Summary
Aktiveringen av den multifunktionella Ser/Thr kinas AURKA kännetecknas av dess autofosforylering på Thr288. Fluorescerande sonder som förlitar sig på FRET kan diskriminera mellan dess inaktiva och aktiverade tillstånd. Här illustrerar vi några strategier för sondteknik, tillsammans med ett snabbt FRET-protokoll för att följa kinasaktiveringen genom mitos.
Abstract
Epitelial cancer kännetecknas ofta av överuttryck av Ser/Thr kinas Aurora A/AURKA. AURKA är ett multifunktionellt protein som aktiveras på sin autofosforylering på Thr288. AURKA överflöd toppar i mitos, där det styr stabiliteten och återgivningen av den mitotiska spindeln och den totala effektiviteten av mitos. Även om väl karakteriseras på strukturell nivå, saknas en konsekvent övervakning av aktiveringen av AURKA under hela cellcykeln. En möjlig lösning består i att använda genetiskt kodade Försters fret-biosensorer (Resonance Energy Transfer) för att få insikt i autofosforyrening av AURKA med tillräcklig spatiotemporal upplösning. Här beskriver vi ett protokoll för att konstruera FRET biosensorer upptäcka Thr288 autophosphorylation, och hur man följer denna modifiering under mitos. Först ger vi en översikt över möjliga donator/acceptor FRET par, och vi visar möjliga kloning och insättningsmetoder av AURKA FRET biosensorer i däggdjursceller. Sedan tillhandahåller vi en steg-för-steg-analys för snabba FRET-mätningar genom fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) på en specialbyggd installation. Detta protokoll är dock också tillämpligt på alternativa kommersiella lösningar som finns tillgängliga. Vi avslutar med att överväga de lämpligaste FRET-kontrollerna för en AURKA-baserad biosensor, och genom att lyfta fram potentiella framtida förbättringar för att ytterligare öka känsligheten hos detta verktyg.
Introduction
Aurorakinas A/AURKA är en multifunktionell serin/treoninkinas, aktiv under hela cellcykeln och vid olika subcellulära fack1. Förstå dess breda spatiotemporal aktivering är särskilt viktigt i cancer, eftersom AURKA ofta är överuttryckt i epitelial och hematologiska maligniteter, med patienter som visar dålig lyhördhet för de för närvarande tillgängliga terapierna2.
Strukturella studier visade att AURKA genomgår två steg för att konvertera från en inaktiv till en aktiv kinas. För det första ändrar autofosforyeringen av Thr288 konformationen av kinas kinetiska ficka och aktiverar den3,4,5,6. Detta steg ökar den katalytiska aktiviteten hos AURKA i mänskliga celler och i Xenopus laevis3,6,7, vilket priming av kinas för full aktivitet. När AURKA har aktiverats inducerar interaktionen mellan AURKA och målproteinet för Xklp2 (TPX2) en andra konformationsförändring5. Denna ytterligare modifiering gör det möjligt för AURKA att nå full enzymatisk aktivitet mot sina substrat i cellen5,8,9,10.
Under nästan två decennier erhölls insikter om aktivering och aktivitet av AURKA främst genom en kombination av biokemiska metoder. Dessa inkluderar detektion av fosforylerad Thr288 i celler eller in vivo som ett kännetecken för AURKA aktivering, kristallografiska analyser och in vitro eller i cellulo kinas analyser för att undersöka aktiviteten av AURKA1. Den spatiotemporala upplösningen av dessa tillvägagångssätt är dock dålig eller frånvarande, och nya lösningar behövdes för att bredda kunskapen om dynamiken i dessa två händelser.
Utvecklingen av fluorescerande sonder under de senaste åren underlättade övervakningen av AURKA i levande celler, vilket möjliggör följande av dess aktivering med större spatiotemporal upplösning. De mest specifika sensorerna för AURKA som hittills utvecklats förlitar sig på FRET-principen (Försters resonansenergiöverföring)11 för att diskriminera mellan inaktiv och aktiv AURKA. Den första sensorn som utvecklades var en substratbaserad biosensor av AURKA kinasaktivitet. Substratbaserade biosensorer består av en kort aminoacidsekvens som är riktad mot ett givet kinas för fosforylering och sätts in i ett givar/acceptor FRET-par och en bindningsdomän som känner igen fosforylerade rester, vilket hjälper till att vika biosensorn för en effektiv FRET-process12. När det gäller AURKA sattes ett 14-aminoacid fragment av KIF2C som är mål för fosforylering mellan en CFP-YFP givare/acceptor par13. Denna sensor har dock några stora nackdelar. För det första kan KIF2C-sekvensen som används i denna sond riktas både mot AURKA och det närbesläktade kinaset AURKB, vilket minskar specificiteten hos denna biosensor. För det andra förlitar sig sensorn på det endogena kinaset för fosforylering. Därför kan FRET-effektiviteten vara oidentifierbar eller inte signifikant om mängden av kinasen är begränsande (t.ex. i subcellulära fack eller cellcykelfaser). För att övervinna dessa begränsningar skapades en ny klass av AURKA-sensor som kallas "conformational sensorer". I dessa sonder infogades sekvensen av AURKA i en donator fluorophore vid N-ändstationen och en acceptor fluorofor vid C-ändstationen. Inaktiv AURKA presenterar en "öppen" konformation, som tar N- och C-termini av kinasen bort från varandra. Med ett sådant avstånd mellan de två termini (> 10 nm) är donator-/acceptorparet i en icke-tillåtande konfiguration för FRET. Tvärtom antar autofosforylerad AURKA en "sluten" konformation, med de två proteintermini och de två fluoroforerna i närheten. Detta visade sig möjliggöra FRET mellan givaren och acceptorn, som kan mätas med hjälp av variationerna i donatorns livstid14,15. Sådana sonder ger flera fördelar. För det första är de genetiskt kodade, och de kan användas för att ersätta det endogena kinaset i cellen. För det andra räddar de fenotyper som induceras av knockdown av AURKA, vilket indikerar att de är funktionella i cellen. För det tredje tillåter de att följa aktiveringen av kinasen vid olika subcellulära fack och under hela cellcykeln. Sonderna upptäckte aktiveringen av AURKA på platser där det är känt att kinasen är aktiverad (dvs. centrosomer och den mitotiska spindeln) och deltog också i upptäckten av aktiveringen av AURKA vid mitokondrierna16. Slutligen tillät dessa sensorer screening med högt innehåll baserat på FRET/FLIM, där de konformationella förändringarna av AURKA användes för att identifiera nya farmakologiska hämmare17.
I det nuvarande arbetet beskriver vi ett förfarande för att visualisera AURKA aktivering i odlade celler. Först kommer vi att göra en inblick i potentiella fluorofrepar för FRET. Valet av det lämpligaste donator-/acceptorparet kommer att göras enligt den tillgängliga mikroskopinställningen, eller en viss nedströmsapplikation som multiplex FRET18,19. Sedan föreslår vi en pipeline för att utforska beteendet hos den eller de biosensorer som valts i en snabb FRET / FLIM-mikroskopinställning. Den här pipelinen kommer att sträcka sig från cellkultur- och synkroniseringsprocedurer till FLIM-förvärv och dataanalys. Slutligen kommer vi att diskutera de potentiella fördelarna med detta protokoll, eftersom en analog strategi för biosensordesign kan tillämpas på andra kinaser, och det kan också användas med andra FRET-baserade bildsystem.
Protocol
OBS: U2OS-celler som används i detta protokoll köptes från American Type Culture Collection (ATCC, HTB-96), och de testades fria från mykoplasma. Steg 2.1 till 2.7 ska utföras under en laminär flödeshuv för att hålla celler och reagenser sterila.
1. Välja givaren/acceptor FRET-paret
- Se litteraturen för valet av de mest lämpliga donator/acceptor FRET par. Användbara exempel finns i 20,21,22,23,24, även om det slutliga valet måste göras enligt egenskaperna hos FRET / FLIM-installationen (tillgängliga laserlinjer, filter etc.). Följande är några överväganden om hur man väljer ett donator/acceptorpar.
- Välja donator: se FP-basen (https://www.fpbase.org/) för en fullständig uppsättning information om tillgängliga fluorescerande proteiner. Denna databas uppdateras ständigt med alla nyutvecklade fluoroforer.
- Se Fluorescerande biosensordatabas (https://biosensordb.ucsd.edu/index.php) för mer information om de biosensorer som redan finns i litteraturen, tillsammans med respektive fluorescerande proteiner som används.
- Som en allmän utgångspunkt, välj en ljus donatorfluofor. Bra kandidater är cyan fluorescerande proteiner som mTFP1 eller ECFP, eller GFP-varianter som EGFP eller mEGFP.
- Oligomerer kan påverka proteinlokalisering och/eller funktion25. Överväg att använda monomeriska mutanter av CFP som mTurquoise226 eller Aquamarine27,28. Dessa varianter har också bra kvantutbytes- och utrotningskoefficienter, vilket gör dem till bra kandidater som FRET-givare.
- Föredra fluorescerande proteiner (både som donator eller acceptorer) som är okänsliga för miljöförändringar som intracellulärt pH23, eller fotobleaching25, eftersom FRET-effektiviteten kan påverkas kraftigt av dessa parametrar29. Numera används fluoroforer som mTurquoise2 eller mTFP1 i stor utsträckning som givare, tack vare deras goda fotostabilitet22,25,26.
- Välja acceptor: cyandonatorer paras ofta ihop med YFP-varianter (Yellow Fluorescent Protein), som mVenus, Citrine och YPet20,21,22,30. Det bör dock noteras att dessa proteiner har en mycket större känslighet för pH och globalt visar en dålig fotostabilitet.
- Överväg att använda nyutvecklade, pH-okänsliga gula varianter av YFP som pH-Lemon31, gröna fluoroforer som mNeonGreen23 eller röda fluoroforer som mScarlet-I23,32 som tidigare validerade fluorescerande acceptorer för mTurquoise2.
- Alternativt kan du överväga att använda icke-fluorescerande/mörka derivat av YFP som ShadowG33 eller ShadowY34, som visade sig fungera som bra acceptorer för cyan-fluorescerande givare i FRET / FLIM experiment.
- Om du använder mEGFP som donator, överväg att använda monomeriska röda acceptorer som mCherry.
- Verifiera de spektrala egenskaperna hos det valda donator-/acceptorparet med hjälp av de verktyg som finns tillgängliga på FP-basens webbplats. Se figur 1 för ett exempel på mEGFP/mCherry-paret.
- På baswebbplatsen för FP väljer du listrutan Verktyg och väljer Spektravisare.
- I listrutan anger du namnet på fluorophoreparet för att visualisera (t.ex. mEGFP och mCherry).
- Simulera egenskaperna hos donator-/acceptorparet med en specifik ljuskälla genom att välja en viss laser i rullgardinsmenyn. Du kan också ange en specifik laservåglängd genom att välja Lägg till laser. Klicka på normalisera utsläppet till det här alternativet för att justera fluoroforspektrat till önskad våglängd. Här är våglängden som används för att excitera GFP på 480 ± 10 nm.
- Klona det valda donator-/acceptorparet genom att tillsätta en fluorofor vid N-ändstationen i AURKA:s sekvens i full längd och en vid C-ändstationen. Följ riktlinjerna för den föredragna kloningsmetoden för att infoga denna konstruktion i en däggdjursuttryck vektor val.
2. Cellkultur, transfektion och synkronisering
- DAG 1. Förbered odlingsmedium för U2OS-celler: använd Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin och 1% L-Glutamin (från och med nu, Komplett tillväxtmedium). Alternativt kan DMEM med förtillskott L-glutamin också användas.
- Om cellerna är frysta, tina en injektionsflaska minst 8 dagar före experiment (dvs. från punkt 2.5 och senare).
- Odla celler i en inkubator tillägnad däggdjurscellkulturer vid 37 °C och med 5% CO2. Rengör och sterilisera inkubatorn regelbundet för att undvika föroreningar.
- När cellerna når ~80% sammanflöde:
- Tvätta dem kort med steril 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS) utan Ca2+ och Mg2+.
- Prova celler med sterila 0,05% Trypsin-EDTA enligt tillverkarens protokoll och genom att placera celler i inkubatorn i 1-3 min.
- Inaktivera trypsin genom att lägga till dubbelt så mycket som kompletta tillväxtmedier; blanda väl.
- Centrifugera cellfjädringen vid 800 x g i 3-5 min.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och beräkna lämplig utspädning för att de ska vara vid ~ 70-80% sammanflöde i kammarrutschbanor dagen efter. Alternativt kan liknande stöd för live cell imaging också användas.
- Pipet motsvarande volym av celler i det valda levande cellavbildningsstödet och placera cellerna tillbaka i inkubatorn till dagen efter.
- DAG 2. Fortsätt med transfektion. Följ riktlinjerna för den föredragna transienta transfektionsmetoden(erna) för att uppnå en optimal transfekteringseffektivitet (~50/80%). Ingen specifik transfekteringsmetod krävs. Observera att transfektionens effektivitet kan variera beroende på den använda cellinjen. Inkubera i 48 timmar.
OBS: Producera stabila kloner som innehåller var och en av de tre vektorerna för att kringgå behovet av tillfälliga transfektioner. I detta skede bör två typer av kontroller planeras. För det första krävs en "endast donatorkontroll" för att kontrollera att förekomsten av AURKA i full längd inte stör livslängden för mTurquoise2 i sig. För det andra bör en biosensor som bär en kinasdöd mutation användas som en negativ kontroll där FRET avskaffas eller sänks avsevärt. Alternativt till en kinasdöd mutant kan en kemisk hämmare av AURKA-aktivering som ATP-analog MLN8237 användas som en negativ kontroll.- Planera framåt tre transfektionsvillkor, var och en av dem i en oberoende brunn:
Vektorn endast för givare (t.ex. AURKA-mTurquoise2)
"Biosensorn" (t.ex. superYFP-AURKA-mTurquoise2)
En kinasdöd/"K162M" biosensor (t.ex. superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2) eller alternativt en hämmare av AURKA-aktivering (t.ex. MLN8237) - Utför tre villkor för varje oberoende donator/acceptorpar att jämföra.
- Överväg att fördubbla antalet transfekterade brunnar om du jämför osynkroniserade och G2/M-synkroniserade celler (se steg 2.6).
- Planera framåt tre transfektionsvillkor, var och en av dem i en oberoende brunn:
- DAG 3. Synkronisera celler i G2/M. Tillsätt 100 ng/mL nocodazol upplöst i DMSO till varje transfekterad brunn för att undvika ljusexponering och inkubera i 16 timmar (helst över natten). Om du jämför osynkroniserade och G2/M-synkroniserade celler, behandla varje transfektionstillstånd med nocodazol eller med lika stor mängd DMSO. För en bättre synkroniseringseffektivitet, förbered engångs alikvoter av nocodazol i DMSO, lagra dem vid -20 °C och kassera dem efter användning.
Obs: Cellsynkroniseringseffektiviteten kan variera mellan cellinjer. Den optimala koncentrationen av nocodazol och inkubationstiden bör experimentellt bestämmas genom flödescytometrimetoder före FRET/FLIM-experiment. För statistiskt relevanta FRET/FLIM-analyser rekommenderar vi en synkroniseringseffektivitet i G2/M på minst 50% av den totala cellpopulationen. - DAG 4. Nocodazol washout och FRET/FLIM imaging på mitotiska celler
- Ta bort odlingsmediet med en pipett och ersätt det med förvärmd, steril PBS. Undvik om möjligt ljusexponering. Gunga försiktigt plattan.
- Upprepa tvättproceduren och undvik alltid ljusexponering.
- Ta bort den andra PBS-tvätten och ersätt den med förvärmd, steril Leibovitz L-15 medium, kompletterad med 20% Fetal Bovine Serum (FBS) och 1% Penicillin-Streptomycin (från och med nu bildmedia).
OBS: Bildmedier bör köpas utan pH-indikatorer (t.ex. fenolrött) och medelstora komponenter som riboflavin. Dessa ämnen är en källa till autofluorescens som kan störa livstidsvärden. - Fortsätt med FRET/FLIM-avbildning. Minimera snabba temperaturförändringar och fortsätt till bildsteget (steg 3) så snabbt som möjligt. Överväg att skydda provet från ljus medan du transporterar det till mikroskopet (dvs. genom att slå in det i en aluminiumfolie eller placera det i en låda).
3. FRET/FLIM förvärv
OBS: FRET/FLIM-förvärv i detta protokoll utfördes på en specialbyggd installation, beskriven i35 och utrustad med en kontrolllösning som i 15,17 (figur 2). Installationen kommersialiseras nu av Inscoper och den är tillverkad av ett spinndiskmikroskop med en vit laser för pulsad excitation och en hög hastighets tids gated intensifierare framför kameran. Temporala portar på 2 ns i ett tidsfönster på 10 ns används sekventiellt för att få en hög med fem tidsbestämda bilder. Dessa bilder används sedan för att beräkna pixel-för-pixel medel fluorescens livstid enligt följande ekvation: τ = ΣΔti • Ιi/ΣΙi, där Δti motsvarar fördröjningstiden för den ith grinden medan jag anger pixel-för-pixel tid-gated intensitet bild35,36 . Den här metoden säkerställer snabba FLIM-mätningar: inga monterings- eller binning-steg krävs och livslängden kan beräknas i ett onlineläge med minimal fotonbudget. Systemet presenterar också ett användarvänligt mjukvarugränssnitt. Samma experiment kan dock utföras under alla andra kommersiella mikroskopinställningar som är utrustade för FLIM-mätningar.
- För att säkerställa en optimal frisättning av celler från G2/M-blocket till mitos, utför experiment vid 37 °C. Utför om möjligt FRET/FLIM-experiment med mikroskopinställningar utrustade med en termostatkammare.
- Slå på mikroskopets termostatkammare minst 30 min till 1 h före experimentet.
- Slå på lasern, kameran, mikroskopet och bildprogramvaran (bild 2).
- Välj lämpliga excitations- och emissionsvåglängder för donatorfluoforen. Praktiska våglängdsalternativ är: λex 440/10 nm och λem 483/35 nm för mTurquoise2 (figur 3A); λex 488/10 nm och λem 525/50 nm för GFP) (figur 3B).
- Ställ in exponeringstiden, i allmänhet mellan 30 och 100 ms (figur 3). Se upp för att överdriven lasereffekt kan leda till inducerade fototoxiska effekter som fotobleaching, vilket i sin tur kan ändra fluorescensens livslängd37. På inställningen validerar du frånvaron av fotobleaching-händelser genom att övervaka fluorescensintensiteten hos den första porten under timelapse-förvärv. Om variationer i fluorescensintensiteten kan observeras, kassera förvärvet och justera lasereffekten.
OBS: I installationen här väljer du en exponeringstid som tillåter minst 3000 grå nivåer i den första porten. Annars kommer programvaran inte att beräkna donatorns livslängd. Det här grå nivåvärdet motsvarar den minimala fotonbudget som krävs för att erhålla relevanta livstidsvärden. - Innan du startar FRET/FLIM-förvärv, se till att cellerna har gått in i mitos genom att vänta tills den bipolära spindeln (~ 20/30 min i U2OS-celler). Eftersom mitotisk AURKA lokaliserar främst vid denna struktur, verifiera mitotisk progression genom att undersöka bildandet av spindeln i celler direkt under mikroskopet, med en extern ljuskälla (figur 1). Observera att den tid som krävs för mitotisk progression kan variera beroende på den cellinje som används.
- Om behandling med MLN8237 planeras, placera cellerna under mikroskopet och låt dem nå metafas (ca 20 min efter nocodazoltvätt). Tillsätt 250 nM MLN8237 upplöst i DMSO både till celler som uttrycker donatorkonstruktionen och till celler som uttrycker biosensorn.
- Kontrollera detta tillstånd på celler som transfekteras enligt ovan och inkubera med en lika stor mängd DMSO. För en bättre AURKA-hämning, förbered engångs alikvoter av MLN8237 i DMSO, förvara dem vid -80 °C. Tina dem genom att placera alikvoterna på is och kassera dem efter användning.
- Inkubera i 10 min. Efter denna period kommer den mitotiska spindeln att krympa och endast en enda, intensiv punkt är kvar. En liknande fenotyp observeras när K162M mutanter används.
- För en bättre upplösning av den mitotiska spindeln, använd minst ett 63x-mål (figur 3).
- När en cell har hittats i metafas (se figur 4 som ett exempel på en cell i metafas) justerar du xyz-koordinaterna så att den placerar den i mitten av synfältet.
- För snabbare bilder väljer du ett enda z-plan . Välj det plan där den mitotiska spindeln är mer synlig eller intensiv.
- Starta inspelningen. Förvärvstiden kan variera beroende på den FLIM-inställning som används (från några sekunder till min). Majoriteten av de kommersiella upplägg som finns tillgängliga på marknaden kommer att utveckla både fluorescensmikrografen och pixel-för-pixel-livstidskartan. Spara båda bilderna.
- Skaffa minst 10 oberoende bilder från varje transfekt och/eller behandlingstillstånd.
4. Beräkning av ΔLivstid och jämförelse av FLIM-värden mellan donator-/acceptorpar
- Extrahera livstidsvärden från hela pixel-för-pixel-livstidskartan (dvs. hela mitotiska spindeln) eller utvalda intresseområden (ROI) som motsvarar specifika underregioner.
OBS: Enligt den FRET/FLIM-inställning som används kan livstidsberäkningar utföras direkt på förvärvsprogramvaran eller extraheras med generiska bildbehandlingslösningar (t.ex. Fiji/ImageJ: https://fiji.sc/). Programvara som direkt beräknar livstidsvärden (även kallat onlineläge) erbjuder en mer användarvänlig lösning, som är lämplig för nybörjare och mikroskopianvändare som inte är helt bekanta med FRET / FLIM. Tvärtom kräver utvinning av livstidsvärden efter förvärv ofta ett passande förfarande. Detta alternativ är mindre tillgängligt för nybörjare, eftersom vissa tidigare kunskaper om matematiska modeller av montering är nödvändiga. - När du har visualiserat eller extraherat, beräkna medellivslängden för de celler som uttrycker vektorn endast för givare (t.ex. AURKA-mTurquoise2), betyder härmed donatorlivslängd.
- Subtrahera varje oberoende livstidsvärde beräknat i steg 4.1 från den genomsnittliga donatorlivslängden. Om du upprepar det här steget för alla celler under alla analyserade förhållanden kommer ΔLifetime att ge ΔLifetime för varje tillstånd.
- Jämför ΔLifetime-värden för "endast donator", "biosensor" och "K162M", eller DMSO och MLN8237-villkoren.
OBS: För villkoret "endast donator" bör ΔLifetime resultera i värden nära noll och motsvarande de experimentella fluktuationerna i livstidsvärdena. För "biosensor"-tillståndet bör ΔLifetime-värden ge nettoskillnaden mellan de två konstruktionerna (se figur 4 för ett illustrerat exempel). - Jämför ΔLifetime-värden mellan olika donator-/acceptorpar.
- Jämför "biosensor" -villkoren: visar de liknande ΔLifetime?
- Visar "K162M" eller MLN8237-villkoren liknande ΔLifetime bland dem? Liknar deras ΔLifetime tillståndet "endast för donatorer"?
Representative Results
Vi följde förfarandet som beskrivs ovan för att spela in autophosphorylation av AURKA på Thr288 med hjälp av två biosensorer med olika spektral egenskaper. Vi jämförde den ursprungliga GFP-AURKa-mCherry sonden14 med två biosensorer med olika spektralegenskaper. Dessa två sonder förlitar sig på fluorescerande givaren mTurquoise2 och på en icke-fluorescerande acceptor (ShadowG) i ett fall, eller en gul acceptor (superYFP) i ett andra fall. Vi satte sedan in sekvensen av AURKA i hela sekvensen i varje donator/acceptorpar. För att ha en negativ kontroll för AURKA-aktivering kan två strategier följas. För det första stör användningen av en liten ATP-analog (MLN8237) bindningen av ATP i kinas kinetiska ficka och förhindrar dess aktivering38. För det andra skapar mutationen av Lys162 i Met (K162M), en kinasdöd version av varje biosensor som inte kan aktivera14,15,39. Denna mutation inducerar störningen av en saltbro som normalt upprättas mellan Lys162 och Glu181, vilket resulterar i en stabil öppning av kinas kinetiska ficka och utlöser dess övergripande inaktivering40. Som en negativ kontroll för FRET använde vi en acceptor-sluid konstruktion (GFP-AURKA eller AURKA-mTurquoise2).
Efter att ha synkroniserat celler i G2/M och släppt dem i mitos mätte vi livslängden för alla transfekterade konstruktioner vid den mitotiska spindeln (figur 4). Observera att denna struktur ansågs vara en helhet, och inga ROIs i spindeln analyserades. Vi beräknade sedan ΔLifetime för alla förhållanden. Som förväntat var livslängden för GFP-AURKA eller AURKA-mTurquoise2 (villkoren endast för givare) nära 0, vilket tyder på att de värden som uppmätts för dessa konstruktioner fluktuerade runt medelvärdet (figur 4A,4B). Omvänt skilde sig ΔLifetime-värdena för GFP-AURKA-mCherry statistiskt från tillståndet endast för donatorer, med ΔLifetime som ökade med ~ 130 ps (figur 4A). Liknande observationer gjordes för shadowG-AURKA-mTurquoise2 och för superYFP-AURKA-mTurquoise2, med ΔLifetime ökar på ~150 respektive ~220 ps från givarens villkor(figur 4B,4C). Dessa data kan enkelt visualiseras i enstaka celler med en pseudocolor Lookup Table (LUT). I det här fallet är värdena för ΔLifetime runt 0 pseudofärgade gula, medan mer betydande skillnader är pseudofärgade röda/lila. Pixel-för-pixel LUT var närmare gult i celler som uttrycker donator-endast konstruktionerna, medan det var mer i det röda /lila spektrumet i celler som uttrycker antingen biosensor (figur 4A,4B). Detta observerades också när biosensorn GFP-AURKA-mCherry behandlades med den farmakologiska hämmaren MLN8237.
Vi analyserade sedan ΔLifetime av kinasdöda biosensorer. Dessa konstruktioner visade mellanliggande ΔLifetime-värden: ΔLifetime var betydligt högre jämfört med tillståndet för enbart donatorer (figur 4B,4C), men det var också betydligt lägre än deras normala motsvarigheter (figur 4B,4D). Jämförelserna med celler som behandlats med MLN8237 eller uttrycker kinasdöda biosensorer är nödvändiga för att uppskatta om ΔLifetime-variationer för varje donator/acceptorpar endast är kopplade till aktiveringen av AURKA. När det gäller GFP-AURKA-mCherry avskaffas ΔLifetime-variationer när en AURKA-specifik hämmare används. Omvänt är ΔLifetime-variationer mestadels, men inte uteslutande kopplade till AURKA-aktivering när det gäller shadowG-AURKA-mTurquoise2 och superYFP-AURKA-mTurquoise2.
Figur 1: GFP (givare) och mCherry (acceptor) excitation och emissionsspektra.
Spektra erhölls och anpassades från FP-basens webbplats (https://www.fpbase.org/) och justerades till en 480 nm-laser excitation. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Bild av den experimentella arbetsytan.
(1) Kontrolllösningen. 2. Vit laserkälla. (3) CCD-kamera. 4) Mikroskopinställning. (5) Extern ljuskälla/ljuslampa för okulär screening av provet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa bilder av programvaran för FLIM-förvärv.
(A, B) (1) Excitations- och utsläppsparametrar för givaren (CFP i A eller GFP i B). 2. Exponeringstid. (3) Val av mål. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa bilder av AURKA FRET biosensorer och deras negativa kontroller.
(A) (Mikrografer) Fluorescens (grön kanal) och motsvarande pixel-för-pixel ΔLifetime (endast donator – biosensor) av U2OS-celler som uttrycker GFP-AURKA eller GFP-AURKA-mCherry, synkroniserade vid G2/M, släpps tills den bipolära spindeln är synlig och sedan behandlas med DMSO eller med MLN8237. ΔLifetime illustreras med en pseudocolorskala ("Fire" uppslagstabell). (Diagram) Motsvarande kvantifiering och tvåvägs ANOVA-analys för de angivna förhållandena. (B) (Mikrografer) Fluorescens (cyankanal) och motsvarande pixel-för-pixel ΔLifetime (endast donator – biosensor) av U2OS-celler som uttrycker shadowG-AURKA-mTurquoise2 (övre panel) eller superYFP-AURKA-mTurquoise2 (nedre panelen), synkroniserade vid G2/M och släpps tills den bipolära spindeln är synlig. ΔLifetime illustreras med en pseudocolorskala ("Fire" uppslagstabell). (Diagram) Motsvarande kvantifiering och enkelriktad ANOVA-analys av förhållanden representerade i ovanstående mikrografer. (C) (Mikrografer) Bilder av AURKA-mTurquoise2 (övre panelen), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (mellanpanel) och superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2 förvärvade och representerade som i mikrograferna. (Diagram) Tvåvägs ANOVA-analys för de angivna transfekteringsförhållandena. Fältet i boxplots representerar medianvärdet. whiskers sträcker sig från min till max . n = 10 celler per tillstånd för ett representativt experiment (av tre). Individuella värden representeras som prickar. Skalstång: 10 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mot varje angivna tillstånd i A) "AURKA-mTurquoise2"-tillståndet i B och mot varje angivna tillstånd i C. NS: inte signifikant. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Genetiskt kodade FRET-biosensorer är tillförlitliga verktyg för att mäta aktivering av enskilda proteiner eller av hela signalvägar41. Särskilt AURKA FRET-biosensorn utgör ett prioriterat sätt att utforska aktiveringen av kinasen i tid och rum. Vissa element förtjänar dock särskild uppmärksamhet när man utformar eller optimerar en FRET-biosensor, inte bara i allmänna termer utan mer specifikt för AURKA.
För det första kan arten och den relativa positionen för givaren/acceptor FRET-paret anpassas för specifika funktioner i detta kinas. AURKA är kraftigt berikad vid mitotisk spindel under mitos, men det är närvarande under hela cellcykeln och på olika subcellulära platser (t.ex. centrosomer, kärnan och mitokondrier)1,2. Om biosensorn ska användas i specifika fack som mitokondrier, som kan nå surt pH, bör valet av ett pH-okänsligt donator-acceptor FRET-par som mTurquoise2/shadowG göras. Dessutom, placera FRET givaren vid C-terminus kan möjliggöra en bättre visualisering av biosensorn vid detta subcellulära fack, och potentiellt även optimera FRET upptäckt med tanke på att AURKA N-terminus visade sig delvis klyva av vid mitokondrier16,42.
För det andra skulle ett ännu outforskat sätt att optimera biosensorn AURKA FRET kräva en noggrannare utformning av länkar mellan AURKA i full längd och givar-/acceptorparet. Inte bara avståndet mellan det fluorescerande paret, utan också egenskaperna hos själva länkaren visade sig vara nyckelfaktorer för att förbättra FRET-effektiviteten43,44,45,46. Mot denna bakgrund kan en ökning av länkarens styvhet eller flexibilitet antingen vara skadlig för FRET:s effektivitet eller ytterligare förbättra den.
För det tredje är det känt att överuttryck av AURKA inducerar mitotiska spindelavvikelser i en betydande andel av cellerna2. Det skulle vara intressant att jämföra ΔLifetime som erhållits genom att uttrycka samma FRET-konstruktion under en stark promotor som cytomegalovirus (CMV) - en av de vanligaste promotorerna som finns i däggdjursuttryck vektorer - eller under AURKA minimal promotor sekvens (CTTCCGG)14,47. Denna promotor visade sig tidigare rädda monopolära eller multipolära spindlar som uppstod efter nedslagningen av kinasen, och dess användning inducerade inte cellcykelperturationer i sig14,47. Även om FLIM är okänsligt för proteinuttrycksnivåer och relativa koncentrationer i cellen11, skulle dra nytta av en grundlig jämförelse av de två promotorerna på samma biosensorinställning bredda förståelsen av poolen av aktiverad AURKA på en viss plats. Dessutom skulle det ge nya insikter om hur AURKA aktivering kan förändras vid överuttryck, vilket är relevant för epitelial och hematologic cancer paradigm.
Slutligen bör även fret-ansökan i efterföljande led beaktas. Ett framtidsperspektiv inom AURKA skulle vara att kumulera kinaskonformationella biosensor med en substratbaserad biosensor. Att analysera FRET-beteendet hos två biosensorer samtidigt – en process som kallas multiplex FRET – kräver en mörk acceptor på den första biosensorn för att undvika spektralblödning i den andra givarkanalen. I samband med AURKA skulle detta öppna upp det spännande nya perspektivet att upptäcka aktiveringen av kinasen med den första biosensorn och dess enzymatiska aktivitet mot ett givet substrat med det andra. Den senaste utvecklingen inom multiplexering gör det nu möjligt att kumulera upp till tre biosensorer åt gången48. Att tillämpa en liknande metod i samband med AURKA kan representera en mycket lovande strategi inte bara för att testa aktiveringsaktivitetsinterplay av kinasen, men också för att utforska AURKA-signalkaskader med oöverträffad spatiotemporal upplösning.
Sammanfattningsvis är FRET/FLIM ett bekvämt sätt att fördjupa kunskapen om proteinaktivitet. Å ena sidan gör det möjligt att visualisera lokaliseringen av ett givet protein i levande celler, tack vare minst en fluorescerande munterhet. Å andra sidan kan det riva upp proteinkonformationella förändringar, vilket kan vara informativt om proteinaktivering och / eller aktivitet. Därför har FRET/FLIM och conformational FRET biosensorer potential att bli utbredda metoder för att följa signalering vägar i levande celler, och med utsökt spatiotemporal upplösning.
Disclosures
G.B. utförde experimenten, skrev och granskade manuskriptet och tillhandahöll finansiering, M.T. granskade manuskriptet och gav stöd. M.T. är vetenskaplig rådgivare och aktieägare i Inscoper-företaget (Frankrike), som producerar lösningarna för snabba FLIM-mätningar som visas i detta manuskript. Inscoper stödde delvis Open Access-publiceringen av manuskriptet. Inscoper var inte involverad i experimentell design, datahantering eller i skrivandet av manuskriptet.
Acknowledgments
Vi tackar ingenjörerna vid Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankrike) för råd och hjälp, och särskilt X. Pinson för kritisk läsning av manuskriptet. MRic är medlem i den nationella infrastrukturen France-BioImaging med stöd av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-10-INBS-04). Detta arbete stöddes av Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère och Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) till G.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
| L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
| LabTek | Nunc | 2515380 | |
| Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |
References
- Bertolin, G., Tramier, M. Insights into the non-mitotic functions of Aurora kinase A: more than just cell division. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Nikonova, A. S., Astsaturov, I., Serebriiskii, I. G., Dunbrack, R. L., Golemis, E. A. Aurora A kinase (AURKA) in normal and pathological cell division. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (4), 661-687 (2013).
- Walter, A. O., Seghezzi, W., Korver, W., Sheung, J., Lees, E. The mitotic serine/threonine kinase Aurora2/AIK is regulated by phosphorylation and degradation. Oncogene. 19 (42), 4906-4916 (2000).
- Cheetham, G. M. T. Crystal Structure of Aurora-2, an Oncogenic Serine/Threonine Kinase. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42419-42422 (2002).
- Bayliss, R., Sardon, T., Vernos, I., Conti, E. Structural basis of Aurora-A activation by TPX2 at the mitotic spindle. Molecular Cell. 12 (4), 851-862 (2003).
- Zhang, Y., et al. Identification of the auto-inhibitory domains of Aurora-A kinase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 357 (2), 347-352 (2007).
- Littlepage, L. E., Wu, H., Andresson, T., Deanehan, J. K., Amundadottir, L. T., Ruderman, J. V. Identification of phosphorylated residues that affect the activity of the mitotic kinase Aurora-A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15440-15445 (2002).
- Kufer, T. A., et al. Human TPX2 is required for targeting Aurora-A kinase to the spindle. The Journal of Cell Biology. 158 (4), 617-623 (2002).
- Eyers, P. A., Erikson, E., Chen, L. G., Maller, J. L. A novel mechanism for activation of the protein kinase Aurora A. Current Biology. 13 (8), 691-697 (2003).
- Brunet, S., et al. Characterization of the TPX2 Domains Involved in Microtubule Nucleation and Spindle Assembly in Xenopus Egg Extracts. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5318-5328 (2004).
- Padilla-Parra, S., Tramier, M. FRET microscopy in the living cell: Different approaches, strengths and weaknesses. BioEssays. 34 (5), 369-376 (2012).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Fuller, B. G., et al. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453 (7198), 1132-1136 (2008).
- Bertolin, G., et al. A FRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells. Nature Communications. 7, 12674 (2016).
- Bertolin, G., et al. Optimized FRET Pairs and Quantification Approaches To Detect the Activation of Aurora Kinase A at Mitosis. ACS Sensors. 4 (8), 2018-2027 (2019).
- Bertolin, G., et al. Aurora kinase A localises to mitochondria to control organelle dynamics and energy production. eLife. 7, (2018).
- Sizaire, F., Le Marchand, G., Pécréaux, J., Bouchareb, O., Tramier, M. Automated screening of AURKA activity based on a genetically encoded FRET biosensor using fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods and Applications in Fluorescence. 8 (2), 024006 (2020).
- Demeautis, C., et al. Multiplexing PKA and ERK1&2 kinases FRET biosensors in living cells using single excitation wavelength dual colour FLIM. Scientific Reports. 7, 41026 (2017).
- Ringer, P., et al. Multiplexing molecular tension sensors reveals piconewton force gradient across talin-1. Nature Methods. 14 (11), 1090-1096 (2017).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
- Fritz, R. D., et al. A Versatile Toolkit to Produce Sensitive FRET Biosensors to Visualize Signaling in Time and Space. Science Signaling. 6 (285), (2013).
- Mastop, M., et al. Characterization of a spectrally diverse set of fluorescent proteins as FRET acceptors for mTurquoise2. Scientific Reports. 7 (1), 11999 (2017).
- vander Krogt, G. N. M., Ogink, J., Ponsioen, B., Jalink, K. A Comparison of Donor-Acceptor Pairs for Genetically Encoded FRET Sensors: Application to the Epac cAMP Sensor as an Example. PLoS ONE. 3 (4), 1916 (2008).
- Cranfill, P. J., et al.
- Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93. Nature Communications. 3 (1), (2012).
- Mérola, F., et al. Newly engineered cyan fluorescent proteins with enhanced performances for live cell FRET imaging. Biotechnology Journal. 9 (2), 180-191 (2014).
- Erard, M., et al. Minimum set of mutations needed to optimize cyan fluorescent proteins for live cell imaging. Molecular BioSystems. 9 (2), 258-267 (2013).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. C., Masse, M. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determination by fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells. Microscopy Research and Technique. 69 (11), 933-939 (2006).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative Comparison of Different Fluorescent Protein Couples for Fast FRET-FLIM Acquisition. Biophysical Journal. 97 (8), 2368-2376 (2009).
- Burgstaller, S., et al. pH-Lemon, a Fluorescent Protein-Based pH Reporter for Acidic Compartments. ACS Sensors. , (2019).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2016).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 15334 (2015).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E. ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement. Scientific Reports. 7 (1), 6791 (2017).
- Leray, A., Padilla-Parra, S., Roul, J., Héliot, L., Tramier, M. Spatio-Temporal Quantification of FRET in living cells by fast time-domain FLIM: a comparative study of non-fitting methods [corrected]. PloS One. 8 (7), 69335 (2013).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95 (6), 2976-2988 (2008).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 68 (6), 2588-2600 (1995).
- Manfredi, M. G., et al. Characterization of Alisertib (MLN8237), an investigational small-molecule inhibitor of aurora A kinase using novel in vivo pharmacodynamic assays. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 17 (24), 7614-7624 (2011).
- Katayama, H., et al. Phosphorylation by aurora kinase A induces Mdm2-mediated destabilization and inhibition of p53. Nature Genetics. 36 (1), 55-62 (2004).
- Nowakowski, J., et al. Structures of the Cancer-Related Aurora-A, FAK, and EphA2 Protein Kinases from Nanovolume Crystallography. Structure. 10 (12), 1659-1667 (2002).
- Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
- Grant, R., et al. Constitutive regulation of mitochondrial morphology by Aurora A kinase depends on a predicted cryptic targeting sequence at the N-terminus. Open Biology. 8 (6), 170272 (2018).
- Shimozono, S., Miyawaki, A. Engineering FRET Constructs Using CFP and YFP. Methods in Cell Biology. 85, 381-393 (2008).
- Komatsu, N., et al. Development of an optimized backbone of FRET biosensors for kinases and GTPases. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4647-4656 (2011).
- Schifferer, M., Griesbeck, O. A Dynamic FRET Reporter of Gene Expression Improved by Functional Screening. Journal of the American Chemical Society. 134 (37), 15185-15188 (2012).
- Peroza, E. A., Boumezbeur, A. H., Zamboni, N. Rapid, randomized development of genetically encoded FRET sensors for small molecules. Analyst. 140 (13), 4540-4548 (2015).
- Reboutier, D., et al. Aurora A is involved in central spindle assembly through phosphorylation of Ser 19 in P150Glued. The Journal of Cell Biology. 201 (1), 65-79 (2013).
- Mo, G. C. H., Posner, C., Rodriguez, E. A., Sun, T., Zhang, J. A rationally enhanced red fluorescent protein expands the utility of FRET biosensors. Nature Communications. 11 (1), 1848 (2020).
