Summary
אנו מספקים פרוטוקול ליצירת מודל עכבר DYT/PARK-ATP1A3 תרופתי Dystonia באמצעות השתלת כנולות לתוך גנגליה בסיסת ומזכרת המחוברים למשאבות אוסמוטיות. אנו מתארים אינדוקציה של תנועות כמו dystonia באמצעות יישום של אתגר מוטורי ואפיון הפנוטיפ באמצעות מערכות ניקוד התנהגותי.
Abstract
מודלים מהונדסים גנטית העכבר להתמודד עם מגבלות, במיוחד כאשר לומדים הפרעות תנועה, שבו רוב המודלים מכרסמים טרנסגנים זמינים אינם מציגים פנוטיפ מוטורי הדומה להיבטים הקליניים של המחלה האנושית. מודלים פרמקולוגיים של עכברים מאפשרים מחקר ישיר יותר של הפתומכניזם והשפעתם על הפנוטיפ ההתנהגותי. משאבות אוסמוטיות המחוברות לתנומות במוח פותחות את האפשרות ליצירת מודלים של עכברים פרמקולוגיים באמצעות אספקת תרופות מקומית וכרונית. עבור הפרעת תנועה תורשתית של דיסטוניה-פרקינסון התחלה מהירה, מוטציה אובדן של פונקציה בα3-subunit של Na+/ K+-ATPase יכול להיות מדומה על ידי מצור ספציפי מאוד באמצעות ouabain גליקוסייד. על מנת לחסום באופן מקומי את α3-subunit בגרגליה בזל המוח הקטן, שהם שני מבני המוח האמין להיות מעורב במידה רבה פתוגנזה של דיאלציה-פרקינסון התחלה מהירה, נולה דו-צדדית מושתל באופן סטריאוטוני לתוך סטריאטום ו cannula יחיד נוסף הוא הציג לתוך המוח הקטן. הקניול מחוברים באמצעות צינורות ויניל לשתי משאבות אוסמוטיות, המושתלות באופן תת עורי על גב בעלי החיים ומאפשרות מסירה כרונית ומדויקת של אובאין. מודל העכבר הפרמקולוגי עבור פקיונות-פרקינסון התחלה מהירה נושא את היתרון הנוסף של סיכום התכונות הקליניות והפתולוגיות של נשאי מוטציה אסימפטומטית וסימפטומטית. בדיוק כמו נשאי מוטציה של פרקינסון דיסטוניה בשלב מהיר, העכברים עם ouabain חדורים לפתח תנועות כמו דיסטוניה רק לאחר חשיפה נוספת ללחץ. אנו מפגינים פרדיגמה קלה של לחץ ומציגים שתי מערכות ניקוד מותאמות להערכת פנוטיפ מוטורי.
Introduction
היתרונות של משלוח סמים רציף ישירות לתוך המוח הם רבים. זריקות חוזרות ונשנות ותכופות, המייצגות גורם מתח מיותר לבעלי חיים, ניתן להימנע וריכוז תוך-מוחי קבוע יותר של התרופה ניתן להשיג. זה תקף במיוחד כאשר תרופות המנוהלות באופן שיטתי להיכשל לחדור בקלות את מחסום מוח הדם. יתר על כן, משלוח תרופות כרוניות באמצעות משאבות אוסמוטי מאפשר משלוח מקומי של מצעים שאחרת היו תופעות לוואי כלל מערכתית. התרופות ניתן להעביר באופן ממוקד למבני המוח הרצויים, ההשפעה וכתוצאה מכך ניתן לעקוב ישירות. זה יכול להיות מנוצל עבור מערך של יישומים, כגון המחקר של השפעות טיפוליות, כמו גם את המחקר של פתוכיכניזם. יישום זה האחרון שימש בפרויקט בזאת על מנת ליצור מודל עכבר תרופתי עבור dystonia.
הניתוח וההבנה של תסמונות דסטוניות, המייצגות את הפרעת התנועה השלישית הנפוצה ביותר, הוגבלו במידה רבה על ידי העובדה כי מודלים גנטיים של בעלי חיים להיכשל במידה רבה לשחזר את פנוטיפ המחלה נמצא אדם חולה, כמו גם את הפתופיזיולוגיה. בעיה זו אינה מוגבלת תסמונות סטיסטון, אבל למעשה נוגע מודלים רבים של מכרסמים טרנסגניים בתחום הפרעות תנועה1,,2. הסיבה להיעדר פנוטיפ במודלים מכרסמים טרנסגנית עשויה להתבסס על מנגנוני פיצוי יעילים מאוד3. במקרה של סטיטוניה, המחלה מאופיינת התכווצויות שרירים לא רצוניות הגורמות לתנועות פיתול ותתנוחה חריגה4. המחקר של סיבות משניות (כלומר, פגיעה מוחית) של סימפטומים סטיבוליים, עזר לזהות את המבנים המעורבים בביטוי של חריגות מוטוריות אלה, כגון גנגליה בסיס5. מחקרי הדמיה מוחית של צורות תורשתיות של דסטוניה הראו חריגות תפקודיות כמעט בכל אזורי המוח האחראים על שליטה מוטורית ושילוב sensorimotor6,7. עם זאת, מודלים מכרסמים עדיין נדרשים כדי להעמיק את ההבנה של תפקוד עצבי ברמת רשת מולקולרית בקנה מידה גדול, כמו גם לפיתוח אפשרויות טיפוליות. זה המקום שבו מודלים עכברים פרמקולוגיים מציעים את האפשרות לשכפל את התכונות הקליניות והפתולוגיות של מחלה באופן מדויק יותר.
דיסטוניה-פרקינסון מהירה (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) היא אחת הצורות התורשתיות של דסטוניה. היא נגרמת על ידי מוטציות אובדן תפקוד בגן ATP1α3, אשר מקודד עבור α3-subunit של Na+/ K+-ATPase8. יתר על כן, הוא מוכר כי נשאים מוטציה גנטית יכול להיות ללא סימפטומים במשך שנים לפני פיתוח חריף של סטיטוניה כללית מתמיד פרקינסון לאחר חשיפה לאירוע מלחיץ. אכן, ההתפכחות של DYT / PARK-ATP1A3 הוא אירועים לא שלמים ומלחיצים הפועלים כטווח טריגר בין לחץ יתר פיזי וטמפרטורות קיצוניות לצריכת יתר של אלכוהול וזיהומים9,,10. על מנת ללמוד DYT / PARK-ATP1A3 ולמצוא התערבויות טיפוליות פוטנציאליות, זה כבר ניסה פעמים רבות לחקות את התפתחות המחלה תלוית מתח במודלים מכרסמים. עם זאת, מלבד אחד גנטי קיים DYT / פארק-ATP1A3 מודל העכבר, שבו תנועות חריגות ארעיות כמו עוויתות היו מושרה על ידי היפותרמיה, כל מודלים העכבר הגנטי שפורסמו עבור DYT / פארק-ATP1A3 לא הצליחו לייצרסימפטומים סימפטומים סימפטומים סימפטומים סימפטומים 1,,11,12. קלדרון ואח ' הוכיח בעבר כי חסימת α3-subunit דו-צדדי בגרגליה בסיס המוח הקטן באמצעות ouabain גליקוסייד הלב בעכברים מסוג פראי גורמת הפרעה הליכהקלה 13. החשיפה הנוספת לזעזועים ברגליים חשמליות בסביבה חמה הובילה לפנוטיפ דיסטוניק ובריידיקינטי, ובכך הוכיחה כי התזת אוובין כרונית וממועדת ולאחריה מתח מחקה בהצלחה את הפנוטיפ DYT/PARK-ATP1A3.
עם זאת, חשיפת בעלי חיים לזעזועים ברגליים חשמליות בסביבה חמה של 38-40 °C על פני שעתיים של תקופה גורם כאב וחרדה בבעלי חיים, המייצגים גורמים מבלבלים, במיוחד להערכת שינויים במערכת catecholamine הקשורים להתפתחות של דסטוניה. לכן, אנו מתארים בזאת סוג אחר של פרדיגמת מתח עם ערך תרגום גבוה, אשר מתייחס בחזרה לעובדה כי פעילות גופנית קלה עד מתונה תוארו כגורמים בחולים DYT/PARK-ATP1A39. יתר על כן, פעילות גופנית חוזרת היא טריגר ידוע עבור דיסטוניה מוקד14. עכברים היו נתונים שוב ושוב משימות מוטוריות מאתגרות המורכבות משלושה צאצאים של מוט עץ ("מבחן מוט") ושלוש ריצות על שולחן רוטארוד ("מבחן ביצועים Rotarod"). מיקום בעלי חיים על גבי מוט עץ 50 ס"מ שימש כדי לאלץ את בעלי החיים לרדת, מערכת Rotarod הועסק לחשוף עכברים לפעילות כפויה על ידי הצבתם על מוט מסתובב.
האפיון של פנוטיפ המנוע של מודל עכבר עבור dystonia הוא מאתגר במיוחד בשל היעדר בדיקות מוגדרות מראש ציונים. עם זאת, וריאציה אחת של הערכת נכות מוטורית שימשה שוב ושוב בשנים האחרונות על מנת להעריך את חומרת והפצה של תנועות כמו dystonia מכרסמים13,15,16. אנו מציגים בזאת גרסה שונה של סולם הדירוג dystonia, אשר הוכיח להיות יעיל בהערכת פנוטיפ כמו סטיטוניה של בעלי חיים כאשר נצפה על פני פרק זמן של ארבע דקות. כשיטה שנייה להערכת תנועות כמו דם, אנו מציגים מערכת ניקוד חדשה שפותחה להערכת תנועות חריגות במהלך בדיקת השעיית זנב. זה מאפשר הערכה של התדירות ומשך של תנועות כמו סטיטוניה ותקורות של הגפיים הקדמיות, הגפיים האחוריות, כמו גם תא המטען.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הבינלאומיות, הלאומיות ו/או המוסדיות החלות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. הרשויות המקומיות בRegierung von Unterfranken, וירצבורג, גרמניה, אישרו את כל הניסויים בבעלי חיים.
1. גימינג של משאבות אוסמוטיות
הערה: שלב זה צריך להתבצע לפחות 48 שעות לפני הניתוח. משאבות אוסמוטיות ALZET צריך להיות ממולא מראש על מנת להבטיח כי קצב השאיבה מגיע למצב יציב לפני ההשתלה.
- הכינו מראש את הפתרון הרצוי לתחלה כרונית. ודא שהממס והסוכן תואמים למשאבות אוסמוטיות ו לצנתרים. עבור הפרויקט במסמך זה, להפשיר פתרון מלאי 10x של ouabain (מאוחסן ב -20 ° C) בטמפרטורת החדר ומערבולת עבור 10 s.
התראה: Ouabain הוא רעיל: זה צריך להיות מטופל רק עם כפפות ונפתח רק תחת מכסה המנוע סטרילי כדי למנוע שאיפה. - הפעל את מכסה המנוע הסטרילי; חיטו את מכסה המנוע, כמו גם את כל המכשירים ו החומר הדרושים לפני שהם שמים אותם מתחת למכסה המנוע.
- לשים כפפות כירורגיות לפני טיפול משאבות osmotic. הכן בנפרד את תמיסת האובאין המיועדת למשאבות של סטריאטום והמורחם.
הערה: יש להכפיל את ריכוז הפתרון במשאבה עבור סטריאטום בהשוואה לריכוז הפתרון במשאבה המיועדת המוח הקטן. זאת בשל העובדה כי המשאבה עבור סטריאטום מחובר תנובה כפולה, קצב הזרימה, עם זאת, זהה למשאבה של המוח הקטן, אשר מחובר לכנולה אחת. - חשב את כמות הפתרון הדרושה באמצעות הנוסחה הבאה:
שיעור משלוח המוני (ko)= שיעור מסירת נפח (Q) x ריכוז של הסוכן ברכב (Cd)
בפרויקט הנוכחי, המשאבות האוסמוטיות היו מוכנות ומלאות בתמיסת אובאין בריכוז של 11.2 ng/h או 0.9% תמיסת מלח עבור קבוצת הביקורת. - מערבולת הן פתרונות ouabain עבור 10 s ומסנן סטרילי (כלומר, 0.22 μm מזרק-קצה מסנן) אותם נפרד, צינורות microcentrifuge חדש, באמצעות מסנן שונה עבור כל פתרון.
- שקלו את המשאבות האוסמוטיות הריקות יחד עם מנחה הזרימה (כ-0.4 גרם).
- מלא מזרק 1 מ"ל עם 27 G מילוי cannula (רצוי עם קצה בוטה) עם סטרילי מסונן ouabain-פתרון או פתרון רכב.
- להוציא את כל בועות האוויר מהמזרק, להחזיק את המשאבה osmotic במצב זקוף, להכניס את הנולה כל הדרך לתוך המשאבה ולאט למלא את המאגר עד פתרון עודף מופיע על גבי (להימנע מילוי מהיר כמו זה יכול להוביל בועות אוויר במשאבה). לאחר מכן, הכנס את מנחה הזרימה למשאבה (פתרון עודף אמור להופיע למעלה).
- משוך את מנחה הזרימה החוצה (כ-5 מ"מ), הוריד בזהירות את האוגן הלבן עם מספריים וחבר חתיכת צינורות ויניל למנחה הזרימה. ודא כי הצנתר יש אורך של כ 2 ס"מ כדי לאפשר ניידות נאותה של בעל החיים.
- שקול את המשאבה אוסמוטית מלאה פעם נוספת כדי להבטיח כי ההבדל במשקל בין משאבה מלאה וריקה הוא קונקורד עם המשקל הצפוי של הפתרון טעון.
הערה: עבור רוב הפתרונות המשכריים משקל זה שווה לנפח במיקרוליטרים. אם המשקל אינו תואם לנפח הצפוי, האוויר עשוי להיות לכוד בתוך המשאבה, אשר יש לרוקן ולמלא מחדש. - עבור התגנדרות המשאבות, להכין שני 2 mL microcentrifuge צינורות, צינור אחד עבור סטריאטום ואחד עבור המוח הקטן.
- לשקוע את המשאבות לתוך צינורות microcentrifuge מלא באמצע עם תמיסת מלח 0.9%. אל תשקוע בקצה הפתוח של הצנתר. לשים את צינורות microcentrifuge לתוך תרמוצ'יקלר במשך 48 שעות ב 37 ° C על מנת להבטיח כי המשאבה הגיעה קצב שאיבה יציב לפני ההשתלה ואת הצנתרים ממולאים מראש.
2. השתלת נולה ומשאבת אוסמוטי
- מקם את העכבר (זכר, C57Bl/6N, 11-12 שבועות של גיל) לתוך תא המיועד להרדמה בשאיפה; הגדר את קצב הזרימה של isoflurane ל 2-3% ואת קצב הזרימה של חמצן ל 2 L/min.
- לאחר שהעכבר מרדים עמוקות על פי הפרוטוקולים המאושרים, לגלח את החלק העליון של הראש של בעל החיים, צוואר הגב ואת שליש הפרוקסימלי של הגב.
- מניחים את החיה במסגרת סטריאוטיפית וממשיכים בהרדמה עם isoflurane באמצעות מסכת הרדמה של העכבר המיועדת לכלי הסטריאוטיפי (קצב זרימת isoflurane 1.5-2%, 2 L/min oxygen).
- באמצעות קצוות גומי או חטיפי אוזניים שאינם נקרעים, לתקן את הראש של בעל החיים במסגרת הסטריאוטיפית, טיפול כי הראש הוא מאוזן.
- על מנת למנוע היפותרמיה, מניחים משטח חימום מתחת לחיה, הכנס בדיקה בטמפרטורה פי הטבעת והגדר את הטמפרטורה ל-37°C. להגן על העיניים של בעל החיים מפני התייבשות באמצעות טיפה של משחה אופטלמית על כל עין.
- למרוח משכך כאבים, כגון Carprofen (5 מ"ג / ק"ג משקל גוף), תת עורית לפני תחילת הניתוח.
- עם מזרק תת עורי להזריק עד 0.2 מ"ל של bupivacaine 0.25% ולחכות 30 s להרדמה המקומית להשפיע.
- חיטו את האזורים המגולחים ביסודיות עם חומר חיטוי, כגון דיהידרוצ'ולוריד אוקטונידין.
- לאחר חיטוי יסודי של האזור הכירורגי, השתמשו באזמל כדי למקם חתך בראש ולהשתמש במספריים כדי להמשיך את החתך עד הגפיים העליונות. לחשוף את הגולגולת בעזרת מהדקי בולדוג ולנגב את periosteum עם אפליקטור כותנה סטרילית קצה.
- ליישר עט או קצה של נולה מוכתמת דיו שחור עם bregma ולהשתמש בקואורדינטות המתאימות כדי לסמן את שלוש נקודות הכניסה עבור נואלות המוח על הגולגולת (קואורדינטות עבור החורים הדו-צדדיים הדרושים עבור זבירה של הגרעיניה בזל: קדמי / אחורי: + 0.74 מ"מ, medial/רוחבי: +/- 1.50 מ"מ (+ המציין את הצד הימני, - הצד השמאלי יחסית bregma); קואורדינטות עבור החור בקו האמצע של המוח הקטן: קדמי / אחורי: - 6.90 מ"מ). לאחר מכן, לקדוח בזהירות את החורים עבור הנולה הכפולה המיועדת לגרגליה הבזלית ואת הנולה היחידה המיועדת המוחהקטן (איור 1A).
- לקדוח חור רביעי לבורג קטן בין סטריאטום המוח הקטן. בורג זה בסופו של דבר יהיה מוטבע במלט שיניים ולספק אחיזה נוספת עבור cannulas. באמצעות משקולות עדינות ונהג ברגים, בזהירות להכניס את הבורג לתוך החור הקטן עד שהוא קבוע היטב בגולגולת. אל תשתיל את הבורג עמוק מדי כמו זה פוגע ברקמת המוח.
הערה: מומלץ להמשיך עם השתלת משאבת אוסמוטי לפני הכנסת האנולות אוסמוטיות. כך נמנעת מגרימת נזק מקרי לקנולות בעת השתלת המשאבות. - על מנת ליצור כיס קטן עבור המשאבה osmotic בכל צד של בעלי החיים בחזרה, להשתמש מרטפים רקמה כדי להפריד את שכבות הרקמה התת עורית. מקדמים את המגרסה לעבר רגל שנייה אחת ופתחו מעט את המגרסה כדי להרחיב את הכיס התת עורי. חזור על אותו הליך עבור הצד השני, תחילה הסרת המפס מהחתך ולאחר מכן דוחף אותם בעדינות לכיוון הרגל האחורית השנייה.
הערה: הכיס אמור לאפשר למשאבה להחליק בקלות פנימה, עם זאת, זה לא צריך להיות יותר מדי מקום לנוע מתחת לעור. - בעזרת ממחץ רקמות לקחת את המשאבה הראשונה יחד עם פיסת הצינורות המחוברת ולהחליק אותו לתוך כיס תת עורי אחד. חזור על אותו הליך עם המשאבה השנייה.
- באמצעות מחזיק מיני-אבעת, הציגו קנולה אוסמוטית אחת עם אורך מותאם אישית של 3.0 מ"מ לתוך החור שנקדח בקו האמצע של המוח הקטן. נתקו את ראש המנה בזהירות ותקןו את המנה, כמו גם את הבורג הקטן עם המלט הדנטלי, ותדאגו לא לכסות את החלק המחבר לצינורות של המשאבה האוסמוטית. ודא כי המלט שיניים המקיפים את הנולה התייבש באופן מלא לפני שתמשיך עם הניתוח.
- לפני הכנסת צינורית כפולה עם מרחק מרכז למרכז של 3.0 מ"מ ואורך מותאם אישית של 4.0 מ"מ לתוך החורים שנקדחו דו-צדדי מעל גנגליה בסיס, לצרף שתי חתיכות קצרות של צינורות ויניל (0.5 ס"מ) לשתי חתיכות חיבור של הנולית הכפולה. חבר את צינורות הויניל עם מתאם bifurcation ולמיין בזהירות את כל מערכת הצינורות כולל מתאם ו cannula עם תמיסת ouabain או רכב (טמפרטורת החדר, סטרילי מסונן מראש). ניתן לעשות זאת בצורה הטובה ביותר עם מזרק 1 מ"ל ו- 27 G מילוי cannula הציג לתוך הקצה האחורי יחיד של מתאם bifurcation(איור 1B).
- בעזרת מחזיק מיני-אאמפ, הכנס בזהירות את הקנולה הכפולה לחורים הדו-צדדיים. השתמש במלחציים כדי לנתק את ראש המנה ולתקן את המנה הכפולה עם מלט דנטלי.
- חבר את הצנתרים של המשאבות האוסמוטיות אל מתאם הדו-פוררציה, כמו גם את הקנולה היחידה, בהתאמה. ודא כי הצנתרים יש אחיזה חזקה על החלקים המחברים של הקאנולס.
הערה: לשתי המשאבות יש קצב זרימה שווה, לכן היזהרו לחבר את המשאבה האוסמוטית עם הפתרון המרוכז הכפול לבין מתאם הדו-פורציה כדי להבטיח שאותו ריכוז יגיע הן לגרגליה הביסלית והן למזכרת. - סגור את החתך על גב בעלי החיים עם תפרים ככל האפשר בכיוון הגולגולת, נזהר לא לתפור את העור(איור 1C).
- תת עור להזריק 0.5 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח, אשר צריך להיות טמפרטורת הגוף, לתוך קיפול העור בכל צד של הגב של בעלי החיים על מנת למנוע התייבשות של העכברים, בזהירות הימנעות המשאבות.
3. אתגר מוטורי
- נושא אובאין- או עכברים סוטה רכב משימות מוטוריות מאתגרות כצורה של חשיפה מתח מתון 4 שעות לאחר הניתוח וחוזר על עצמו כל 24 שעות לאחר מכן על מנת לגרום לתנועות כמו דיסטוניה. פעולה זו אינה כוללת אפיון התנהגותי; מטרתו היא לגרום לרמת מתח גבוהה יותר בהשוואה לשמירה רגילה בכלוב.
- מניחים את העכבר על מוט עץ מחוספס בקוטר 1 ס"מ, הפונה כלפי מטה. ודא כי המוט ממוקם לתוך כלוב גדול עם מספיק מצעים במקרה של נפילות. אין צורך למדוד את זמן הירידה, אך חפשו היפר-לחץ בלתי רצוני של גפיים קדמיות וגפיים אחוריות שהוצגו על ידי בעלי חיים סוטה אוובין בעת היורדת של המוט. תן לעכברים לרדת על העמוד שלוש פעמים ולאפשר 2 דקות של התאוששות בין היורדים.
הערה: עכברים סוטה Ouabain צריך להציג תסמינים ראשונים כמו bradykinesia 4 שעות לאחר הניתוח. עם זאת, 24 שעות לאחר הניתוח עכברים צריכים להתחיל להציג היפר-לחץ בלתי רצוני של הגפיים הקדמיות והגפיים האחוריות כסימן לתנועות כמו סטיטוניה במהלך הירידה. - למשימה המוטורית השנייה, מקם עכברים על המוט המסתובב כפי שנעשה עבור בדיקת הביצועים Rotarod. מנגנון Rotarod אינו משמש כמדד של ההיהיה ליפול, המטרה היא לחשוף עכברים לפעילות כפויה. מניחים את העכברים על המוט המסתובב שלוש פעמים ואפשרו 2 דקות של התאוששות בין הבדיקות.
הערה: כדי להגביר את החשיפה ללחץ, השתמש במנגנון רוטארו מואץ. עבור הפרויקט המתואר בזאת, המוט מאיץ מ-5 ל-50 סל"ד על פני פרק זמן מוגדר של 300 שניות. - תנו לבעלי חיים להתאושש במשך 30 דקות בין מבחן המוט למבחן הביצועים של Rotarod ושוב עוד 30 דקות לפני הניקוד עבור תנועות כמו דסטוניה כמתואר תחת פרוטוקול שלב 4. בין חשיפות הלחץ החוזרות ונשנות, לאפשר לעכברים להתאושש במשך 24 h-מרווחי.
4. מערכות ניקוד להערכת תנועות כמו סטיטוניה
הערה: יש לעוור את הנסוי להקצאה הקבוצתית שנותחה כדי למנוע הטיה. הבדיקות ההתנהגותיות המשמשות לאפיון הפנוטיפ של העכברים הן שתי מערכות ניקוד: סולם דירוג dystonia ציון חריג, תנועות כמו סטיטוניה וציון התנהגותי באמצעות מבחן מתלה זנב. להעריך את התנועות כמו סטיטוניה לאחר זמן התאוששות של 30 דקות לאחר החשיפה ללחץ קל.
- סולם דירוג Dystonia
הערה: בשל היעדר משימות התנהגותיות מוגדרות מראש, סולם הדירוג dystonia הוקם כמערכת ניקוד מבוססת משקיפים בדומה לסאזמי הדירוג הקליניים של סטיטוניה אנושית. זוהי גרסה שונה של סולם הדירוג dystonia בשימוש על ידי קלדרון ואח'13.- תנוחה שיא וההיכות של בעלי חיים על פני תקופה של 4 דקות לאחר בעלי חיים הונחו בקופסת פלסטיק או עץ.
- ציון עבור תדירות והפצה של תנועות כמו dystonia מ 0 עד 4 נקודות: (0) התנהגות מוטורית נורמלית; (1) התנהגות מוטורית חריגה, ללא תנועות כמו דם; (2) פגיעה מוטורית קלה עם תנועות דיסטוניה ממוחשבות קלות; (3) פגיעה מוטורית מתונה עם תנועות דיסטוניה חמורות; (4) ליקוי חמור, עם תנועות מתמשכות, כמו דם כללי (איור 2). שקול את התנועות או התנוחות הבאות כמו דיאלסטיה: לחץ יתר של הגפיים הקדמיות, עמדה רחבה או יתר לחץ דם של הגפיים האחוריות, כמו גם kyphosis. שקול dystonia כמו מוקד במקרה חלק גוף אחד מושפע, כפי שהוכלל במקרה תא המטען ולפחות שני חלקי גוף אחרים מושפעים.
- בדיקת מתלה זנב
הערה: מבחן מתלה הזנב משמש לעתים קרובות כדי להתבונן וציון עבור אבזם אחורי. עם זאת, זהו פנוטיפ מאוד לא ספציפי המציין פגיעה מוטורית. הפרוטוקול הבא מציע מערכת ניקוד ספציפית עבור תנועות כמו dystonia. בשל הכללה של dystonia בחולים DYT / פארק-ATP1A3, תנועות כמו סטיטוניה יש להעריך בגפיים הקדמיות, גזע ו אחוריים. פותחה מערכת ניקוד חדשה מ-0-8 נקודות, ציון כולל < 2 הצביע על כך שלא היו תנועות כמו סטיטוניה(איור 3).- להרים את העכבר על ידי הזנב ליד הבסיס שלה ולהרים את החיה. להקליט וידאו 2 דקות של מבחן מתלה זנב ולהקצות ציון לאחר מכן, ניתוח יסודי של ההקלטה.
- ציון הגפיים הקדמיות מ 0 עד 4 נקודות, שבו חזר או ממושך של נסיגה טוניק של אחד או שני הגפיים הקדמיות, כמו גם יתר בשילוב עם חציית הגפיים הקדמיות, סווגו כמו סטיטוניה כמו: (0) אין תנועות חריגות; (1) תנועה מופחתת של הגפיים הקדמיות עם יתר של כפות הרגליים לראות - 50% מהזמן המוקלט; (2) תנועות מתונות כמו סטיטוניה של גפיים קדמיות < 50% מהזמן המתוקלט; (3) תנועות מתונות כמו לחץ דרך של גפיים קדמיות - 50% מהזמן המתוקלט או החמור < 50% מהזמן המתוקלט; (4) תנועות חמורות כמו סטיטוניה של גפיים קדמיות - 50% מהזמן שנרשם.
הערה: הידבקות Hindlimb היא תנועה חריגה כי לא צריך להיות הבקיע כמו סטיטוניה. - ציון האחורי מ 0 עד 3 נקודות, שם נסיגה והתכווצות של הגפיים האחוריות, כמו גם היפר-לחץ ממושך הוערכו כמו סטיטוניה כמו: (0) אין תנועות חריגות; (1) תנועה מופחתת של אחוריים עם יתר של כפות לראות - 50% מהזמן המוקלט; (2) תנועות כמו סטיטוניה של אחורי אחד; (3) תנועות כמו סטיטוניה של שני ההתפרעויות האחוריות.
- במקרה של עיוות truncal > 80% מהזמן שהוקלט, נקודה נוספת נוספת מתווספת לציון.
- תחזור לחיה לכלוב שלה.
Representative Results
איור 4 שונה מרושנברגר ואח'17. לניתוח נתונים הן של סולם הדירוג של סטיטוניה(A)והן של בדיקת מתליהזנב( B ), חשב את הציון הכולל עבור כל נקודת זמן עבור כל בעל חיים. יש להתוות את הצבע של כל נקודת זמן וכל קבוצה בגרף מתאים. יש לחקור את התפלגות הערכים ויש להחיל את הבדיקה הסטטיסטית המתאימה כדי לקבוע משמעות. עם מספר מספיק של בעלי חיים, פנוטיפ מוטורי ניתן לזהות הן עם סולם דירוג dystonia, כמו גם עם הערכה של תנועות חריגות במבחן מתלה זנב. הפנוטיפ כמו דיסטוניה מדגים על ידי הציון המוטורי גבוה באופן משמעותי בשתי ההערכות בקבוצה ouabain סוטה, הדגיש בהשוואה לעכברים ouabain, לא לחוץ, כמו גם עכברי הבקרה.
איור 1: השלבים הכירורגיים העיקריים להשתלת נוולה ומשאבת אוסמוטי. (א)עבור הקואורדינטות שצוינו, יש לקדוח חורים דו-צדדיים עבור הנולה הכפולה המיועדת לגרנליה הבזלית ולצינולה היחידה הממוקמת בקו האמצע של המוח הקטן. שתי המשאבות האוסמוטיות הבנויות במלואן מוצגות בכל צד של החיה. (ב)התמונה מראה נולית מושתלת, יחיד לתוך המוח הקטן, קבוע עם מלט שיניים. הנולה הכפולה של הגנגליה הבזלית צריכה להיות מחוברת למאמת הדו-פורציה ולהתמלא מראש באובאין לפני ההשתלה. תמונהשלההליך המוגמר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הערכת תנועות כמו סטיטוניה עם סולם דירוג סטיטוניה. במהלך וידאו 4 דקות, תנועות כמו dystonia קיבלו ציון בהתבסס על התפלגות הגוף ומשך. לחץ יתר לא רצוני של הגפיים הקדמיות, עמדה רחבה או יתר לחץ דם של אחוריים, כמו גם kyphosis דורגו כמו דיסטוניה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הערכת תנועות כמו דם במהלך בדיקת השעיית זנב. מערכת הניקוד החדשה שפותחה עבור תנועות חריגות במהלך מבחן מתלה זנב 2 דקות מעריך תנועות כמו סטיטוניה בגפיים הקדמיות, הגפיים האחוריות ותא המטען מ 0-8 נקודות בסך הכל. עבור הגפיים הקדמיות, יתר לחץ דם וחוצה את הגפיים הקדמיות, כמו גם כיפוף טוניק לכיוון תא המטען מוסמך כמו סטיטוניה. עבור האחוריים הארכת יתר לא רצונית, כמו גם נסיגה עם הארכה מעל קו האמצע הובקע כמו דיסטוניה. עיוות של יותר מ-80% מהזמן שהוקלט הובקע בנקודה אחת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: גרפים מייצגים של סולם דירוג ההסטוניה ומבחן השעיית הזנב. (א)הגרף מתאר את סולם הדירוג של דיסטוניה עבור עכברים מנוטרפים ב-NaCl (קו שחור מנוקד), עכברים מנוקבים, לא לחוצים (קו כתום מנוקד) ועכברים סתומים ולחוץ (קו כחול כהה). עבור כל נקודת זמן, מוצגים ערכי ממוצע ± שגיאה סטנדרטית של ממוצע (SEM). (ב)הדיאגרמה מציגה את ההערכה של תנועות חריגות במהלך בדיקת מתלים זנב של 2 דקות עבור עכברים מנוטרלים, הדגיש NaCl (קו שחור מנוקד), עכברים מנוקבים, לא לחוץ (קו כתום מנוקד) ועכברים מנוקבים, לחוץ (קו כחול כהה). ניתוח סטטיסטי נעשה עבור סולם הדירוג של סטטיסטיקה ומבחן השעיית הזנב באמצעות מבחן מאן-וויטני הדו-זנב. תיקון Bonferroni-Holm (§) של ערכי p הראה הבדל משמעותי עבור התקופה התצפיתית של 72 שעות. כחול כהה * מציין הבדלים משמעותיים בין עכברים מנומנם, עכברים לחוצים ועכברים מנומנם, לא לחוץ, שחור * לציין הבדלים משמעותיים בין עכברים מנוטרלים NaCl, עכברים הדגיש ועכברים ouabain,לחוץ, כמו גם בין NaCl-perfused, עכברים לחוצים ועכברים סוטה ouabain, לא לחוץ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
מודל זה של העכבר הפרמקולוגי DYT/PARK-ATP1A3 מאפשר ניתוח מפורט של שינויים מבניים ונוירוכימיים תוך-מוחיים המושרה אך ורק על ידי עיכוב משאבת יון נתרן-אשלגן בגנגליה ובמשבר הקטן, כמו גם שינויים הקשורים לחשיפה ללחץ. במקרה של עכברים, מקסימום של שתי משאבות אוסמוטיות ניתן להשתיל תת עורית. אנו מציגים בכאן שיטה המפרטת משלוח תרופות כרוניות למבני מוח מרובים על ידי יישום נוולה כפולה המחוברת למתאם bifurcation בנוסף למנולה אחת. מתודולוגיה זו יכולה לשמש עבור כל יישום הדורש מבני מוח מרובים להיות סוטה בו זמנית וכרונית.
אנו מציגים מודל עכבר של הפרעת תנועה נדירה, שבה חולים מפתחים תסמינים קבועים לאחר חשיפה ללחץ. אינטראקציה גנטית-סביבתית זו משוערת עדיין אינה מובנת היטב, אך עשויה לייצג את אחת הפתוכינות המרכזיות בפיתוח DYT/PARK-ATP1A3. בעבר פורסמו שיטות שונות לחשיפת עכברים ללחץ וכוללות מכות רגליים חשמליות, ריסון, סביבה קרה אוחמה וחשיפה לריחות שונים 11,12,,13. במאמץ לחשוף עכברים לגורם מתח מתון עם ערך תרגום, אנו מתארים בכאן את סובייקטיביות חוזרת של עכברים משימות מוטוריות מאתגרות. למבחן הקוטב, בעלי חיים סוטה ouabain גילה הגזמה בלתי רצונית של הגפיים הקדמיות וגפיים אחוריות. תנועות אלה היו דומות מאוד לתנועות כמו דיסטוניה שנצפו במהלך הקלטת וידאו של 4 דקות של בעלי החיים, כמו גם את מבחן השעיית הזנב. היישום של מתח מתון בצורה של משימות מוטוריות מאתגרות עשוי להוכיח שימושי במודלים אחרים של עכבר מראה סימפטומים מוטוריים או ניוון עצבי, שבו אינטראקציות גנים-סביבתיים להשפיע באופן מסיבי על מידת התקדמות המחלה.
יש חוסר כללי של משימות התנהגותיות מוגדרות מראש, כמו גם סולמות דירוג כדי לסווג תנועות ותנונות חריגות בעכברים. רוב המשימות המוטוריות הזמינות חושפות חריגות לא ספציפיות, כגון אבזם אחורי, שהיא תופעה ידועה במודלים רבים של עכברים של הפרעות תנועה עם ניווןעצבי 18,19. עבור האפיון הנכון של פנוטיפ, עם זאת יש צורך לנתח אם מודל העכבר מסכם את התכונות הבולטות של המחלה. בזאת, אנו מציגים את הגירסה שונה של סולם דירוג dystonia בשימוש בעבר להערכת נכות מוטורית במודלים עכבר dystonia15,16. בנוסף פיתחנו מערכת ניקוד מבוססת משקיפים למבחן מתלי הזנב, אשר הוקמה באופן דומה לס scales הדירוג הקליני של סטיטוניה אנושית. שני סולמות הדירוג מראים ציון גבוה משמעותית בעכברים סוטה, הדגיש בהשוואה ouabain סוטה, בעלי חיים לא לחוץ, כמו גם בעלי חיים סוטה רכב. החסרונות של כל מערכת ניקוד מבוססת משקיפים הם ההכשרה הנדרשת של raters כדי להבטיח ניקוד עקבי כדי להפחית את השונות הצופה, כמו גם את הסכנה של הטיה אפשרית של rater אם לא עיוור באופן מלא לקבוצה ניתח. עם זאת, מערכות ניקוד מבוססות משקיפים עדיין מציגות שיטה נגישה לאפיון פנוטיפ וניתן להתאים אותה למודל העכבר שנותח, כפי שנעשה בפרויקט הנוכחי להערכת תנועות כמו דיסטוניה. כדי להבטיח ניקוד עקבי בקרב מדרגים שונים, יש להפוך את סרטוני ההדרכה לזמינים. כדי להפחית כל הטיה פוטנציאלית, מומלץ כי raters שונים ציון אותם קטעי וידאו, כי הציונים בודדים הם בממוצע. שתי מערכות הניקוד המוזכרות בעבודה זו רשומות את הנוכחות של תנועות דמויות סטיטוניה בבעלי חיים. מאזני הדירוג ניתן להתאים על פי הדרישות הספציפיות בתוך פרויקט, כפי שנעשה בעבר על ידי IP ואח ', שם רק האחוריים הובקעו עבור תנועות כמו סטיטוניה במודל עכבר עבור dystonia 1 (DYT-TOR1A)20. ניתן להשלים את מאזני הדירוג על ידי מערכות ניקוד אחרות שפורסמו בעבר, מתוך הערכה למשל את מידת בריידיקינטיה מכרסמים כפי שנעשה עם ציון נכות הקטר על ידי קלדרון ואח '13.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך והמחקר הפדרלי (BMBF DysTract ל-C.W.I. ) ועל ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) באוניברסיטת וירצבורג (Z2-CSP3 ל-L.R.). המחברים מודים ללואיזה פריס, קאלי רוהם, ורוניקה סנגר והיקה מנזל ועל עזרתם הטכנית, כמו גם על הלגה ברונר לטיפול בבעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
