Summary
Detta protokoll tillhandahåller metoder för visualisering av bakterieceller och polysackaridsynteslokus (Psl) polysackarid i sputum hos patienter med cystisk fibros.
Abstract
Tidig upptäckt och utrotning av Pseudomonas aeruginosa i lungorna hos patienter med cystisk fibros kan minska risken för att utveckla kroniska infektioner. Utvecklingen av kroniska P. aeruginosa-infektioner är förknippad med en försämring av lungfunktionen och ökad sjuklighet. Därför finns det ett stort intresse för att klarlägga orsakerna till att man inte lyckats utrota P. aeruginosa med antibiotikabehandling som förekommer hos cirka 10-40% av pediatriska patienter. En av många faktorer som kan påverka värdclearance av P. aeruginosa och antibiotikakänslighet är variationer i rumslig organisation (såsom aggregering eller biofilmbildning) och polysackaridproduktion. Därför var vi intresserade av att visualisera in situ-egenskaperna hos P. aeruginosa i sputum hos CF-patienter. En vävnadsrensningsteknik tillämpades på sputumprover efter att proverna bäddats in i en hydrogelmatris för att behålla 3D-strukturerna i förhållande till värdceller. Efter vävnadsrensning tillsattes fluorescerande etiketter och färgämnen för att möjliggöra visualisering. Fluorescens in situ hybridisering utfördes för visualisering av bakterieceller, bindning av fluorescerande märkta anti-Psl-antikroppar för visualisering av exopolysackariden och DAPI-färgning för att färga värdceller för att erhålla strukturell insikt. Dessa metoder möjliggjorde högupplöst avbildning av P. aeruginosa i sputum hos CF-patienter via konfokal laserskanningsmikroskopi.
Introduction
I denna studie utformades experiment för att visualisera in vivo-strukturen hos Pseudomonas aeruginosa i sputum hos patienter med cystisk fibros hos barn. P. aeruginosa-infektioner blir kroniska hos 30-40 % av den pediatriska CF-populationen; När kroniska infektioner väl har etablerats är de nästan omöjliga att eliminera1. P. aeruginosa-isolat från patienter med tidig infektion är i allmänhet mer mottagliga för antimikrobiella medel, därför behandlas dessa med anti-pseudomonala antibiotika för att förhindra uppkomsten av kronisk infektion2. Tyvärr elimineras inte alla P. aeruginosa-isolat effektivt från lungorna efter antibiotikabehandling. De exakta mekanismerna i samband med antibiotikasvikt är inte helt klarlagda. Tidigare studier har visat att variationer i biofilmens celltäthet, aggregering och polysackaridproduktion kan påverka antibiotikans effekt3. P. aeruginosa producerar tre extracellulära polysackarider: Pel, Psl och alginat4. De flesta stammar av P. aeruginosa har den genetiska förmågan att uttrycka var och en av exopolysackariderna, även om ofta en typ av polysackarid uttrycks övervägande5. Exopolysackariden alginat är associerad med kroniska infektioner i CF-lungan, vilket resulterar i en mukoid fenotyp 6,7. Polysackariderna Pel och Psl har flera funktioner, bland annat att hjälpa till med initial bindning och bibehållande av biofilmstruktur och ge antibiotikaresistens8.
Metoder som syftar till att visualisera in vivo-strukturer av vävnader har utvecklats för en mängd olika provtyper 9,10,11. På senare tid har de skräddarsytts för att visualisera mikrobiella samhällen i sputum in vivo från CF-patienter12. Optimeringen av ett vävnadsrensningsprotokoll specifikt för identifiering av mikrobiella samhällen i sputum utvecklades av DePas et al., 201612. Termen MiPACT, som står för mikrobial identifikation efter Passive CLARITY technique, myntades för rensning av CF-sputum11,12. För vävnadsrensningstekniker fixeras proverna först och görs sedan transparenta samtidigt som deras inneboende arkitektur lämnas intakt för färgning och mikroskopisk visualisering11. Fixering och rensning av CF-sputumprover gör det möjligt för forskare att svara på frågor relaterade till biofilmstruktur, bakteriell celltäthet, polymikrobiella associationer och associationer mellan patogener och värdceller. Fördelen med att direkt undersöka bakterier som har bevarats i sputum är att de kan analyseras och visualiseras i ett värdspecifikt sammanhang. Även om in vitro-tillväxt av kliniska isolat i laboratoriet för experiment kan vara mycket informativ, kan sådana metoder inte helt återskapa CF-lungmiljön, vilket resulterar i en koppling mellan laboratorieresultat och patientresultat.
Metoderna som presenteras här kan användas för att fixera och rensa sputum för att visualisera bakterier, oavsett om de kommer från CF-patienter eller patienter med andra luftvägsinfektioner. Den specifika typen av färgning och mikroskopisk analys som beskrivs här är fluorescens in situ-hybridisering (FISH), följt av anti-Psl-antikroppsbindning i hydrogelen och efterföljande analys via konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM). Efter vävnadsrensning kan även andra immunhistokemiska och mikroskopimetoder tillämpas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande från Research Ethics Board (REB) krävs för att samla in och lagra sputumprover från försökspersoner. Studier som presenteras här har godkänts av Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Sputum-samling
- Förvara upphostningslöst slem i en steril uppsamlingskopp och förvara omedelbart vid 4 °C i högst 24 timmar före fixeringen.
OBS: Att lämna sputum för länge vid 4 °C utan fixering kan leda till cellulär nedbrytning, särskilt nedbrytning av vita blodkroppar. Fixering så snart som möjligt är att föredra. - Överför sputumproverna till ett sterilt 15 ml rör.
- Tillsätt en lika stor volym 4 % paraformaldehyd (PFA) till sputumproverna. Till exempelample, om sputumprovet är 0.5 ml, tillsätt 0.5 ml 4 % PFA. Blanda genom att försiktigt vända upp och ner.
- Inkubera sputum över natten vid 4 °C.
- Tvätta provet genom att tillsätta 5 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till varje 2 ml fast sputum.
OBS: Det krävs ingen centrifugering för detta tvättsteg. - Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett.
OBS: Undvik att suga upp slemmet med pipetten genom att rikta spetsen bort från sputumet och mycket långsamt aspirera bort ytvätskan. Tvättsteget involverar inte centrifugering för att inte störa den strukturella integriteten hos sputumpluggarna. - Upprepa steg 1.6-1.7 två gånger till.
- Återsuspendera pelleten i 2 gånger volymen PBS med 0,01 % (vikt/volym) natriumazid.
- Förvara slemmet vid 4 °C.
2. MiPACT (vävnadsrensningsteknik) bearbetning av sputum
- Avgasa hydrogelkomponenterna (30 % 29:1 akrylamid:bis-akrylamid, härdare och PBS) i en förseglad behållare som innehåller en anaerob förpackning i 72 timmar.
OBS: Den anaeroba förpackningen och den förseglade behållaren är nödvändiga eftersom syre hämmar akrylamidpolymerisation. Alternativt kan syre avlägsnas genom att utföra detta steg i en anaerob huv, genom att applicera ett vakuum på en förseglad behållare eller genom att bubblaN2-gas genom akrylamidblandningen.- Tillsätt 2 ml av en 30-procentig 29:1 akrylamid:bis-akrylamidlösning till ett 15 ml rör med locket av inuti den förseglade anaeroba behållaren.
- Gör en koncentrerad buljong av 10 % (vikt/volym) härdare genom att tillsätta 0,5 g härdare till 5 ml PBS i ett 15 ml rör. Lämna locket av röret och förvara i den förseglade anaeroba behållaren.
- Lämna några ml steril PBS i ett rör, med locket av, inuti den anaeroba behållaren.
- Gör 5 ml hydrogellösning med en slutlig koncentration av 0,2 % härdare och 4 % 29:1 akrylamid:bis-akrylamid i PBS i ett 15 ml rör. Blanda genom invertering och filtersterilisering.
- Ta ut slemproverna ur kylskåpet och skär dem sedan i små bitar (ungefär 5 mm i diameter) under sterila förhållanden med en skalpell.
OBS: Om sputumet är ganska flytande kan detta steg fortfarande utföras, men det krävs ökat tålamod och övning för att ta bort sputum från lagringslösningen med en pincett innan du använder skalpellen för att separera de önskade fraktionerna. - Placera de skurna sputumproverna i en brunn i ett täckglas med 8 kammare.
- Tillsätt 300 μl filtersteriliserad hydrogellösning från steg 2.2 till var och en av brunnarna som innehåller sputum.
- Placera täckglaset med 8 kammare i en förseglad behållare som innehåller en anaerob förpackning i 3 timmar vid 37 °C.
OBS: När hydrogelen med inbäddat sputum har polymer ska den ha samma konsistens som fast gel. - Överför de stelnade hydrogelsputumproverna till ett 15 ml odlingsrör som innehåller 5 ml 8 % natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8, och låt proverna klara i 3-14 dagar vid 37 °C (med eller utan skakning), tills sputumet blir genomskinligt.
OBS: Rensningstiderna beror på sputumsammansättningen och kan i allmänhet minskas med skakning. Var dock noga med att inte öka skakningshastigheten till den grad att provets integritet störs. Mer DNA-rika prover tar längre tid att rensa jämfört med slemrika prover. - Dekantera 8 % SDS-lösningen i en avfallsbehållare. Använd en steril pincett för att överföra varje hydrogelinbäddat prov till ett sterilt 50 ml koniskt rör. Tillsätt 10 ml PBS till vart och ett av de 50 ml koniska rören för att tvätta hydrogelerna och låt lösningen sitta i 30 minuter till 1 timme före dekantering. Upprepa detta 2 gånger till.
OBS: Detta tvättsteg innebär inte centrifugering. Överflödig vätska och supernatant avlägsnas försiktigt med en pipett. - Förvara tvättade prover i PBS med 0,01 % (vikt/volym) natriumazid och 1x RNashämmare vid 4 °C.
3. Hydrogelfluorescerande in situ-hybridiseringsprotokoll (FISH)
- Ta bort hydrogelproverna från förvaringslösningen med en steril pincett och placera proverna på en steril yta (t.ex. en glasskiva eller petriskål).
- Använd en steril skalpell för att skära hydrogelerna i ~ 1 mm tjocka skivor.
- Placera 1 mm sektionerna av hydrogel inuti sterila 1.5 ml rör.
- Förbered 1 ml hybridiseringsbufferten (25 % formamid, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01 % SDS, renad och avjoniserad H2O) i ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt den fluorescerande märkta PseaerA-sonden (150,7 nM12) till hybridiseringsbufferten och blanda genom inversion.
OBS: Formalinlösning bör hållas borta från öppen låga. Hybridiseringsbufferten kan beredas i förväg och lagras i alikvoter vid -20 °C13. - Tillsätt 200–500 μL hybridiseringsbuffert till varje ~1 mm sektion av hydrogel och se till att hela hydrogelprovet är nedsänkt.
- Låt PseaerA-sonden hybridisera med hydrogelproverna genom att placera dem i mörker i ~ 18-24 timmar, vid 46 °C, utan att skaka.
- Dekantera hybridiseringsbufferten i en avfallsuppsamlingsbehållare.
- Skölj samples en gång med filtersteriliserad tvättbuffert (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra) [pH 7.2], 0.01% SDS, och renad och avjoniserad H2O) genom att tillsätta 1 ml tvättbuffert till vart och ett av 1.5 ml rören och ta sedan bort den.
OBS: Tvättbufferten kan göras i förväg och förvaras i rumstemperatur (RT). - Tillsätt 1 ml färsk tvättbuffert till rören och inkubera sedan proverna i mörker i 6 timmar vid 48 °C, utan att skaka.
4. Hydrogel och Psl0096 antikroppsbindning
- Ta bort tvättbufferten sterilt med en 1 ml pipett.
- Skölj proverna med 2 % BSA (vikt/volym) i PBS-lösning genom att tillsätta och ta bort 1 ml av 2 % BSA-lösningen.
- Tillsätt 500 μl av 2 % BSA/PBS-lösningen till hydrogelproverna för att blockera icke-specifik proteinbindning. Inkubera sedan proverna över natten, i mörker, vid RT, utan att skaka.
- Ta bort den blockerande lösningen sterilt med en 1 ml pipett.
- Bered antikroppslösningen Psl0096-Texas Red genom att späda antikroppen till en slutlig koncentration av 0,112 μg/ml i 500 μl färsk 2 % BSA/PBS.
- Tillsätt 500 μL antikroppslösning till hydrogelproverna och inkubera dem vid RT i 6 timmar, skyddade från ljus, utan skakning.
5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenylindol) färgning
- Bered matchningslösningen för brytningsindex (RIMS) genom att tillsätta 40 g gradientmedium med icke-jonisk densitet, 30 μl Tween20, 3 μg natriumazid och 30 ml PBS till en kolv som innehåller en magnetisk omrörare. Rör om lösningen i 15 minuter på en magnetomrörare eller tills den är helt upplöst.
- Sterilisera lösningen i ett 50 ml koniskt rör med en 10 ml spruta och ett sterilt 0,2 μm filter.
OBS: Lösningen kan förvaras vid 4 °C i flera månader. - Ta bort antikroppslösningen Psl0096-Texas Red med en steril 1 ml pipett.
- Skölj hydrogelproverna genom att tillsätta och sedan ta bort 1 ml PBS.
- Inkubera hydrogelproverna med 250 μL RIMS-lösning och 10 μg/ml DAPI vid RT med försiktig skakning, i mörker, över natten.
- Före konfokal avbildning, montera proverna på 0.9 mm eller 1.7 mm perfusionskammare och försegla med ett glastäcke.
OBS: Efter FISH och/eller immunohistokemi och före nedsänkning i RIMS kan fluorescerande lektinfärgning appliceras om visualisering av sputumslem önskas12.
6. Bildbehandling
- Utför konfokal laserskanningsmikroskopiavbildning med standardtekniker vid 25x, 40x, 63x eller 100x förstoringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den övergripande utformningen av experimentet sammanfattas i figur 1 och figur 2. Figur 1 ger en sammanfattning av protokollen för bearbetning av sputum och rensning av sputum. Bearbetning och rensning av sputum kan ta upp till 17 dagar. Protokollet kan dock stoppas och prover kan lagras efter fixering med PFA (dag 2) eller efter vävnadsrensning (dag 5-17 beroende på clearingtid). I figur 2 sammanfattas FISH- och antikroppsbindningsprotokollen. FISH- och antikroppsfärgningsprotokollen tar 4 dagar att slutföra men bör slutföras och konfokala bilder tas när de väl har börjat. Med hjälp av ovanstående protokoll kan högupplösta 3D-bilder av P. aeruginosa-celler erhållas med deras in-situ-struktur i sputum visualiserad.
Rensning av sputum och efterföljande applicering av fluorescerande fläckar som används i detta protokoll möjliggör detaljerad visualisering av P. aeruginosa i proverna. Sputumproverna som visas i figur 3 och figur 4 samlades in från en pediatrisk CF-patient (17 år) med en nydebuterad P. aeruginosa-infektion. I figur 3A sågs ett aggregat av celler i ett sputumprov; Uppkomsten av gulgröna stavar berodde på överlappningen av alla tre fluoroforerna. Även om vi inte har cellantal för detta sputumprov, fann vi att sondenektionsgränsen var 104 celler/ml (se kompletterande figur 1). I figur 3B sågs enskilda stavformer i grönt från den artspecifika bindningen av PseaerA-488-sonden till P. aeruginosa-celler. Antikroppen Psl0096-Texas Red som ses i rött illustrerar var den pseudomonala exopolysackariden var belägen i sputum; I detta fall verkade Psl0096-antikroppen överlappa mestadels med P. aeruginosa-cellerna (Figur 3C). Denna metod möjliggjorde också visualisering av pseudomonala celler i sputum i relation till andra bakterieceller och värdstrukturer. I figur 4 sågs ett kluster av P. aeruginosa-celler fagocytoserade i en eukaryot cell och andra små kockcellskluster observerades i närheten. Det har visats att antikroppen Psl0096 också kan binda till Psl-producerad planktonisk P. aeruginosa (se kompletterande figur 2).
Figur 1: Flödesdiagram som illustrerar sputumbearbetningen och MiPACT-protokollen.
Sammanfattningsvis fixeras sputum innan det bäddas in i en polyakrylamidlösning. När hydrogelen har avlägsnats kan den antingen förvaras vid 4 °C eller användas tillsammans med FISH- och antikroppsbindningsprotokollet. Den här bilden skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Flödesschema som anger fluorescens in situ-hybridisering och antikroppsfärgningsprotokoll.
När sputumet har försvunnit helt i hydrogelmatrisen kan färgningsmetoder tillämpas. Den här bilden skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Immunofluorescensbild av ett sputumprov som tagits från en patient med en tidig P. aeruginosa-infektion inbäddad i en hydrogelmatris.
Hydrogelprovet hybridiserades med en PsearA-Alexa488-sond (grön), en Psl0096-Texas Red-antikropp (röd) och DAPI (blå). (A) sputumprov viewed under alla 3 kanalerna, (B) sputum under endast den gröna kanalen som anger vart PseaerA-488-sonden är bunden, och (C) sputum under endast den röda kanalen där den röda bindningen Psl0096-Texas inträffade. Bilderna togs i 100x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunofluorescensbild av ett sputumprov som tagits från en patient med en tidig P. aeruginosa-infektion inbäddad i en hydrogelmatris.
Hydrogelprovet hybridiserades med en PsearA-Alexa488-sond (grön), en Psl0096-Texas Red-antikropp (röd) och DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Fluorescens in situ hybridisering av en planktonkultur av PAO1 med PseaerA-488-sonden. Klicka här för att ladda ner figuren.
Tilläggsfigur 2: P. aeruginosa färgad med DAPI och antikroppen Psl0096-Texas Red. a) stam PAO1-Δpsl och b) stam PAO1. Klicka här för att ladda ner figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med detta protokoll är att ge en inblick i in-situ organisationen av P. aeruginosa-celler i sputum från CF-patienter. Sputumprover bör förvaras vid 4 °C tills de bearbetas om de inte kan fixeras omedelbart. Det har visats att antalet celler av P. aeruginosa i sputum inte förändras signifikant om de behandlas vid 1 timme, 24 timmar eller 48 timmar när de förvaras vid 4 °C, men om de lämnas vid 25 °C i 24 eller 48 timmar kommer antalet bakterieceller att öka avsevärt till följd av bakterietillväxt14. I denna studie förvarades sputumprover vid 4 °C upp till maximalt 24 timmar efter upphostning. Det bör noteras att inflammatoriska celltal har visat sig minska i sputum om det lämnas vid 4 °C och behandlas mer än 9 timmar senare15. Därför är det viktigt att ta hänsyn till de specifika celler och markörer man vill visualisera i sputum när man bestämmer sig för en stopptid för provbearbetning.
Provbearbetning med denna metod börjar med fixering av sputumprover i 4 % PFA. Paraformaldehyd kommer att tvärbinda bakterieceller och deras extracellulära matris och bevara deras strukturer för mikroskopisk visualisering och analys11,16. Tyvärr, om målet är att få totalt cellantal på vissa inflammatoriska celler i sputum, har PFA visat sig minska antalet av dessa celler, så andra fixeringsmedel bör övervägas17. En annan begränsning med denna studie är att den kan vara tidskrävande och kan ta över två veckor att utföra. Därför kan det vara olämpligt att utveckla den till en diagnostisk metod som kräver tidskänsliga behandlingsbeslut. Dessutom, för att förstå den totala mikrobiella mångfalden i sputumprover, skulle denna metod inte vara lämplig, men skulle kunna paras ihop med andra mikrobiella detektionsmetoder med hög genomströmning, t.ex. qPCR.
Sammansättningen av akrylamidhydrogelen kan ändras beroende på vävnadstyp och applikation11. För instabila prover som CF-sputum är det nödvändigt att ge strukturellt stöd med en 29:1 akrylamid:bis-akrylamidblandning (istället för bara akrylamid). Att inkludera paraformaldehyd i hydrogelen kan ytterligare stabilisera strukturen, med avvägningen av längre inkubationstider för att möjliggöra diffusion av sonder och antikroppar9. Att tillsätta formaldehyd till hydrogelen kan också förhindra vävnadssvullnad under rensningsprocessen om den effekten är oönskad11.
Den nuvarande metoden riktar sig specifikt mot P. aeruginosa-celler i sputum hos CF-patienter. Alternativa metoder och modifieringar av detta protokoll kan övervägas för att vägleda optimering av visualisering av andra bakterier. Genom att tillämpa art- och släktspecifika FISH- och hybridiseringskedjereaktionssonder (HCR) kan andra CF-patogener som Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. och Achromobacter xylosoxidans identifieras12. I vår studie riktade vi in oss på den pseudomonala exopolysackariden Psl. Andra mål, inklusive alginat eller Pel, kan undersökas med fluorescerande antikroppar som är specifika för dessa exopolysackarider i framtida experiment. Att applicera MiPACT-metoden tillsammans med FISH och antikroppsfärgning för CLSM tar ett par veckor att genomföra. Om forskningsfrågan inte berör den 3-dimensionella rumsliga visualiseringen av sputumet finns det snabbare metoder för att visualisera bakterier som finns. Tidigare metoder som använts för att visualisera bakterier i sputumprover använder tunn snittning eller utstrykning och inkluderar: FISH18, Gram-färgning och immunhistokemiska tekniker som applicerar primära antikroppar och motfärgningar för att möjliggöra visualisering av biofilmexopolysackarider och bakterieceller 19,20.
Det finns flera potentiella framtida tillämpningar av dessa typer av avbildningstekniker. Förmågan att visualisera olika bakteriella organismer och deras interaktion med värdceller, såsom fagocyter, kan öka vår förståelse för varför vissa P. aeruginosa-stammar effektivt elimineras från CF-luftvägarna medan andra stammar inte gör det. Avbildningsbakterier i luftvägsprover kan också användas som ett mått på antimikrobiell effekt och som ett studieresultat för nya läkemedel mot biofilm21. Dessutom kan visualisering av det rumsliga förhållandet mellan P. aeruginosa och andra organismer inom CF-lungmikrobiomet, såsom Staphylococcus aureus, bidra till att belysa rollen av co-infektion/kolonisering i patogenesen av lungexacerbationer och deras svar på antibiotikabehandling. In vivo-avbildning av bakterier kan även tillämpas på andra infektioner, inklusive de med ventilatorassocierade lunginflammationer eller kroniska sårinfektioner22. Insikterna kan därmed användas för att vägleda framtida terapeutisk utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Cystic Fibrosis Foundation som tillhandahöll finansiering för denna forskning och MedImmune för deras generösa donation av anti-Psl0096-antikroppar. För denna studie utfördes avbildning vid CAMiLoD-avbildningsanläggningen vid University of Toronto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
