Summary
نحن نقدم بروتوكولا لتوليد DYT الدوائية / بارك ATP1A3 نموذج الماوس خلل التوتر عن طريق زرع cannulas في العقد القاعدية والمخيخ متصلة مضخات التناضح. نحن وصف التعريفي من حركات مثل خلل التوتر عن طريق تطبيق التحدي الحركي وتوصيف النمط الظاهري عبر أنظمة التهديف السلوكية.
Abstract
تواجه نماذج الماوس المعدلة وراثياً قيوداً، خاصة عند دراسة اضطرابات الحركة، حيث لا تقدم معظم نماذج القوارض المعدلة وراثياً المتاحة نمطاً ظاهرياً محركياً يشبه الجوانب السريرية للمرض البشري. تسمح نماذج الماوس الدوائية بإجراء دراسة أكثر مباشرة للالكوام وتأثيرها على النمط الظاهري السلوكي. مضخات التناضح المتصلة cannulas الدماغ فتح إمكانية إنشاء نماذج الماوس الدوائية عن طريق تسليم المخدرات المحلية والمزمنة. لاضطراب الحركة الوراثية من خلل التوتر السريع الظهور- باركنسونية، والطفرة فقدان وظيفة في الوحدة الفرعية α3 من Na+/ K+-ATPase يمكن محاكاة من قبل حصار محدد للغاية عن طريق ouabain جليكوسايد. من أجل منع محليا α3-subunit في ganglia القاعدية والمخبل المخيخ، والتي هي اثنين من هياكل الدماغ يعتقد أن تشارك بشكل كبير في التسبب في خلل التوتر السريع بداية باركنسونيا، كانولا ثنائية هو زرع stereotaxically في المخطط ويتم إدخال cannula واحد إضافي في المخيخ. ترتبط الكانولاات عبر أنابيب الفينيل إلى مضختين نُمويتين ، يتم زرعهما تحت الجلد على ظهر الحيوانات وتسمحان بتوصيل الوابين بشكل مزمن ودقيق. نموذج الماوس الدوائية لخلل التوتر السريع الظهور-باركنسونيا يحمل ميزة إضافية من تلخيص الميزات السريرية والمرضية من ناقلات الطفرات أعراض وأعراض. تماما مثل ناقلات الطفرات من مرض باركنسونيونيا سريع الظهور، الفئران أوابين pertoned تطوير حركات مثل خلل التوتر فقط بعد التعرض إضافية للإجهاد. نحن نبرهن على نموذج الإجهاد المعتدل وإدخال اثنين من أنظمة التهديف المعدلة لتقييم النمط الظاهري المحرك.
Introduction
مزايا تسليم المخدرات المستمر مباشرة إلى الدماغ عديدة. يمكن تجنب الحقن المتكرر والمتكرر ، الذي يمثل عامل إجهاد غير ضروري للحيوانات ، ويمكن تحقيق تركيز داخلي أكثر ثباتًا للدواء. هذا صحيح خاصة عندما تفشل الأدوية تدار بشكل نظامي لاختراق بسهولة حاجز الدم في الدماغ. وعلاوة على ذلك، تسليم الأدوية المزمنة عن طريق مضخات التناضح يسمح للتسليم المترجمة من ركائز التي لولا ذلك سيكون لها آثار جانبية على نطاق المنظومة. يمكن تسليم الأدوية بطريقة مستهدفة إلى هياكل الدماغ المطلوبة ، وبالتالي يمكن تتبع التأثير الناتج مباشرة. ويمكن استخدام هذا لمجموعة من التطبيقات، مثل دراسة الآثار العلاجية، فضلا عن دراسة الميكانيكا الباثومية. تم استخدام هذا التطبيق الأخير في المشروع هنا من أجل إنشاء نموذج الماوس الدوائية لخلل التوتر.
تحليل وفهم المتلازمات خلل التوتر، والتي تمثل ثالث أكثر اضطراب الحركة شيوعا، وقد تم محدودة بشدة من حقيقة أن نماذج الحيوانات الوراثية تفشل إلى حد كبير في إعادة إنتاج النمط الظاهري للمرض وجدت في الإنسان المريض وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. لا تقتصر هذه المسألة على المتلازمات خلل التوتر، ولكن في الواقع تتعلق العديد من نماذج القوارض المعدلة وراثيا في مجال اضطرابات الحركة1,2. قد يكون السبب في عدم وجود نمط ظاهري في نماذج القوارض المعدلة وراثيا على آليات تعويضية فعالة للغاية3. في حالة خلل التوتر ، يتميز المرض بتقلصات العضلات اللاإرادية مما تسبب في حركات التواء ومواقف غير طبيعية4. وقد ساعدت دراسة الأسباب الثانوية (أي، إصابة الدماغ) من أعراض خلل التوتر، لتحديد الهياكل المشاركة في مظاهر هذه التشوهات الحركية، مثل العقد القاعدية5. وقد أظهرت دراسات التصوير الدماغ من أشكال وراثية من خلل التوتر تشوهات وظيفية في جميع مناطق الدماغ تقريبا المسؤولة عن التحكم في الحركة و الاندماج sensorimotor6,7. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى نماذج القوارض لتعميق فهم الاختلالات العصبية على مستوى الشبكة الجزيئية والكبيرة وكذلك لتطوير الخيارات العلاجية. هذا هو المكان الذي تقدم نماذج الماوس الدوائية إمكانية تكرار السمات السريرية والمرضية للمرض بطريقة أكثر دقة.
خلل التوتر السريع في الزحم الرعاش (DYT/PARK-ATP1A3؛ RDP; DYT12) هي واحدة من أشكال وراثية من خلل التوتر. وهو ناتج عن طفرات فقدان الوظائف في جين ATP1α3، الذي يقوم بترميز الوحدة الفرعية α3 لNa+/ K+-ATPase8. وعلاوة على ذلك، فمن المسلم به أن ناقلات الطفرات الجينية يمكن أن تكون خالية من الأعراض لسنوات قبل النامية الحادة خلل التوتر المستمر العام وباركنسونية بعد التعرض لحدث مجهد. في الواقع ، فإن penetrance من DYT / PARK - ATP1A3 غير مكتملة ومرهقة الأحداث التي تعمل على نطاق الزناد من الإفراط في المادية ودرجات الحرارة القصوى إلى الإفراط في استهلاك الكحول والالتهابات9،10. من أجل دراسة DYT/PARK-ATP1A3 والعثور على تدخلات علاجية محتملة، فقد حاول عدة مرات تقليد تطور المرض المعتمد على الإجهاد في نماذج القوارض. ومع ذلك ، وبصرف النظر عن واحد القائمة الوراثية DYT / PARK - ATP1A3 نموذج الماوس ، حيث كانت تسبب حركات عابرة غير طبيعية والتشنج مثل انخفاض حرارة الجسم ، وجميع النماذج الماوس الجينية المنشورة لDYT / بارك - ATP1A3 فشلت في إنتاج أعراض خلل التوتر1،11،12. كالديرون وآخرون أظهرت سابقا أن منع α3-subunit ثنائيا في العقد القاعدية والمخيخ عبر واباين جليكوسايد القلب في الفئران من النوع البرية النتائج في اضطراب مشية خفيفة13. أدى التعرض الإضافي لصدمات القدم الكهربائية في بيئة دافئة إلى نمط ظاهري مائل للحرارة وبطء، مما يدل على أن الضخ المزمن والمستهدف للوابين متبوعاً بالإجهاد يقلد بنجاح النمط الظاهري DYT/PARK-ATP1A3.
ومع ذلك ، فإن تعريض الحيوانات لصدمات القدم الكهربائية في بيئة دافئة من 38-40 درجة مئوية على مدى فترة ساعتين يحفز الألم والقلق في الحيوانات ، والتي تمثل عوامل مربكة ، خاصة لتقييم التغيرات في نظام الكاتيتشولامين المتعلقة بتطور خلل التوتر. وهكذا، نحن هنا وصف نوع مختلف من نموذج الإجهاد مع قيمة ترجمة عالية، والتي تتعلق مرة أخرى إلى حقيقة أن خفيفة إلى معتدلة ممارسة وصفت بأنها مشغلات في DYT/PARK-ATP1A3 المرضى9. وعلاوة على ذلك، ممارسة المتكررة هو الزناد المعروفة لخلل التوتر البؤري14. تعرضت الفئران مرارا وتكرارا لمهام حركية صعبة تتألف من ثلاثة ينحدر من قطب خشبي ("اختبار القطب") وثلاثة أشواط على جهاز Rotarod ("اختبار الأداء Rotarod"). تم استخدام وضع الحيوانات على الجزء العلوي من عمود خشبي 50 سم لإجبار الحيوانات على النزول ، تم استخدام جهاز Rotarod لإخضاع الفئران للنشاط القسري عن طريق وضعها على قضيب دوار.
توصيف النمط الظاهري المحرك لنموذج الماوس لخلل التوتر هو تحد خاص بسبب عدم وجود اختبارات محددة مسبقا ودرجات. ومع ذلك، فقد تم استخدام اختلاف واحد من تقييم الإعاقة الحركية مرارا وتكرارا على مدى السنوات الماضية من أجل تقييم شدة وتوزيع الحركات مثل خلل التوتر في القوارض13،15،16. نحن هنا تقديم نسخة معدلة من مقياس تصنيف خلل التوتر، والتي أثبتت فعاليتها في تقييم النمط الظاهري مثل خلل التوتر الحيواني عندما لوحظ على مدى فترة زمنية قدرها أربع دقائق. كطريقة ثانية لتقييم حركات مثل خلل التوتر، نقدم نظام تسجيل تم تطويره حديثًا لتقييم الحركات غير الطبيعية أثناء اختبار تعليق الذيل. وهو يسمح لتقييم وتيرة ومدة حركات مثل خلل التوتر والمواقف من الأطراف الأمامية، hindlimbs وكذلك الجذع.
Protocol
وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقاً للمبادئ التوجيهية الدولية والوطنية و/أو المؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. وافقت السلطات المحلية في Regierung von Unterfranken، فورتسبورغ، ألمانيا، على جميع التجارب على الحيوانات.
1. فتيلة من مضخات التناضح
ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم تنفيذها على الأقل 48 ساعة قبل الجراحة. يجب ملء مضخات ALZET التناضحة مسبقاً لضمان وصول معدل الضخ إلى حالة ثابتة قبل الزرع.
- إعداد الحل المطلوب للضخ المزمن مسبقا. تأكد من أن المذيبات والوكيل متوافقان مع المضخات والقسطرة. بالنسبة للمشروع هنا، ذاب محلول مخزون 10x من ouabain (المخزنة في -20 درجة مئوية) في درجة حرارة الغرفة ودوامة لمدة 10 ق.
تنبيه: واباين سام: يجب التعامل معه فقط بالقفازات وفتحه فقط تحت غطاء معقمة لتجنب الاستنشاق. - تشغيل غطاء محرك السيارة العقيم؛ تطهير غطاء محرك السيارة وكذلك جميع الأدوات والمواد اللازمة قبل وضعها تحت غطاء محرك السيارة.
- وضع على قفازات جراحية قبل التعامل مع مضخات التناضح. إعداد بشكل منفصل حل ouabain المعينة لمضخات المخطط والمخيخ.
ملاحظة: ضع في الاعتبار أن تركيز المحلل في المضخة للمخاتومة يجب أن يتضاعف مقارنة بتركيز المحل في المضخة المخصصة للمخيخ. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن يتم توصيل مضخة لخُمى مزدوجة، ومع ذلك، فإن معدل التدفق هو نفسه بالنسبة لمضخة المخيخ، والتي ترتبط بقنية واحدة. - حساب مقدار الحل المطلوب باستخدام الصيغة التالية:
معدل التسليم الجماعي (كس)= معدل تسليم الحجم (س) x تركيز العامل في السيارة (Cd)
وبالنسبة للمشروع الحالي، تم تشغيل المضخات التناضحة وملئها بمحلول الوابين بتركيز 11.2 نانوغرام/ساعة أو 0.9% ملحي لمجموعة التحكم. - دوامة كلا من حلول ouabain لمدة 10 ق ومرشح معقمة (أي، 0.22 μm حقنة نهاية فلتر) لهم في منفصلة، أنابيب جديدة microcentrifuge، وذلك باستخدام مرشح مختلف لكل حل.
- وزن مضخات التناضح فارغة مع مشرف تدفق (حوالي 0.4 ز).
- ملء حقنة 1 مل مع 27 G ملء قنية (ويفضل مع طرف حادة) مع محلول ouabain مصفى عقيمة أو حل السيارة.
- الحصول على جميع فقاعات الهواء من الحقنة، وعقد مضخة التناضح في وضع تستقيم، إدراج كانولا على طول الطريق إلى المضخة وملء ببطء الخزان حتى الحل الزائد يظهر على رأس (تجنب ملء السريع لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى فقاعات الهواء في المضخة). المقبل، إدراج مدير تدفق في المضخة (يجب أن تظهر حل الزائدة في الأعلى).
- سحب مدير تدفق خارج (حوالي 5 مم)، تقلع بعناية شفة بيضاء مع مقص وربط قطعة من أنابيب الفينيل إلى وسيط تدفق. تأكد من أن القسطرة يبلغ طولها حوالي 2 سم للسماح بالتنقل السليم للحيوان.
- وزن مضخة التناضح شغل مرة أخرى لضمان أن الفرق في الوزن بين مضخة مملوءة وفارغة هو متطابق مع الوزن المتوقع من الحل تحميل.
ملاحظة: بالنسبة لمعظم حلول مائي هذا الوزن يساوي وحدة التخزين في microliters. إذا كان الوزن لا يتوافق مع حجم المتوقع، قد يكون محاصرا الهواء داخل المضخة، والتي تحتاج إلى إفراغ وإعادة تعبئتها. - for فتيلة من المضخات، وإعداد اثنين من أنابيب microcentuge 2 مل، أنبوب واحد لخيمة واحد لخيخة.
- غمر المضخات في أنابيب microcentrifuge شغلها في منتصف الطريق مع محلول ملحي 0.9٪. لا تغمر الطرف المفتوح من القسطرة. وضع أنابيب microcentrifuge في ثيرموسترولدر لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية من أجل ضمان أن المضخة قد وصلت إلى معدل ضخ ثابت قبل زرع والقسطرة هي المعبأة مسبقا.
2. كانولا وزرع مضخة التناضح
- وضع الماوس (ذكر, C57Bl/6N, 11-12 أسابيع من العمر) في غرفة مصممة لتخدير استنشاق; تعيين معدل تدفق ايزوفلوران إلى 2-3٪ ومعدل تدفق الأكسجين إلى 2 لتر / دقيقة.
- بعد تخدير الفأر بعمق وفقًا للبروتوكولات المعتمدة ، حلق الجزء العلوي من رأس الحيوان ، والرقبة الظهرية والثلث القريب من الظهر.
- وضع الحيوان في إطار مجسم ومواصلة التخدير مع isoflurane عن طريق قناع التخدير الماوس مصممة لأداة مجسمة (isoflurane معدل تدفق 1.5-2٪ ، 2 لتر / دقيقة الأوكسجين).
- باستخدام النصائح المطاطية أو قضبان الأذن غير الممزقة ، قم بإصلاح رأس الحيوان في الإطار المجسم ، مع الحرص على أن يتم تسوية الرأس.
- من أجل منع انخفاض حرارة الجسم، ووضع وسادة التدفئة تحت الحيوان، وإدراج مسبار درجة حرارة المستقيم وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. حماية عيون الحيوان من الجفاف باستخدام قطرة من مرهم العيون على كل عين.
- تطبيق مسكن, مثل الكاربروفين (5 ملغ / كغ وزن الجسم), تحت الجلد قبل بدء الجراحة.
- مع حقنة تحت الجلد لحقن ما يصل إلى 0.2 مل من bupivacaine 0.25٪ وانتظر 30 s للتخدير الموضعي ليفعّل المفعول.
- تطهير المناطق الحليقة جيدا مع مطهر، مثل ثنائي هيدروكلوريد أوكتينيدين.
- بعد التطهير الشامل للمنطقة الجراحية ، استخدم مشرطًا لوضع شق في أعلى الرأس واستخدام المقص لمواصلة الشق وصولاً إلى أطرافه. فضح الجمجمة بمساعدة المشابك البلدغ ومسح periosteum مع قضيب القطن معقمة.
- محاذاة إما القلم أو غيض من قنية ملطخة بالحبر الأسود مع bregma واستخدام الإحداثيات المناسبة للاحتفال نقاط الدخول الثلاثة لقنيات الدماغ على الجمجمة (إحداثيات للثقوب الثنائية اللازمة ل perfusion من العقد القاعدية: الأمامي / الخلفي: + 0.74 ملم، متوسطة / جانبية: +/- 1.50 مم (+ تشير إلى الجانب الأيمن، - الجانب الأيسر نسبة إلى بريما)؛ إحداثيات الثقب في خط الوسط من المخيخ: الأمامي/ الخلفي: - 6.90 ملم). بعد ذلك ، قم بحفر الثقوب بعناية للقنية المزدوجة المخصصة للعنجة القاعدية والقنية الوحيدة المخصصة للمخيخ (الشكل 1A).
- حفر حفرة رابعة لملغي صغير بين المخطط والمخيخ. هذا المسمار في نهاية المطاف أن تكون جزءا لا يتجزأ من الاسمنت الأسنان وتوفير عقد إضافية لقنية. باستخدام ملقط غرامة وسائق المسمار، أدخل بعناية المسمار في حفرة صغيرة حتى يتم إصلاحها بحزم في الجمجمة. لا زرع المسمار بعمق جدا لأن هذا يضر أنسجة الدماغ.
ملاحظة: من المستحسن الاستمرار في زرع مضخة التناضح قبل إدخال القناء التناضحي. وهذا يتجنب التسبب في أي ضرر عرضي للقنيات عند زرع المضخات. - من أجل إنشاء جيب صغير للمضخة التناضحة على كل جانب من الحيوانات مرة أخرى، واستخدام ملقط الأنسجة لفصل طبقات الأنسجة تحت الجلد. تقدم ملقط نحو ساق واحدة الخلفية وفتح ملقط قليلا من أجل توسيع الجيب تحت الجلد. كرر نفس الإجراء للجانب الآخر، أولا إزالة ملقط من شق ثم دفعها بلطف نحو الساق الخلفية الثانية.
ملاحظة: يجب أن يسمح الجيب للمضخة بالانزلاق بسهولة، ومع ذلك، لا ينبغي أن يكون هناك مساحة كبيرة للتحرك تحت الجلد. - مع مساعدة من ملقط الأنسجة اتخاذ المضخة الأولى جنبا إلى جنب مع قطعة متصلة من أنابيب وشريحة في جيب تحت الجلد واحد. كرر نفس الإجراء مع المضخة الثانية.
- باستخدام حامل مضخة صغيرة، إدخال كانية ونسمة واحدة مع طول مخصص من 3.0 ملم في حفرة حفرت في خط الوسط من المخيخ. فصل رئيس كانولا بعناية وإصلاح كانولا وكذلك المسمار الصغيرة مع أسمنت الأسنان، مع الحرص على عدم تغطية قطعة الربط لأنابيب مضخة التناضح. تأكد من أن أسمنت الأسنان المحيطة بالقنية قد جفت بالكامل قبل الاستمرار في الجراحة.
- قبل إدراج كانولا مزدوجة مع مسافة من مركز إلى مركز من 3.0 ملم وطول مخصص من 4.0 ملم في الثقوب حفر ثنائيا فوق ganglia القاعدية، نعلق قطعتين قصيرة من أنابيب الفينيل (0.5 سم) إلى قطعتين توصيل من القنية مزدوجة. توصيل أنابيب الفينيل مع محول التشعب وملء بعناية كامل نظام الأنابيب بما في ذلك محول وقنية مع حل ouabain أو السيارة (درجة حرارة الغرفة، معقم تصفية مسبقا). ويمكن القيام بذلك على أفضل أفضل أفضل مع حقنة 1 مل و 27 G تعبئة قنينة أدخلت في نهاية واحدة الخلفي من محول التشعب(الشكل 1B).
- باستخدام حامل مضخة صغيرة، أدخل بعناية القنية المزدوجة في الثقوب الثنائية. استخدام المشبك لفصل رئيس كانولا وإصلاح قنية مزدوجة مع أسمنت الأسنان.
- قم بتوصيل القسطرة من المضخات التناضحية إلى محول التشعبات بالإضافة إلى القنية المفردة، على التوالي. تأكد من أن القسطرة لديها عقد قوي على القطع ربط من القنيات.
ملاحظة: كلا المضخات لديها معدل تدفق متساو، لذلك كن حذرا لربط مضخة التناضح مع حل مركزة مزدوجة إلى محول التشعب لضمان أن نفس التركيز يصل إلى كل من العقد القاعدية والمخيخ. - إغلاق شق على الجزء الخلفي من الحيوانات مع غرز قدر الإمكان في اتجاه الجمجمة، مع الحرص على عدم الإفراط في الجلد (الشكل 1C).
- حقن تحت الجلد 0.5 مل من 0.9٪ المالحة، والتي ينبغي أن يكون درجة حرارة الجسم، في أضعاف الجلد على كل جانب من الجزء الخلفي من الحيوانات من أجل تجنب جفاف الفئران، وتجنب بعناية المضخات.
3. التحدي الحركي
- تخضع ouabain - أو الفئران السيارة التي تم اغراءها إلى المهام الحركية الصعبة كشكل من أشكال التعرض للإجهاد الخفيف 4 ح بعد الجراحة وبشكل متكرر كل 24 ساعة بعد ذلك من أجل حث حركات مثل خلل التوتر. وهذا لا يشمل توصيف السلوك; الغرض منه هو الحث على ارتفاع مستوى التوتر مقارنة مع قفص العادي حفظ.
- ضع الفأر على عمود خشبي خشن يبلغ 50 سم وقطره 1 سم ، ويواجه الأنف لأسفل. تأكد من أن يتم وضع القطب في قفص كبير مع ما يكفي من الفراش في حالة السقوط. ليس من الضروري قياس وقت الهبوط ، ولكن ابحث عن فرط الإرادية من الأطراف الأمامية وال hindlimbs التي تقدمها الحيوانات التي غرستها الوابين أثناء نزول القطب. اسمحوا الفئران تنزل القطب ثلاث مرات والسماح 2 دقيقة من الانتعاش بين ينزل.
ملاحظة: الفئران أوابين pered ينبغي أن تظهر الأعراض الأولى مثل براديكينيزيا 4 ح بعد الجراحة. ومع ذلك، 24 ساعة بعد الجراحة الفئران يجب أن تبدأ في تقديم فرط الإرادية من الأطراف الأمامية و hindlimbs كعلامة على حركات مثل خلل التوتر أثناء النزول. - بالنسبة للمهمة الحركية الثانية، ضع الفئران على قضيب الدوران كما تم لاختبار أداء Rotarod. لا يستخدم جهاز Rotarod كمقياس للكمون في السقوط ، والهدف هو إخضاع الفئران للنشاط القسري. ضع الفئران على قضيب الدورية ثلاث مرات والسماح 2 دقيقة من الانتعاش بين الاختبارات.
ملاحظة: لزيادة التعرض للإجهاد، استخدم جهاز Rotarod المتسارع. بالنسبة للمشروع الموضح هنا، يتسارع القضيب من 5 إلى 50 دورة في الدقيقة على مدى فترة زمنية محددة تبلغ 300 ثانية. - السماح للحيوانات استرداد لمدة 30 دقيقة بين اختبار القطب واختبار الأداء Rotarod ومرة أخرى 30 دقيقة قبل تسجيل للحركات مثل خلل التوتر كما هو موضح في إطار خطوة البروتوكول 4. بين التعرض المتكرر للإجهاد، تسمح للفئران بالتعافي لمدة 24 ساعة.
4. نظم تسجيل لتقييم الحركات الشبيهة بخلل التوتر
ملاحظة: يجب أن يكون مُختبر أعمى عن تعيين المجموعة تحليل لمنع التحيز. الاختبارات السلوكية المستخدمة لتوصيف النمط الظاهري للفئران هما نظامان للتسجيل: مقياس تصنيف خلل التوتر يسجل حركات غير طبيعية تشبه خلل التوتر ودرجة سلوكية باستخدام اختبار تعليق الذيل. تقييم حركات مثل خلل التوتر بعد وقت الانتعاش من 30 دقيقة بعد التعرض للإجهاد الخفيف.
- مقياس تصنيف خلل التوتر
ملاحظة: بسبب عدم وجود المهام السلوكية المحددة مسبقا، تم إنشاء مقياس تصنيف خلل التوتر كنظام تسجيل قائم على المراقبين مماثلة لمقاييس التصنيف السريري لخلل التوتر البشري. وهو نسخة معدلة من مقياس تصنيف خلل التوتر المستخدمة من قبل كالديرون وآخرون13.- سجل الموقف ومشية من الحيوانات على مدى فترة 4 دقائق بعد أن تم وضع الحيوانات في صندوق من البلاستيك أو خشبي.
- نقاط للتردد وتوزيع حركات تشبه خلل التوتر من 0 إلى 4 نقاط: (0) السلوك الحركي العادي؛ (1) السلوك الحركي غير الطبيعي، لا حركات مثل خلل التوتر؛ (2) انخفاض طفيف في الحركة الحركية مع حركات خلل التوتر البؤري المعتدلة مثل؛ (3) انخفاض معتدل في الحركة الحركية مع حركات خلل التوتر الحادة في التوتر؛ (4) ضعف شديد، مع استمرار، حركات خلل التوتر المعمم مثل (الشكل 2). النظر في الحركات أو المواقف التالية مثل خلل التوتر: فرط اتساع الأطراف الأمامية، موقف واسع أو فرط اتساع من hindlimbs وكذلك kyphosis. النظر في خلل التوتر البؤري في حالة تأثر جزء واحد من الجسم وكما تعميم في حالة الجذع واثنين على الأقل من أجزاء الجسم الأخرى تتأثر.
- اختبار تعليق الذيل
ملاحظة: غالباً ما يتم استخدام اختبار تعليق الذيل لمراقبة وتسجيل المشبك hindlimb. هذا مهما نوع ظاهريّة غيرمّيّد جدّا يشير ينهمر حرّكيّة. يقترح البروتوكول التالي نظام تسجيل محدد للحركات الشبيهة بخلل التوتر. بسبب تعميم خلل التوتر في مرضى DYT/PARK-ATP1A3 ، يجب تقييم الحركات الشبيهة بخلل التوتر في الأطراف الأمامية والجذع و hindlimbs. تم تطوير نظام تسجيل تم تطويره حديثًا من 0-8 نقاط ، وهو مجموع نقاط < أشار 2 إلى عدم وجود حركات تشبه خلل التوتر(الشكل 3).- التقاط الماوس من قبل الذيل بالقرب من قاعدته ورفع الحيوان. تسجيل فيديو 2 دقيقة من اختبار تعليق الذيل وتعيين درجة في وقت لاحق، وتحليل شامل للتسجيل.
- تسجيل الأطراف الأمامية من 0 إلى 4 نقاط, حيث المتكررة أو المستمر التراجع منشط واحد أو كلا الأطراف الأمامية, فضلا عن فرط التكاثر جنبا إلى جنب مع عبور الأطراف الأمامية, تم تصنيفها على أنها خلل التوتر مثل: (0) لا حركات غير طبيعية; (1) انخفاض حركة الأطراف الأمامية مع فرط الإفراط في الكفوف ينظر ≥ 50٪ من الوقت المسجل؛ (2) حركات خلل التوتر المعتدل مثل الأطراف الأمامية (الأطراف) < 50٪ من الوقت المسجل؛ (3) حركات خلل التوتر المعتدل مثل الأطراف الأمامية ≥ 50٪ من الوقت المسجل أو شديد < 50٪ من الوقت المسجل؛ (4) حركات شديدة تشبه خلل التوتر في الأطراف الأمامية ≥ 50٪ من الوقت المسجل.
ملاحظة: هيدليمب المشبك هو حركة غير طبيعية التي لا ينبغي أن يكون سجل مثل خلل التوتر. - تسجيل hindlimbs من 0 إلى 3 نقاط, حيث تم تقييم التراجع وانقباض الأطراف الخلفية وكذلك فرط الإفراط المستمر على أنها مثل خلل التوتر: (0) لا حركات غير طبيعية; (1) انخفاض حركة hindlimbs مع فرط الكبر من الكفوف ينظر ≥ 50٪ من الوقت المسجل؛ (2) حركات تشبه خلل التوتر من hindlimb واحد؛ (3) حركات تشبه خلل التوتر لكل من hindlimbs.
- في حالة التشويه التروناي > 80٪ من الوقت المسجل، يتم إضافة نقطة إضافية إلى النتيجة.
- ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه.
Representative Results
تم تعديل الشكل 4 من اوشينبرغر وآخرون17. لتحليل البيانات لكل مقياس تصنيف خلل التوتر (A) واختبار تعليق ذيل (B) ، احسب مجموع النقاط لكل نقطة زمنية لكل. يجب رسم متوسط كل نقطة زمنية وكل مجموعة على رسم بياني مناسب. وينبغي دراسة توزيع القيم وتطبيق الاختبار الإحصائي المناسب لتحديد الأهمية. مع عدد كاف من الحيوانات، يمكن الكشف عن النمط الظاهري المحرك سواء مع مقياس تصنيف خلل التوتر وكذلك مع تقييم الحركات غير الطبيعية في اختبار تعليق الذيل. ويتجلى النمط الظاهري مثل خلل التوتر من خلال درجة المحرك أعلى بكثير في كل من التقييمات في مجموعة الأوابين المُشدّمة، وشدد بالمقارنة مع الفئران غير المجهدة التي تم غرسها في الوابين، وكذلك الفئران المسيطرة.
الشكل 1: الخطوات الجراحية الرئيسية لزرع القنية والتناضح. أ) بالنسبة للإحداثيات المشار إليها، يجب حفر الثقوب ثنائياً من أجل القنيّة المزدوجة المخصصة للعنجة القاعدية وللقنية المفردة الموضوعة عند خط الوسط في المخيخ. يتم عرض مضختين من الزى التناضح على كل جانب من الحيوان. (B) تظهر الصورة قنية مزروعة، واحدة في المخيخ، ثابتة مع أسمنت الأسنان. يجب ربط القنية المزدوجة للعنجة القاعدية بمحول التشعبات وملءها مسبقًا بالوبين قبل الزرع. (C) صورة الإجراء النهائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم الحركات الشبيهة بخلل التوتر مع مقياس تصنيف خلل التوتر. خلال 4 دقائق فيديو، وسجلت حركات مثل خلل التوتر على أساس توزيع الجسم والمدة. تم تصنيف فرط التوسّع اللاإرادي للأطراف الأمامية ، أو موقف واسع أو فرط التوسّع في hindlimbs وكذلك الحدباء على أنه خلل التوتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم الحركات الشبيهة بخلل التوتر أثناء اختبار تعليق الذيل. نظام التهديف المطورة حديثا للحركات غير طبيعية خلال اختبار تعليق ذيل 2 دقيقة يقيم حركات مثل خلل التوتر في الأطراف الأمامية، hindlimbs والجذع من 0-8 نقاط في المجموع. للأطراف الأمامية، وفرط التمدد وعبور الأطراف الأمامية، فضلا عن انثناء منشط نحو الجذع مؤهلة مثل خلل التوتر. ل hindlimbs تم تسجيل فرط الاستعداد غير الطوعي وكذلك التراجع مع التمديد على خط الوسط كما خلل التوتر مثل. تم تسجيل تشويه truncal أكثر من 80 ٪ من الوقت المسجل مع نقطة واحدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الرسوم البيانية التمثيلية لمقياس تصنيف خلل التوتر واختبار تعليق الذيل. (A) يصور الرسم البياني مقياس تصنيف خلل التوتر للفئران المجهدة NaCl (الخط الأسود المنقط) والفئران غير المجهدة (خط برتقالي منقط) والفئران المُجهدة (الخط الأزرق الداكن). لكل نقطة زمنية، يتم إظهار متوسط القيم ± الخطأ القياسي للـ (SEM). (B) الرسم البياني يظهر تقييم الحركات غير الطبيعية خلال اختبار تعليق ذيل 2 دقيقة للفئران NaCl- perfused، وشدد (خط أسود منقط)، ووابين مُنقط، والفئران غير المجهدة (خط برتقالي منقط) و ouabain-perfused، وشدد الفئران (خط أزرق داكن). تم إجراء التحليل الإحصائي لمقياس تصنيف خلل التوتر واختبار تعليق الذيل باستخدام اختبار مان ويتني ذو الذيلين. بونفرروني هولم التصحيح (§) من قيم ف أظهرت فرقا كبيرا لفترة المراقبة من 72 ساعة. الأزرق الداكن * يشير إلى اختلافات كبيرة بين الفئران الم PERED، وشدد ووابين مُلَكّد، الفئران غير المجهدة، والأسود * تشير إلى اختلافات كبيرة بين NaCl-perfused، وشدد الفئران ووابين، وشدد الفئران وكذلك بين NaCl- perfused، وشدد الفئران و ouabain الم per eded، غير وشدد الفئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هذا DYT / PARK -ATP1A3 نموذج الماوس الدوائية يسمح للتحليل المفصل للتغيرات الهيكلية والعصبية الكيميائية intracerral الناجمة فقط عن تثبيط أيونات الصوديوم والبوتاسيوم في العقد القاعدية و المخيخ وكذلك التعديلات المتعلقة التعرض للإجهاد. في حالة الفئران ، يمكن زرع مضختين من التناضح تحت الجلد كحد أقصى. نحن هنا نقدم طريقة بالتفصيل تسليم المخدرات المزمنة لهياكل الدماغ متعددة من خلال تنفيذ قنية مزدوجة متصلة بمحول التشعب بالإضافة إلى قنية واحدة. ويمكن استخدام هذه المنهجية لأي تطبيق يتطلب تركيب هياكل متعددة للدماغ في آن واحد وبشكل مزمن.
نقدم نموذج فأر لاضطراب حركة نادرة، حيث يصاب المرضى بالأعراض الدائمة بعد التعرض للإجهاد. ولا يزال هذا التفاعل الجيني والبيئي المفترض غير مفهوم جيداً، ولكنه قد يمثل أحد الميكانيكا الباثومية الرئيسية في تطوير DYT/PARK-ATP1A3. وقد نشرت أساليب مختلفة من تعريض الفئران للإجهاد في الماضي وتشمل الصدمات القدم الكهربائية، وكبح، والبيئة الباردة أو الدافئة والتعرض لمختلف الروائح11،12،13. في محاولة لتعرض الفئران إلى عامل إجهاد خفيف ذو قيمة تحويلية ، فإننا هنا نصف الخضوع المتكرر للفئران للمهام الحركية الصعبة. بالنسبة لاختبار القطب، كشفت الحيوانات المُشبعة بالوعين عن فرط الإفراط في الأطراف الأمامية و hindlimbs. وكانت هذه الحركات مشابهة جدا للحركات التي تشبه خلل التوتر لوحظت خلال تسجيل الفيديو 4 دقائق من الحيوانات وكذلك اختبار تعليق الذيل. قد يكون تطبيق الإجهاد الخفيف في شكل مهام حركية صعبة مفيدًا في نماذج الماوس الأخرى التي تظهر الأعراض الحركية أو الانعجاب العصبي ، حيث تؤثر التفاعلات الجينية البيئية بشكل كبير على درجة تطور المرض.
هناك نقص عام في المهام السلوكية المحددة مسبقا، فضلا عن جداول التصنيف لتصنيف الحركات غير الطبيعية والمواقف في الفئران. معظم المهام الحركية المتاحة تكشف عن تشوهات غير محددة، مثل المشبك hindlimb، وهي ظاهرة معروفة في العديد من نماذج الماوس من اضطرابات الحركة مع تنكس عصبي18،19. من أجل توصيف مناسب للنمط الظاهري ، من الضروري تحليل ما إذا كان نموذج الماوس يلخص السمات البارزة للمرض. هنا، نقدم نسخة معدلة من مقياس تصنيف خلل التوتر المستخدمة سابقا لتقييم الإعاقة الحركية في نماذج الماوس خلل التوتر15،16. بالإضافة إلى ذلك قمنا بتطوير نظام تسجيل قائم على المراقبين لاختبار تعليق الذيل ، والذي تم إنشاؤه بشكل مماثل لموازين التصنيف السريري لخلل التوتر البشري. ويظهر كلا المقياسين تصنيف درجة أعلى بكثير في ouabain- مُزَدَّد الفئران، مقارنة مع الوعين المُلَكَّن، والحيوانات غير المجهدة، فضلاً عن الحيوانات المُلَكَّبة بالمركبات. وتتمثل عيوب أي نظام للتسجيل قائم على المراقبين في التدريب اللازم لمقيّبي التقييم لضمان اتساق التهديف والحد من تقلب المراقبين، فضلا عن خطر التحيز المحتمل للمصنّف إن لم يكن أعمى تماما عن المجموعة التي تم تحليلها. ومع ذلك، لا تزال أنظمة التسجيل القائمة على المراقبين تقدم طريقة سهلة المنال لتوصيف النمط الظاهري ويمكن تكييفها مع نموذج الفأرة المحلل، كما هو الحال في المشروع الحالي لتقييم الحركات الشبيهة بخلل التوتر. لضمان اتساق التسجيل بين مختلف المُقيّـّـن، ينبغي إتاحة مقاطع فيديو تدريبية. للحد من أي تحيز محتمل ، فمن المستحسن أن تقييم مختلفة تسجيل نفس مقاطع الفيديو ، وأن يتم متوسط الدرجات الفردية. كل من أنظمة التهديف المذكورة في هذا العمل سجل وجود حركات مثل خلل التوتر في الحيوانات. يمكن تكييف موازين التصنيف وفقًا لمتطلبات محددة داخل المشروع ، كما تم ذلك سابقًا من قبل Ip et al.، حيث تم تسجيل hindlimbs فقط للحركات الشبيهة بخلل التوتر في نموذج ماوس لخلل التوتر 1 (DYT-TOR1A)20. ويمكن استكمال موازين التصنيف من خلال أنظمة تسجيل أخرى منشورة سابقًا ، وتقييم درجة البطء في القوارض على سبيل المثال كما تم مع درجة الإعاقة في الحركة بواسطة Calderon et al.13.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والبحوث الاتحادية (BMBF DysTract إلى C.W.I.) والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في جامعة فورتسبورغ (Z2-CSP3 إلى L.R.). يشكر المؤلفون لويزا فريك، وكيالي روهم، وفيرونيكا سنغر، وهايكه مينزيل، وعلى مساعدتهم التقنية، وكذلك هيلغا برونر على رعاية الحيوانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
