लिए, AURKA के सक्रियण और गतिविधि पर अंतर्दृष्टि मुख्य रूप से जैव रासायनिक दृष्टिकोण के संयोजन के माध्यम से प्राप्त की गई थी। इनमें AURKA सक्रियण, क्रिस्टलोग्राफिक विश्लेषण, और इन विट्रो या सेल्युलो किनेज assays में AURKA1 की गतिविधि की जांच करने के लिए कोशिकाओं में या विवो में फॉस्फोराइलेटेड Thr288 का पता लगाना शामिल है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों का स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन खराब या अनुपस्थित है, और इन दो घटनाओं की गतिशीलता के ज्ञान को व्यापक बनाने के लिए उपन्यास समाधानों की आवश्यकता थी।

पिछले कुछ वर्षों में फ्लोरोसेंट जांच के विकास ने लाइव कोशिकाओं में AURKA की निगरानी की सुविधा प्रदान की, जिससे अधिक से अधिक spatiotemporal रिज़ॉल्यूशन के साथ इसके सक्रियण का पालन किया जा सके। अब तक विकसित AURKA के लिए सबसे विशिष्ट सेंसर निष्क्रिय और सक्रिय AURKA के बीच भेदभाव करने के लिए FRET सिद्धांत (Förster के अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण) 11 पर भरोसा करते हैं। विकसित किया गया पहला सेंसर AURKA किनेज गतिविधि का एक सब्सट्रेट-आधारित बायोसेंसर था। सब्सट्रेट-आधारित बायोसेंसर फॉस्फोराइलेशन के लिए दिए गए किनेज द्वारा लक्षित एक छोटे अमीनोएसिडिक अनुक्रम द्वारा गठित किए जाते हैं, और एक दाता / स्वीकर्ता फ्रेट जोड़ी और फॉस्फोराइलेटेड अवशेषों को पहचानने वाले एक बाध्यकारी डोमेन के भीतर डाला जाता है, जो एक कुशल FRET प्रक्रिया 12 के लिए बायोसेंसर की तह में मदद करता है। AURKA के मामले में, फॉस्फोराइलेशन द्वारा लक्षित KIF2C का एक 14-aminoacid टुकड़ा CFP-YFP दाता / स्वीकर्ता pair13 के बीच डाला गया था। हालांकि, इस सेंसर में कुछ बड़ी कमियां हैं। सबसे पहले, इस जांच में उपयोग किए जाने वाले KIF2C अनुक्रम को AURKA और निकट-संबंधित किनेज AURKB दोनों द्वारा लक्षित किया जा सकता है, जिससे इस बायोसेंसर की विशिष्टता कम हो जाती है। दूसरा, सेंसर फॉस्फोराइलेशन के लिए अंतर्जात किनेज पर निर्भर करता है। इसलिए, FRET दक्षता undetectable या महत्वपूर्ण नहीं हो सकता है यदि किनेज की मात्रा सीमित कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, उपकोशिकीय डिब्बों या सेल चक्र चरणों में)। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, AURKA सेंसर का एक नया वर्ग बनाया गया था जिसे "संरचनात्मक सेंसर" के रूप में जाना जाता था। इन जांचों में, AURKA की पूर्ण लंबाई अनुक्रम को एन-टर्मिनस पर एक दाता फ्लोरोफोर के भीतर डाला गया था, और सी-टर्मिनस पर एक स्वीकर्ता फ्लोरोफोर। निष्क्रिय AURKA एक "खुली" संरचना प्रस्तुत करता है, जो काइनेज के एन- और सी-टर्मिनी को एक-दूसरे से दूर लाता है। दो टर्मिनी (> 10 एनएम) के बीच इतनी दूरी के साथ, दाता / स्वीकर्ता जोड़ी FRET के लिए एक गैर-अनुमोदित कॉन्फ़िगरेशन में हैं। इसके विपरीत, ऑटोफॉस्फोराइलेटेड AURKA एक "बंद" संरचना को अपनाता है, जिसमें दो प्रोटीन टर्मिनी और निकटता में दो फ्लोरोफोर होते हैं। यह दाता और स्वीकर्ता के बीच FRET की अनुमति देने के लिए दिखाया गया था, जिसे दाता जीवनकाल 14,15 में भिन्नताओं का उपयोग करके मापा जा सकता है। इस तरह की जांच कई फायदे पेश करती है। सबसे पहले, वे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड हैं, और उनका उपयोग सेल में अंतर्जात किनेज को बदलने के लिए किया जा सकता है। दूसरा, वे AURKA के नॉकडाउन से प्रेरित फेनोटाइप्स को बचाते हैं, यह दर्शाता है कि वे सेल में कार्यात्मक हैं। तीसरा, वे विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में और पूरे सेल चक्र में किनेज के सक्रियण का पालन करने की अनुमति देते हैं। जांच ने उन स्थानों पर AURKA के सक्रियण का पता लगाया जहां किनेज को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है (यानी सेंट्रोसोम और माइटोटिक स्पिंडल), और माइटोकॉन्ड्रिया 16 में AURKA के सक्रियण की खोज में भी भाग लिया। अंत में, इन सेंसरों ने FRET / FLIM के आधार पर उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग की अनुमति दी, जहां AURKA के संरचनात्मक परिवर्तनों का उपयोग उपन्यास औषधीय अवरोधकों की पहचान करने के लिए किया गया था17।

वर्तमान कार्य में, हम सुसंस्कृत कोशिकाओं में AURKA सक्रियण की कल्पना करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, हम FRET के लिए संभावित fluorophore जोड़े पर एक अंतर्दृष्टि बना देंगे। सबसे उपयुक्त दाता / स्वीकर्ता जोड़ी का विकल्प उपलब्ध माइक्रोस्कोप सेटअप, या मल्टीप्लेक्स FRET18,19 के रूप में एक विशेष डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के अनुसार किया जाएगा। फिर, हम एक तेजी से FRET / FLIM माइक्रोस्कोप सेटअप में चुने गए बायोसेंसर (ओं) के व्यवहार का पता लगाने के लिए एक पाइपलाइन का प्रस्ताव करते हैं। यह पाइपलाइन सेल संस्कृति और सिंक्रनाइज़ेशन प्रक्रियाओं से FLIM अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण तक विस्तारित होगी। अंत में, हम इस प्रोटोकॉल के संभावित फायदों पर चर्चा करेंगे, क्योंकि बायोसेंसर डिजाइन के लिए एक अनुरूप रणनीति को अन्य किनेसेस पर लागू किया जा सकता है, और इसका उपयोग अन्य फ्रेट-आधारित इमेजिंग सिस्टम के साथ भी किया जा सकता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले U2OS कक्षों को अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC, HTB-96) से खरीदा गया था, और उन्हें माइकोप्लाज्मा से मुक्त परीक्षण किया गया था। चरण 2.1 से 2.7 को कोशिकाओं और अभिकर्मकों को बाँझ रखने के लिए एक लैमिनर प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए।

1. दाता / स्वीकर्ता FRET जोड़ी का चयन

  1. सबसे उपयुक्त दाता / स्वीकर्ता FRET जोड़े की पसंद के लिए साहित्य का संदर्भ लें। उपयोगी उदाहरण20,21,22,23,24 में पाए जा सकते हैं, हालांकि अंतिम विकल्प FRET / FLIM सेटअप (उपलब्ध लेजर लाइनों, फिल्टर, आदि) की विशेषताओं के अनुसार किया जाना चाहिए। निम्नलिखित एक दाता / स्वीकर्ता जोड़ी का चयन करने के तरीके पर कुछ विचार हैं।
    1. दाता का चयन करना: उपलब्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर जानकारी के एक पूर्ण सेट के लिए एफपी बेस (https://www.fpbase.org/) को देखें। यह डेटाबेस लगातार सभी नए विकसित fluorophores के साथ अद्यतन किया जाता है।
    2. साहित्य में पहले से ही उपलब्ध बायोसेंसर के बारे में अधिक जानकारी के लिए फ्लोरोसेंट बायोसेंसर डेटाबेस (https://biosensordb.ucsd.edu/index.php) को देखें, साथ ही साथ उपयोग किए जाने वाले संबंधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ।
    3. एक सामान्य प्रारंभिक बिंदु के रूप में, एक उज्ज्वल दाता फ्लोरोफोर चुनें। अच्छे उम्मीदवार एमटीएफपी 1 या ईसीएफपी के रूप में सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं, या ईजीएफपी या एमजीएफपी के रूप में जीएफपी वेरिएंट हैं।
    4. Oligomers प्रोटीन स्थानीयकरण और / या function25 को प्रभावित कर सकते हैं। MTurquoise226, या Aquamarine27,28 के रूप में CFP के मोनोमेरिक म्यूटेंट का उपयोग करने पर विचार करें। इन रूपों में अच्छी क्वांटम उपज और विलुप्त होने के गुणांक भी होते हैं, जो उन्हें FRET दाताओं के रूप में अच्छे उम्मीदवार बनाते हैं।
    5. फ्लोरोसेंट प्रोटीन (दाता या स्वीकर्ता दोनों के रूप में) को इंट्रासेल्युलर पीएच 23 जैसे पर्यावरणीय परिवर्तनों के प्रति असंवेदनशील, या फोटोब्लीचिंग 25 को प्राथमिकता दें, क्योंकि फ्रेट दक्षता इन मापदंडों से भारी रूप से प्रभावित हो सकती है29। आजकल, mTurquoise2 या mTFP1 जैसे fluorophores को बड़े पैमाने पर दाताओं के रूप में उपयोग किया जाता है, उनके अच्छे फोटोस्टेबिलिटी 22,25,26 के लिए धन्यवाद।
  2. स्वीकर्ता का चयन करना: सियान दाताओं को अक्सर पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) वेरिएंट के साथ जोड़ा जाता है, जैसे कि एमवेनस, सिट्रिन, और वाईपेट 20,21,22,30। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन प्रोटीनों में पीएच के लिए बहुत अधिक संवेदनशीलता है, और विश्व स्तर पर एक खराब फोटोस्टेबिलिटी प्रदर्शित करता है।
    1. PH-Lemon31 के रूप में YFP के नव-विकसित, pH-असंवेदनशील पीले रंग के संस्करणों का उपयोग करने पर विचार करें, mNeonGreen23 के रूप में हरे रंग के fluorophores या mScarlet-I23,32 के रूप में लाल fluorophores mTurquoise2 के लिए पहले से मान्य फ्लोरोसेंट स्वीकर्ता के रूप में।
    2. वैकल्पिक रूप से, ShadowG33 या ShadowY34 के रूप में YFP के गैर-फ्लोरोसेंट / अंधेरे डेरिवेटिव का उपयोग करने पर विचार करें, जिन्हें FRET / FLIM प्रयोगों में सियान-फ्लोरोसेंट दाताओं के लिए अच्छे स्वीकर्ता के रूप में व्यवहार करने के लिए दिखाया गया था।
    3. यदि एक दाता के रूप में mEGFP का उपयोग कर रहे हैं, तो mCherry के रूप में मोनोमेरिक लाल स्वीकर्ता का उपयोग करने पर विचार करें।
  3. FP बेस वेबसाइट पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके चुने गए दाता/स्वीकर्ता जोड़ी के वर्णक्रमीय गुणों को सत्यापित करें. mEGFP/mCherry युग्म के एक उदाहरण के लिए चित्र 1 देखें.
    1. FP बेस वेबसाइट पर, उपकरण ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करें और स्पेक्ट्रा व्यूअर का चयन करें।
    2. ड्रॉप-डाउन मेनू में, विज़ुअलाइज़ करने के लिए फ्लोरोफोर जोड़ी का नाम दर्ज करें (उदाहरण के लिए, mEGFP और mCherry)।
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू में किसी दिए गए लेजर का चयन करके एक विशिष्ट प्रकाश स्रोत के साथ दाता / स्वीकर्ता जोड़ी के गुणों का अनुकरण करें। वैकल्पिक रूप से, जोड़ें लेजर का चयन करके एक विशिष्ट लेजर तरंग दैर्ध्य दर्ज करें। वांछित तरंग दैर्ध्य के लिए fluorophore स्पेक्ट्रा को समायोजित करने के लिए इस विकल्प के लिए उत्सर्जन Normalize पर क्लिक करें। यहां, जीएफपी को उत्तेजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य 480 ± 10 एनएम पर है।
  4. AURKA के पूर्ण लंबाई अनुक्रम के एन-टर्मिनस पर एक fluorophore जोड़कर चयनित दाता / स्वीकर्ता जोड़ी को क्लोन करें, और सी-टर्मिनस पर एक। पसंद के स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में इस निर्माण को सम्मिलित करने के लिए पसंदीदा क्लोनिंग विधि के दिशानिर्देशों का पालन करें।

2. सेल संस्कृति, अभिकर्मक और सिंक्रनाइज़ेशन

  1. दिन 1. U2OS कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करें: Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) का उपयोग करें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% एल-ग्लूटामाइन (यहां से, पूर्ण विकास मीडिया) के साथ पूरक। वैकल्पिक रूप से, पूर्व-पूरक एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. यदि कोशिकाएं जमे हुए हैं, तो प्रयोगों से कम से कम 8 दिन पहले एक शीशी को पिघलाएं (यानी, बिंदु 2.5 से)।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर स्तनधारी सेल संस्कृतियों के लिए समर्पित एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को विकसित करें और 5% CO2 के साथ। संदूषण से बचने के लिए इनक्यूबेटर को नियमित रूप से साफ और निष्फल करें।
  4. जब कोशिकाएं ~ 80% संगम तक पहुंचती हैं:
    1. उन्हें संक्षेप में बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) Ca2 + और Mg2 + के बिना के साथ धोलें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार और 1-3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखकर बाँझ 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ ट्रिप्सिनाइज़ कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें।
    3. पूर्ण विकास मीडिया की मात्रा को दोगुना जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें; अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. 3-5 मिनट के लिए 800 x g पर सेल निलंबन centrifuge.
    5. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और उनके लिए उचित कमजोर पड़ने की गणना करें जो दिन के बाद कक्ष स्लाइड में ~ 70-80% confluency पर होना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, लाइव सेल इमेजिंग के लिए इसी तरह के समर्थन का भी उपयोग किया जा सकता है।
    6. चुने गए लाइव सेल इमेजिंग समर्थन में कोशिकाओं की इसी मात्रा को पाइप करें, और अगले दिन तक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को वापस रखें।
  5. दिन 2. अभिकर्मक के साथ आगे बढ़ें। एक इष्टतम अभिकर्मक दक्षता (~ 50/80%) प्राप्त करने के लिए पसंदीदा क्षणिक अभिकर्मक विधि (ओं) के दिशानिर्देशों का पालन करें। कोई विशिष्ट अभिकर्मक विधि की आवश्यकता नहीं है। ध्यान दें कि अभिकर्मक दक्षता उपयोग की गई सेल लाइन के अनुसार भिन्न हो सकती है। 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: क्षणिक अभिकर्मकों की आवश्यकता को बायपास करने के लिए तीन वैक्टरों में से प्रत्येक वाले स्थिर क्लोन का उत्पादन करें। इस स्तर पर, दो प्रकार के नियंत्रणों की योजना बनाई जानी चाहिए। सबसे पहले, यह सत्यापित करने के लिए एक "दाता-केवल" नियंत्रण की आवश्यकता होती है कि पूर्ण-लंबाई AURKA की उपस्थिति mTurquoise2 प्रति se के जीवनकाल को परेशान नहीं करती है। दूसरा, एक काइनेज-मृत उत्परिवर्तन को ले जाने वाले बायोसेंसर का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाना चाहिए जहां FRET को समाप्त कर दिया जाता है या काफी कम किया जाता है। वैकल्पिक रूप से एक काइनेज-मृत उत्परिवर्ती के लिए, एटीपी एनालॉग MLN8237 के रूप में AURKA सक्रियण का एक रासायनिक अवरोधक एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. आगे तीन अभिकर्मक स्थितियों की योजना बनाएं, उनमें से प्रत्येक एक स्वतंत्र कुएं में:
      "दाता-केवल" वेक्टर (उदाहरण के लिए, AURKA-mTurquoise2)
      "बायोसेंसर" (उदाहरण के लिए, superYFP-AURKA-mTurquoise2)
      एक काइनेज-डेड / "K162M" बायोसेंसर (उदाहरण के लिए, superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2) या वैकल्पिक रूप से, AURKA सक्रियण का एक अवरोधक (उदाहरण के लिए, MLN8237)
    2. तुलना करने के लिए प्रत्येक स्वतंत्र दाता / स्वीकर्ता जोड़ी के लिए तीन शर्तों को पूरा करें।
    3. यदि असिंक्रनाइज़्ड और G2/M-सिंक्रनाइज़ की गई कोशिकाओं की तुलना की जाती है तो ट्रांसफेक्टेड कुओं की संख्या को दोगुना करने पर विचार करें (चरण 2.6 देखें)।
  6. दिन 3. G2/M में कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करें डीएमएसओ में भंग 100 ng/mL nocodazole जोड़ें प्रत्येक transfected अच्छी तरह से प्रकाश जोखिम से बचने और 16 ज (अधिमानतः रात भर) के लिए इनक्यूबेट करें। यदि असिंक्रोनाइज्ड और जी 2 / एम-सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं की तुलना करते हैं, तो प्रत्येक अभिकर्मक स्थिति को नोकोडाज़ोल के साथ या डीएमएसओ की समान मात्रा के साथ व्यवहार करें। एक बेहतर सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता के लिए, DMSO में nocodazole के एकल-उपयोग एलीकोट तैयार करें, उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग के बाद उन्हें छोड़ दें।
    नोट:: कक्ष सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता कक्ष पंक्तियों के बीच भिन्न हो सकते हैं। Nocodazole की इष्टतम एकाग्रता और इसके इनक्यूबेशन समय प्रयोगात्मक रूप से FRET / FLIM प्रयोगों से पहले प्रवाह cytometry दृष्टिकोण द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। सांख्यिकीय रूप से प्रासंगिक FRET/FLIM विश्लेषण के लिए, हम समग्र सेल आबादी के कम से कम 50% की G2/M में सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता की अनुशंसा करते हैं।
  7. दिन 4. माइटोटिक कोशिकाओं पर Nocodazole washout और FRET / FLIM इमेजिंग
    1. एक पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम को निकालें और इसे पूर्व-गर्म, बाँझ पीबीएस के साथ बदलें। यदि संभव हो तो प्रकाश जोखिम से बचें। धीरे से प्लेट रॉक.
    2. धोने की प्रक्रिया को दोहराएं, हमेशा प्रकाश जोखिम से बचें।
    3. दूसरे पीबीएस धोने को हटा दें और इसे पूर्व-गर्म, बाँझ लीबोविट्ज़ एल -15 माध्यम के साथ बदलें, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (यहां से, इमेजिंग मीडिया) के साथ पूरक।
      नोट: इमेजिंग मीडिया को पीएच संकेतकों (जैसे, फिनोल लाल) और मध्यम घटकों को राइबोफ्लेविन के रूप में बिना खरीदा जाना चाहिए। ये पदार्थ ऑटोफ्लोरेसेंस का एक स्रोत हैं जो जीवन भर के मूल्यों को परेशान कर सकते हैं।
    4. FRET/FLIM इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें। तापमान में तेजी से परिवर्तन को कम करें और जितनी जल्दी हो सके इमेजिंग चरण (चरण 3) पर आगे बढ़ें। माइक्रोस्कोप सेटअप में ले जाने के दौरान नमूने को प्रकाश से बचाने पर विचार करें (यानी, इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर या इसे एक बॉक्स में रखकर)।

3. FRET / FLIM अधिग्रहण

नोट:: इस प्रोटोकॉल में FRET/FLIM अधिग्रहण एक कस्टम-निर्मित सेटअप पर किया गया था, in35 में वर्णित है और in15,17 (चित्रा 2) के रूप में एक नियंत्रण समाधान से सुसज्जित है। सेटअप अब Inscoper द्वारा व्यावसायीकरण किया गया है और यह स्पंदित उत्तेजना के लिए एक सफेद लेजर के साथ एक कताई-डिस्क माइक्रोस्कोप से बना है, और कैमरे के सामने एक उच्च दर समय-गेटेड तीव्रता। 10 एनएस की समय खिड़की में 2 एनएस के अस्थायी द्वारों का उपयोग पांच समय-गेटेड छवियों के ढेर को प्राप्त करने के लिए क्रमिक रूप से किया जाता है। इन छवियों का उपयोग तब निम्नलिखित समीकरण के अनुसार पिक्सेल-दर-पिक्सेल माध्य प्रतिदीप्ति जीवनकाल की गणना करने के लिए किया जाता है: π = ΠΠti • Πi/ΠΙi, जहां Πti ith गेट के विलंब समय से मेल खाती है, जबकि मैं पिक्सेल-दर-पिक्सेल समय-गेटेड तीव्रता छवि 35,36 को इंगित करता हूं . यह विधि तेजी से FLIM माप सुनिश्चित करती है: कोई फिटिंग या बिनिंग चरणों की आवश्यकता नहीं है, और जीवनकाल की गणना न्यूनतम फोटॉन बजट के साथ ऑनलाइन मोड में की जा सकती है। सिस्टम एक उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस भी प्रस्तुत करता है। हालांकि, एक ही प्रयोग FLIM माप के लिए सुसज्जित किसी भी अन्य वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप सेटअप के तहत किया जा सकता है।

  1. माइटोसिस में जी 2 / एम ब्लॉक से कोशिकाओं की इष्टतम रिहाई सुनिश्चित करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग करें। यदि संभव हो, तो थर्मोस्टैटिक चैंबर से सुसज्जित माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ FRET / FLIM प्रयोग करें।
  2. प्रयोग से पहले कम से कम 30 मिनट से 1 घंटे तक माइक्रोस्कोप के थर्मोस्टैटिक चैंबर को चालू करें।
  3. लेजर, कैमरा, माइक्रोस्कोप सेटअप और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर (चित्रा 2) पर स्विच करें।
  4. दाता fluorophore के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन करें। सुविधाजनक तरंग दैर्ध्य विकल्प हैं: mTurquoise2 (चित्रा 3A) के लिए 440/10 nm और πem 483/35 nm; जीएफपी के लिए 488/10 एनएम और πem 525/50 एनएम) (चित्रा 3 बी)।
  5. एक्सपोज़र समय सेट करें, आमतौर पर 30 और 100 एमएस (चित्रा 3) के बीच। सावधान रहें कि अत्यधिक लेजर शक्ति के परिणामस्वरूप फोटोब्लीचिंग के रूप में प्रेरित फोटोटॉक्सिक प्रभाव हो सकते हैं, जो बदले में प्रतिदीप्ति जीवनकाल को संशोधित कर सकते हैं37। सेटअप पर, समय-अंतराल अधिग्रहण के दौरान पहले गेट की प्रतिदीप्ति तीव्रता की निगरानी करके फोटोब्लीचिंग घटनाओं की अनुपस्थिति को मान्य करें। यदि प्रतिदीप्ति तीव्रता में भिन्नताएं अवलोकन योग्य हैं, तो अधिग्रहण को छोड़ दें और लेजर शक्ति को समायोजित करें।
    नोट:: यहाँ सेटअप में, पहले गेट में कम से कम 3000 ग्रे स्तर की अनुमति देने वाले एक्सपोज़र समय का चयन करें; अन्यथा सॉफ़्टवेयर दाता जीवनकाल की गणना नहीं करेगा। यह ग्रे स्तर मान प्रासंगिक जीवनकाल मूल्यों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम फोटॉन बजट से मेल खाता है।
  6. FRET / FLIM अधिग्रहण शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं ने द्विध्रुवी स्पिंडल की उपस्थिति तक प्रतीक्षा करके माइटोसिस में प्रवेश किया है (U2OS कोशिकाओं में ~ 20/30 मिनट)। चूंकि माइटोटिक AURKA मुख्य रूप से इस संरचना में स्थानीयकृत होता है, इसलिए एक बाहरी प्रकाश स्रोत (चित्रा 1) के साथ सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं में स्पिंडल के गठन की स्क्रीनिंग करके माइटोटिक प्रगति को सत्यापित करें। ध्यान दें कि माइटोटिक प्रगति के लिए आवश्यक समय उपयोग की गई सेल लाइन के अनुसार भिन्न हो सकता है।
  7. यदि MLN8237 के साथ उपचार की योजना बनाई गई है, तो कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और उन्हें मेटाफेज तक पहुंचने की अनुमति दें (नोकोडाज़ोल वॉशआउट के लगभग 20 मिनट बाद)। डीएमएसओ में भंग किए गए 250 एनएम एमएलएन8237 जोड़ें, दोनों दाता-केवल निर्माण को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं और बायोसेंसर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए।
    1. ऊपर के रूप में transfected कोशिकाओं पर इस स्थिति को नियंत्रित करें और DMSO की एक समान मात्रा के साथ incubate। एक बेहतर AURKA निषेध के लिए, DMSO में MLN8237 के एकल-उपयोग एलीकोट तैयार करें, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उन्हें बर्फ पर एलीकोट रखकर पिघलाएं, और उपयोग के बाद उन्हें छोड़ दें।
    2. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस अवधि के बाद, माइटोटिक स्पिंडल सिकुड़ जाएगा और केवल एक एकल, तीव्र बिंदु बचा है। एक समान फेनोटाइप तब देखा जाता है जब K162M उत्परिवर्ती का उपयोग किया जाता है।
  8. माइटोटिक स्पिंडल के बेहतर रिज़ॉल्यूशन के लिए, कम से कम 63x उद्देश्य (चित्रा 3) का उपयोग करें।
  9. एक बार मेटाफ़ेज़ में एक सेल पाया गया (मेटाफ़ेज़ में एक सेल के उदाहरण के रूप में चित्रा 4 देखें), इसे दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में रखने के लिए xyz निर्देशांक को समायोजित करें।
  10. तेजी से छवियों के लिए, एक एकल जेड विमान का चयन करें। उस विमान को चुनें जहां माइटोटिक स्पिंडल अधिक दिखाई देता है या तीव्र होता है।
  11. रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें. अधिग्रहण का समय उपयोग किए गए FLIM सेटअप के अनुसार भिन्न हो सकता है (कुछ सेकंड से मिनट तक)। बाजार पर उपलब्ध वाणिज्यिक सेटअप के बहुमत प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ और पिक्सेल-दर-पिक्सेल जीवनकाल मानचित्र दोनों को विस्तृत करेंगे। दोनों छवियों को सहेजें।
  12. प्रत्येक अभिकर्मक और / या उपचार की स्थिति से कम से कम 10 स्वतंत्र छवियों को प्राप्त करें।

4. ΠLifetime की गणना और दाता / स्वीकर्ता जोड़े के बीच FLIM मूल्यों की तुलना

  1. पूरे पिक्सेल-दर-पिक्सेल जीवनकाल मानचित्र (यानी, पूरे माइटोटिक स्पिंडल) से आजीवन मान निकालें, या विशिष्ट उप-क्षेत्रों के अनुरूप ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें।
    नोट:: FRET/FLIM सेटअप के अनुसार उपयोग किया जाता है, जीवनकाल परिकलन सीधे अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पर किया जा सकता है, या जेनेरिक छवि प्रसंस्करण समाधान (जैसे, फिजी / ImageJ: https://fiji.sc/) के साथ निकाला जा सकता है। सीधे जीवनभर के मूल्यों की गणना करने वाले सॉफ़्टवेयर ( जिसे ऑनलाइन मोड के रूप में भी जाना जाता है) एक अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल समाधान प्रदान करता है, जो शुरुआती लोगों के लिए और माइक्रोस्कोपी उपयोगकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो FRET / FLIM से पूरी तरह से परिचित नहीं हैं। इसके विपरीत, अधिग्रहण के बाद आजीवन मूल्यों के निष्कर्षण के लिए अक्सर एक फिटिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। यह विकल्प शुरुआती लोगों के लिए कम सुलभ है, क्योंकि फिटिंग के गणितीय मॉडल पर कुछ पिछला ज्ञान आवश्यक है।
  2. एक बार कल्पना या निकाले जाने के बाद, "दाता-केवल" वेक्टर (जैसे, AURKA-mTurquoise2) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के औसत जीवनकाल की गणना करें, इसके द्वारा दाता जीवनकाल का मतलब है।
  3. औसत दाता जीवनकाल से चरण 4.1 में परिकलित प्रत्येक स्वतंत्र जीवनकाल मान को घटाएं। विश्लेषण की गई सभी स्थितियों में सभी कक्षों के लिए इस चरण को दोहराने से प्रत्येक स्थिति के लिए ΠLifetime मिलेगा।
  4. "दाता-केवल", "बायोसेंसर" और "K162M", या DMSO और MLN8237 शर्तों के लिए ΠLifetime मानों की तुलना करें।
    नोट:: "दाता-केवल" स्थिति के लिए, ΠLifetime शून्य के करीब मान और आजीवन मानों के प्रयोगात्मक उतार-चढ़ाव के अनुरूप मानों में परिणाम होना चाहिए। "बायोसेंसर" स्थिति के लिए, ΠLifetime मानों को दो निर्माणों के बीच शुद्ध अंतर उत्पन्न करना चाहिए (एक सचित्र उदाहरण के लिए चित्र4 देखें)।
  5. विभिन्न दाता/स्वीकर्ता जोड़े के बीच ΠLifetime मानों की तुलना करें।
    1. "बायोसेंसर" शर्तों की तुलना करें: क्या वे इसी तरह के ΠLifetime दिखाते हैं?
    2. क्या "K162M" या MLN8237 शर्तें उनके बीच समान ΠLifetime दिखाती हैं? क्या उनका ΠLifetime "दाता-केवल" स्थिति के समान है?

Representative Results

हमने विभिन्न वर्णक्रमीय गुणों के साथ दो बायोसेंसर का उपयोग करके Thr288 पर AURKA के ऑटोफॉस्फोराइलेशन को रिकॉर्ड करने के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया का पालन किया। हमने प्रारंभिक GFP-AURKa-mCherry probe14 की तुलना विभिन्न वर्णक्रमीय गुणों के साथ दो बायोसेंसर के साथ की। ये दो जांच फ्लोरोसेंट दाता mTurquoise2 पर और एक मामले में एक गैर-फ्लोरोसेंट स्वीकर्ता (ShadowG) पर, या एक दूसरे मामले में एक पीले स्वीकर्ता (superYFP) पर भरोसा करते हैं। फिर हमने प्रत्येक दाता / स्वीकर्ता जोड़ी के भीतर AURKA के पूर्ण-लंबाई अनुक्रम को डाला। AURKA सक्रियण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण रखने के लिए, दो रणनीतियों का पीछा किया जा सकता है। सबसे पहले, एक छोटे एटीपी-एनालॉग (MLN8237) का उपयोग काइनेज के गतिज जेब में एटीपी के बंधन के साथ हस्तक्षेप करता है और इसके सक्रियण को रोकता है38। दूसरा, मेट (K162M) में Lys162 का उत्परिवर्तन, प्रत्येक बायोसेंसर का एक किनेज-मृत संस्करण बनाता है जो 14,15,39 को सक्रिय करने में असमर्थ है। यह उत्परिवर्तन आमतौर पर Lys162 और Glu181 के बीच स्थापित एक नमक पुल के विघटन को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप किनेज की गतिज जेब का एक स्थिर उद्घाटन होता है और इसकी समग्र निष्क्रियता 40 को ट्रिगर करता है। FRET के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने एक स्वीकर्ता-रहित निर्माण (GFP-AURKA या AURKA-mTurquoise2) का उपयोग किया।

जी 2 / एम में कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने और उन्हें माइटोसिस में जारी करने के बाद, हमने माइटोटिक स्पिंडल (चित्रा 4) पर सभी ट्रांसफेक्टेड निर्माणों के जीवनकाल को मापा। ध्यान दें, इस संरचना को एक पूरे के रूप में माना जाता था, और स्पिंडल के भीतर कोई आरओआई का विश्लेषण नहीं किया गया था। फिर हमने सभी शर्तों के लिए ΠLifetime की गणना की। जैसा कि अपेक्षित था, GFP-AURKA या AURKA-mTurquoise2 ("दाता-केवल" स्थितियों) का जीवनकाल 0 के करीब था, यह दर्शाता है कि इन निर्माणों के लिए मापा गया मान औसत मान (चित्रा 4A, 4B) के आसपास उतार-चढ़ाव करता है। इसके विपरीत, GFP-AURKA-mCherry के लिए ΠLifetime मान सांख्यिकीय रूप से दाता-केवल स्थिति से अलग थे, जिसमें ~ 130 ps (चित्रा 4A) की वृद्धि हुई। इसी तरह के अवलोकन shadowG-AURKA-mTurquoise2 के लिए और superYFP-AURKA-mTurquoise2 के लिए किए गए थे, जिसमें क्रमशः दाता-केवल स्थिति से ~ 150 और ~ 220 पीएस की वृद्धि हुई थी (चित्रा 4B, 4C)। इन डेटा को आसानी से एक छद्म रंग लुकअप टेबल (LUT) के साथ एकल कोशिकाओं में विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। इस मामले में, 0 के आसपास ΠLifetime के मान छद्म रंग के पीले रंग के होते हैं, जबकि अधिक महत्वपूर्ण अंतर छद्म रंग के लाल / बैंगनी होते हैं। दरअसल, पिक्सेल-दर-पिक्सेल एलयूटी दाता-केवल निर्माणों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में पीले रंग के करीब था, जबकि यह या तो बायोसेंसर (चित्रा 4 ए, 4 बी) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में लाल / बैंगनी स्पेक्ट्रम में अधिक था। यह तब भी देखा गया जब GFP-AURKA-mCherry बायोसेंसर को औषधीय अवरोधक MLN8237 के साथ इलाज किया गया था।

फिर हमने किनेज-मृत बायोसेंसर के ΠLifetime का विश्लेषण किया। इन निर्माणों ने मध्यवर्ती ΠLifetime मानों को दिखाया: दाता-केवल स्थिति (चित्रा 4B, 4C) की तुलना में ΠLifetime काफी अधिक था, लेकिन यह उनके सामान्य समकक्षों (चित्रा 4B, 4D) की तुलना में भी काफी कम था। MLN8237 के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के साथ तुलना या किनेज-मृत बायोसेंसर को व्यक्त करने के लिए यह अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है कि प्रत्येक दाता / स्वीकर्ता जोड़ी के लिए ΠLifetime भिन्नताएं पूरी तरह से AURKA के सक्रियण से जुड़ी हुई हैं या नहीं। GFP-AURKA-mCherry के मामले में, जब AURKA-विशिष्ट अवरोधक का उपयोग किया जाता है, तो ΠLifetime विविधताओं को समाप्त कर दिया जाता है। इसके विपरीत, ΠLifetime विविधताएं ज्यादातर हैं, लेकिन विशेष रूप से ShadowG-AURKA-mTurquoise2 और superYFP-AURKA-mTurquoise2 के मामले में AURKA सक्रियण से जुड़ी नहीं हैं।

Figure 1
चित्रा 1: जीएफपी (दाता) और mCherry (स्वीकर्ता) उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा।
स्पेक्ट्रा प्राप्त किया गया था और एफपी बेस वेबसाइट (https://www.fpbase.org/) से अनुकूलित किया गया था, और 480 एनएम-लेजर उत्तेजना के लिए समायोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक कार्यस्थान की छवि.
(1) नियंत्रण समाधान; (2) सफेद लेजर स्रोत; (3) सीसीडी कैमरा; (4) माइक्रोस्कोप सेटअप; (5) नमूने की ओकुलर स्क्रीनिंग के लिए बाहरी प्रकाश स्रोत / दीपक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: FLIM अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर की प्रतिनिधि छवियों.
(A, B) (1) दाता के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन पैरामीटर ( ए में सीएफपी, या बी में जीएफपी); (2) एक्सपोजर समय; (3) उद्देश्य का चयन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: AURKA FRET biosensors और उनके नकारात्मक नियंत्रण के प्रतिनिधि छवियों.
(ए) (माइक्रोग्राफ) प्रतिदीप्ति (ग्रीन चैनल) और इसी पिक्सेल-दर-पिक्सेल ΠLifetime (दाता केवल - जीवनी संवेदक) U2OS कोशिकाओं GFP-AURKA या GFP-AURKA-mCherry को व्यक्त करते हुए, G2/M पर सिंक्रनाइज़, जब तक द्विध्रुवी स्पिंडल दिखाई नहीं देता है और फिर DMSO के साथ या MLN8237 के साथ इलाज किया जाता है। एक स्यूडोकलर पैमाने ("फायर" लुकअप टेबल) के साथ ΠLifetime को चित्रित किया गया है। (ग्राफ़) इसी परिमाणीकरण और संकेतित शर्तों के लिए दो तरह से एनोवा विश्लेषण. (बी) (माइक्रोग्राफ) प्रतिदीप्ति (सियान चैनल) और इसी पिक्सेल-दर-पिक्सेल ΠLifetime (केवल दाता - जीवनीकर्ता) U2OS कोशिकाओं के shadowG-AURKA-mTurquoise2 (ऊपरी पैनल) या superYFP-AURKA-mTurquoise2 (निचले पैनल) को व्यक्त करते हैं, G2 / M पर सिंक्रनाइज़ किया गया है और जब तक द्विध्रुवी स्पिंडल दिखाई नहीं देता है तब तक जारी किया जाता है। एक स्यूडोकलर पैमाने ("फायर" लुकअप टेबल) के साथ ΠLifetime को चित्रित किया गया है। (ग्राफ़) उपरोक्त माइक्रोग्राफ में प्रतिनिधित्व की गई स्थितियों के अनुरूप परिमाणीकरण और एक तरफा एनोवा विश्लेषण। (सी) (माइक्रोग्राफ) AURKA-mTurquoise2 (ऊपरी पैनल), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (मध्य पैनल) और superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2 की छवियां अधिग्रहित और माइक्रोग्राफ में के रूप में प्रतिनिधित्व किया। (ग्राफ़) संकेतित अभिकर्मक स्थितियों के लिए दो-तरफ़ा एनोवा विश्लेषण। Boxplots में पट्टी माध्यिका का प्रतिनिधित्व करता है; व्हिस्कर न्यूनतम से अधिकतम तक विस्तारित होते हैं। एन = एक प्रतिनिधि प्रयोग (तीन में से) की प्रति शर्त 10 कोशिकाएं। अलग-अलग मूल्यों को डॉट्स के रूप में दर्शाया जाता है। स्केल बार: 10 μm. * P < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001 (A) में प्रत्येक इंगित स्थिति के खिलाफ (A) "AURKA-mTurquoise2" स्थिति (B) में, और (C) में प्रत्येक संकेतित स्थिति के खिलाफ। एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड FRET बायोसेंसर एकल प्रोटीन या पूरे सिग्नलिंग pathways41 के सक्रियण को मापने के लिए विश्वसनीय उपकरण हैं। विशेष रूप से, AURKA FRET बायोसेंसर समय और स्थान में किनेज के सक्रियण का पता लगाने के लिए एक अधिमान्य तरीका है। हालांकि, कुछ तत्वों को विशेष ध्यान देने योग्य है जब एक FRET बायोसेंसर को डिजाइन या अनुकूलित किया जाता है, न केवल सामान्य शब्दों में बल्कि विशेष रूप से AURKA के लिए।

सबसे पहले, दाता / स्वीकर्ता FRET जोड़ी की प्रकृति और सापेक्ष स्थिति को इस किनेज के विशिष्ट कार्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। AURKA माइटोसिस के दौरान माइटोटिक स्पिंडल पर बहुत समृद्ध होता है, लेकिन यह पूरे सेल चक्र में और विभिन्न उपकोशिकीय स्थानों (जैसे, सेंट्रोसोम, नाभिक और माइटोकॉन्ड्रिया) पर मौजूद होता है। यदि बायोसेंसर का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया जैसे विशिष्ट डिब्बों में किया जाना है, जो अम्लीय पीएच तक पहुंच सकता है, तो mTurquoise2 / shadowG के रूप में पीएच-असंवेदनशील दाता-स्वीकर्ता FRET जोड़ी का विकल्प बनाया जाना चाहिए। इसके अलावा, सी-टर्मिनस पर FRET दाता को रखने से इस उपकोशिकीय डिब्बे में बायोसेंसर के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिल सकती है, और संभावित रूप से FRET का पता लगाने का भी अनुकूलन किया जा सकता है, यह देखते हुए कि AURKA N-टर्मिनस को माइटोकॉन्ड्रिया 16,42 पर आंशिक रूप से बंद करने के लिए दिखाया गया था।

दूसरा, AURKA FRET बायोसेंसर को अनुकूलित करने का एक अभी तक अज्ञात तरीका पूर्ण लंबाई AURKA और दाता / स्वीकर्ता जोड़ी के बीच linkers के अधिक सावधान डिजाइन की आवश्यकता होगी। न केवल फ्लोरोसेंट जोड़ी के बीच की दूरी, बल्कि लिंकर के गुणों को भी FRET दक्षता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों के रूप में दिखाया गया था43,44,45,46। इस प्रकाश में, कठोरता या लिंकर के लचीलेपन को बढ़ाना या तो FRET दक्षता के लिए हानिकारक हो सकता है, या इसे और बेहतर बना सकता है।

तीसरा, यह ज्ञात है कि AURKA का overexpression कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण अनुपात में माइटोटिक स्पिंडल असामान्यताओं को प्रेरित करता है2। साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) जैसे एक मजबूत प्रमोटर के तहत एक ही FRET निर्माण को व्यक्त करके प्राप्त की गई ΠLifetime की तुलना करना दिलचस्प होगा - स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर में पाए जाने वाले सबसे आम प्रवर्तकों में से एक - या AURKA न्यूनतम प्रमोटर अनुक्रम (CTTCCGG) 14,47 के तहत। इस प्रमोटर को पहले किनेज के नॉक-डाउन के बाद उत्पन्न होने वाले मोनोपोलर या बहुध्रुवीय स्पिंडल को बचाने के लिए दिखाया गया था, और इसके उपयोग ने प्रति से 14,47 सेल चक्र को प्रेरित नहीं किया था। हालांकि FLIM प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर और cell11 में सापेक्ष सांद्रता के प्रति असंवेदनशील है, एक ही बायोसेंसर सेटअप पर दो प्रवर्तकों की पूरी तरह से तुलना से लाभ किसी भी स्थान पर सक्रिय AURKA के पूल की समझ को व्यापक करेगा। इसके अलावा, यह उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि कैसे AURKA सक्रियण overexpression पर बदल सकता है, जो उपकला और हेमेटोलॉजिकल कैंसर प्रतिमानों के लिए प्रासंगिक है।

अंतिम, डाउनस्ट्रीम FRET आवेदन को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए। AURKA के क्षेत्र में एक भविष्य के परिप्रेक्ष्य के लिए एक सब्सट्रेट आधारित biosensor के साथ kinase संरचनात्मक biosensor cumulate करने के लिए किया जाएगा। एक साथ दो बायोसेंसर के FRET व्यवहार का विश्लेषण करना - एक प्रक्रिया जिसे मल्टीप्लेक्स FRET के रूप में जाना जाता है - दूसरे दाता चैनल में वर्णक्रमीय रक्तस्राव से बचने के लिए पहले बायोसेंसर पर एक अंधेरे स्वीकर्ता की आवश्यकता होती है। AURKA के संदर्भ में, यह पहले बायोसेंसर के साथ किनेज के सक्रियण का पता लगाने के रोमांचक नए परिप्रेक्ष्य को खोलेगा, और दूसरे के साथ किसी दिए गए सब्सट्रेट की ओर इसकी एंजाइमेटिक गतिविधि। मल्टीप्लेक्सिंग में हाल के विकास अब एक समय में तीन बायोसेंसर तक को कम करने की अनुमति देते हैं48। AURKA के संदर्भ में एक समान विधि को लागू करना न केवल किनेज के सक्रियण-गतिविधि इंटरप्ले का परीक्षण करने के लिए एक बहुत ही आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकता है, बल्कि अभूतपूर्व स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ AURKA सिग्नलिंग कैस्केड का पता लगाने के लिए भी हो सकता है।

अंत में, FRET / FLIM प्रोटीन गतिविधि पर ज्ञान को गहरा करने का एक सुविधाजनक तरीका है। एक तरफ, यह जीवित कोशिकाओं में किसी दिए गए प्रोटीन के स्थानीयकरण की कल्पना करने की अनुमति देता है, कम से कम एक फ्लोरोसेंट समूह के लिए धन्यवाद। दूसरी ओर, यह प्रोटीन संरचनात्मक परिवर्तनों को उजागर कर सकता है, जो प्रोटीन सक्रियण और / या गतिविधि पर जानकारीपूर्ण हो सकता है। इसलिए, FRET / FLIM और संरचनात्मक FRET बायोसेंसर में लाइव कोशिकाओं में सिग्नलिंग मार्गों का पालन करने के लिए व्यापक तरीके बनने की क्षमता है, और अति सुंदर स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ।

Disclosures

जी.B ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया, पांडुलिपि को लिखा और समीक्षा की, और धन प्रदान किया, एमटी ने पांडुलिपि की समीक्षा की और समर्थन प्रदान किया। एमटी एक वैज्ञानिक सलाहकार और इनस्कोपर कंपनी (फ्रांस) के शेयरधारक हैं, जो इस पांडुलिपि में दिखाए गए तेजी से एफएलआईएम माप के लिए समाधान का उत्पादन करता है। Inscoper आंशिक रूप से पांडुलिपि के ओपन एक्सेस प्रकाशन का समर्थन किया। Inscoper प्रयोगात्मक डिजाइन, डेटा हैंडलिंग में शामिल नहीं था, और न ही पांडुलिपि के लेखन में।

Acknowledgments

हम माइक्रोस्कोपी-रेनेस इमेजिंग सेंटर (MRic, BIOSIT, Rennes, फ्रांस) के इंजीनियरों को सलाह और मदद के लिए धन्यवाद देते हैं, और विशेष रूप से पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एक्स। MRic राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे फ्रांस-BioImaging फ्रेंच राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-10-INBS-04) द्वारा समर्थित का सदस्य है। इस काम को केंद्र राष्ट्रीय de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère, और एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था ला Recherche Contre le Cancer (ARC) G.B करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alisertib (MLN8237) SelleckChem S1133 Use at a 250 nM final dilution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFischer Scientific
Brand: Gibco		 41966052 High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer Scientific
Brand: Gibco		 10270106
L15 ThermoFischer Scientific
Brand: Gibco		 21083027 Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red
LabTek Nunc 2515380
Nocodazole Merck
Brand: Sigma-Aldrich		 M1404 Use at a 100 ng/mL final dilution
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific
Brand: Gibco		 15140122 Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x)
Phosphate Buffer Saline (PBS) ThermoFischer Scientific
Brand: Gibco		 14190169 DPBS, no calcium, no magnesium
Trypsin/EDTA ThermoFischer Scientific
Brand: Gibco		 25300096 Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x)

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जीव विज्ञान अंक 161 AURKA FRET FLIM आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर संरचनात्मक परिवर्तन सक्रियण माइटोसिस लाइव कोशिकाएं
ऑरोरा किनेज की वास्तविक समय की निगरानी लाइव कोशिकाओं में संरचनात्मक FRET Biosensors का उपयोग करके एक सक्रियण
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Bertolin, G., Le Marchand, G.,… More

Bertolin, G., Le Marchand, G., Tramier, M. Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells. J. Vis. Exp. (161), e61611, doi:10.3791/61611 (2020).

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