Summary
Osmotik pompalara bağlı bazal ganglia ve serebelluma kanüllerin implantasyonu yoluyla farmakolojik DYT/PARK-ATP1A3 distoni fare modeli oluşturmak için bir protokol salıyoruz. Distopya benzeri hareketlerin indüksiyonunu bir motor meydan okuma uygulaması ve fenotipin davranışsal skorlama sistemleri ile karakterizasyonu ile tanımlarız.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, özellikle mevcut transgenik kemirgen modellerinin çoğunun insan hastalığının klinik yönlerini andıran bir motor fenotip sunmuyorhareket bozuklukları incelerken sınırlamalarla karşı karşıyadır. Farmakolojik fare modelleri patomekanizmaların ve bunların davranışsal fenotip üzerindeki etkilerinin daha doğrudan incelenmesine olanak sağlar. Beyin kanüllerine bağlı ozmotik pompalar, lokal ve kronik ilaç dağıtımı yoluyla farmakolojik fare modelleri oluşturma olasılığını ortaya çıkar. Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizmin kalıtsal hareket bozukluğu için, Na+/K+-ATPaz'ın α3-alt ünitesindeki fonksiyon kaybı mutasyonu glikozit ouabain yoluyla son derece spesifik bir abluka ile simüle edilebilir. Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizmpatogenezinde yoğun rol yaptığı düşünülen iki beyin yapısı olan bazal gangliyon ve beyincikteki α3-alt ünitesini lokal olarak bloke etmek için, bilateral bir kanül stereotaksik olarak striatuma yerleştirilir ve beyincik içine ek bir kanül yerleştirilir. Kanüller hayvanların arkasına deri altı implante edilen ve ouabain kronik ve hassas teslim için izin iki ozmotik pompalar, vinil tüp ile bağlanır. Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizm için farmakolojik fare modeli, asemptomatik ve semptomatik mutasyon taşıyıcılarının klinik ve patolojik özelliklerini yeniden formüle etme avantajını taşır. Hızlı başlangıçlı distoni parkinsonizmmutasyon taşıyıcıları gibi, ouabain perfüzyon fareler sadece strese ek maruz kaldıktan sonra distoni benzeri hareketler geliştirmek. Biz hafif bir stres paradigması göstermek ve bir motor fenotip değerlendirilmesi için iki modifiye skorlama sistemleri tanıtmak.
Introduction
Doğrudan beyne sürekli bir ilaç teslim avantajları çoktur. Hayvanlar için gereksiz bir stres faktörünü temsil eden tekrarlayan ve sık enjeksiyonlardan kaçınılabilir ve ilacın daha sabit bir intraserebral konsantrasyonu sağlanabilir. Bu özellikle sistemik olarak uygulanan ilaçlar kolayca kan beyin bariyerini nüfuz başarısız geçerlidir. Ayrıca, ozmotik pompalar aracılığıyla kronik ilaç teslim aksi takdirde sistem çapında yan etkileri olurdu substratların lokalize teslimat için izin verir. İlaçlar istenilen beyin yapılarına hedefli bir şekilde teslim edilebilir, ortaya çıkan etkisi böylece doğrudan izlenebilir. Bu, terapötik etkilerin incelenmesi ve patomekanizmaların incelenmesi gibi bir dizi uygulama için kullanılabilir. Bu son uygulama distoni için farmakolojik bir fare modeli oluşturmak amacıyla burada projede kullanılmıştır.
Üçüncü en yaygın hareket bozukluğunu temsil eden distonik sendromların analizi ve anlaşılması, genetik hayvan modellerinin hastalıklı insanda bulunan hastalık fenotipinin yanı sıra patofizyolojiyi yeniden üretememesi ile büyük ölçüde sınırlandırılmıştır. Bu sorun disttonik sendromlar ile sınırlı değildir, ama aslında hareket bozuklukları alanında birçok transgenik kemirgen modelleri ile ilgilidir1,2. Transgenik kemirgen modellerde fenotip eksikliğinin nedeni son derece etkili telafi mekanizmalarına dayanıyor olabilir3. Distoni durumunda, hastalık büküm hareketleri ve anormal duruşlar neden istemsiz kas kasılmaları ile karakterizedir4. Distonik semptomların ikincil nedenler (yani beyin hasarı) çalışması, bazal ganglia5gibi bu motor anormalliklerin tezahürü ile ilgili yapıların belirlenmesine yardımcı oldu. Distoninin kalıtsal formlarının beyin görüntüleme çalışmaları motor kontrol ve sensorimotor entegrasyonu sorumlu hemen hemen tüm beyin bölgelerinde fonksiyonel anormallikler göstermiştir6,7. Ancak, kemirgen modelleri hala moleküler ve büyük ölçekli ağ düzeyinde nöral disfonksiyonlar anlayışını derinleştirmek için yanı sıra terapötik seçeneklerin geliştirilmesi için gereklidir. Farmakolojik fare modellerinin bir hastalığın klinik ve patolojik özelliklerini daha kesin bir şekilde kopyalama olanağı sunduğu yer burasıdır.
Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizm (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) distoninin kalıtsal formlarından biridir. Na+/K+ -ATPase8'inα3-alt birimini kodlayan ATP1α3 genindeki fonksiyon kaybı mutasyonlarından kaynaklanır. Ayrıca, gen mutasyonu taşıyıcılarının stresli bir olaya maruz kaldıktan sonra akut olarak kalıcı yaygın distoni ve Parkinsonizm gelişmeden önce yıllarca semptomlardan arınmış olabileceği kabul edilmektedir. Nitekim, DYT / PARK-ATP1A3 penetratif eksik ve stresli olaylar alkol ve enfeksiyonların aşırı tüketimi fiziksel aşırı efor ve aşırı sıcaklıklardan bir tetikleyici aralığı olarak hareket eden9,10. DYT/PARK-ATP1A3'ü incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri bulmak için kemirgen modellerinde strese bağlı hastalık gelişimini taklit etmek defalarca denenmiştir. Ancak, bir kenara bir mevcut genetik DYT / PARK-ATP1A3 fare modeli, burada geçici anormal ve konvülsiyon benzeri hareketleri hipotermi tarafından indüklenen, DYT / PARK-ATP1A3 için tüm yayınlanan genetik fare modelleri distonik belirtiler üretmek için başarısız oldu1,11,12. Calderon ve ark. daha önce göstermiştir ki, yabani tip farelerde kardiyak glikozit ouabain ile bazal gangliyonlarda ve beyincikte α3-alt ünitenin iki taraflı olarak bloke olması hafif yürüyüş bozukluğuna yol açarak13. Sıcak bir ortamda elektrik ayak şoklarına ek maruz kalma bir distonik ve bradikinetik fenotip yol açtı, böylece stres takip ouabain kronik ve hedefli perfüzyon başarıyla DYT / PARK-ATP1A3 fenotip taklit gösteren.
Ancak hayvanların iki saatlik bir süre boyunca 38-40 °C sıcak bir ortamda elektrik ayak şoklarına maruz kalmaları hayvanlarda ağrı ve endişeye neden olur ve bu da özellikle distoni gelişimine bağlı katekolamin sistemindeki değişikliklerin değerlendirilmesi nde şaşırtıcı faktörlere yol açmaktadır. Böylece, burada dyt/ PARK-ATP1A3 hastalarda tetikleyiciolarak hafif ve orta egzersiz olarak tarif edilmiştir gerçeğine geri ilgilidir yüksek çevirideğeri ile stres paradigması farklı bir tür açıklar9. Ayrıca, tekrarlayan egzersiz fokal distoni için iyi bilinen bir tetikleyici dir14. Fareler, bir tahta direğin üç inme ("kutup testi") ve rotarod aygıtı ("Rotarod performans testi") üzerinde üç koşudan oluşan zorlu motor görevlere maruz kaldılar. Hayvanların 50 cm'lik ahşap direğin üstüne yerleştirilmesi hayvanları alçalmaya zorlamak için kullanılırken, Rotarod cihazı fareleri döner bir çubuk üzerine yerleştirerek zorla aktiviteye tabi tutulmak için kullanıldı.
Bir fare modelinin distoni için motor fenotipinin karakterizasyonu, önceden tanımlanmış testlerin ve skorların eksikliği nedeniyle özellikle zordur. Ancak, bir motor sakatlık değerlendirme bir varyasyon tekrar tekrar son yıllarda şiddeti ve kemirgenler13,15,,16distoni benzeri hareketlerin dağılımı nı değerlendirmek için kullanılmıştır. Burada distoni derecelendirme ölçeğinin değiştirilmiş bir versiyonunu salıyoruz, bu da dört dakikalık bir süre boyunca gözlendiğinde hayvanların distoni benzeri fenotipinin değerlendirilmesinde etkili olduğunu kanıtladı. Distoni benzeri hareketleri değerlendirmenin ikinci bir yöntemi olarak, kuyruk süspansiyon testi sırasında anormal hareketlerin değerlendirilmesi için yeni geliştirilmiş bir skorlama sistemi salıyoruz. Bu sıklık ve distoni benzeri hareketler ve ön ekstremite, arka bacaklar yanı sıra gövde duruşlarının süresinin değerlendirilmesi için izin verir.
Protocol
Tüm prosedürler, hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Almanya'nın Würzburg eyaletindeki Regierung von Unterfranken'deki yerel yetkililer tüm hayvan deneylerini onayladılar.
1. Ozmotik pompaların astarlanması
NOT: Bu adımın ameliyattan önce en az 48 saat önce yapılması gerekmektedir. ALZET ozmotik pompalar implantasyon dan önce pompalama hızı nın sabit bir duruma ulaşmasını sağlamak için önceden doldurulmalıdır.
- Önceden kronik perfüzyon için istenilen çözümü hazırlayın. Çözücü ve ajan ozmotik pompalar ve kateterler ile uyumlu olduğundan emin olun. Buradaki proje için, oda sıcaklığında ve girdapta 10 s'lik ouabain (-20 °C'de depolanır) 10 x stok çözeltisini eritin.
DİkKAT: Ouabain toksiktir: sadece eldivenile ele alınmalıdır ve solunmasını önlemek için sadece steril bir başlık altında açılır. - Steril kaputu açın; kaputun altına koymadan önce gerekli tüm aletleri ve malzemeleri dezenfekte edin.
- Ozmotik pompaları kullanmadan önce cerrahi eldiven giyin. Ayrı ayrı striatum ve beyincik pompaları için belirlenen ouabain-çözelti hazırlamak.
NOT: Striatum için pompadaki çözeltinin konsantrasyonunun beyincik için belirlenen pompadaki çözeltinin konsantrasyonuna göre iki katına çıkarılması gerektiğini göz önünde bulundurun. Bu striatum için pompa bir çift kanül bağlı olması nedeniyle, akış hızı, ancak, beyincik pompa için aynıdır, hangi tek bir kanül bağlı. - Aşağıdaki formülü kullanarak gereken çözüm miktarını hesaplayın:
kütle teslim oranı (ko) ) = birim teslim oranı (Q) araçtaki ajanın x konsantrasyonu (Cd)
Bu proje için, ozmotik pompalar astarlanmış ve kontrol grubu için 11.2 ng/h veya %0.9 salin konsantrasyonunda ouabain çözeltisi ile doldurulmuştur. - Girdap 10 s ve steril filtre için ouabain çözümleri (yani, 0.22 μm şırınga ucu filtre) ayrı, yeni mikrosantrifüj tüpler içine, her çözüm için farklı bir filtre kullanarak.
- Boş ozmotik pompaları akış moderatörü (yaklaşık 0,4 g) ile birlikte tartın.
- 1 mL'lik bir şırıngayı 27 G dolum kanülü (tercihen künt uçlu) ile steril filtreli ouabain solüsyonu veya araç çözeltisi ile doldurun.
- Şırınga dan tüm hava kabarcıkları alın, dik bir pozisyonda ozmotik pompa tutun, pompa içine kanül tüm yol takın ve aşırı çözelti üstüne görünene kadar yavaş yavaş rezervuar doldurun (bu pompa hava kabarcıkları yol açabilir gibi hızlı dolum kaçının). Daha sonra, akış moderatörüne pompaya takın (fazla çözüm üstte görünmelidir).
- Akış moderatörünü (yaklaşık 5 mm) dışarı çekin, makasla beyaz flanşı dikkatlice çıkarve akış moderatörüne bir vinil boru parçası bağlayın. Kateterin hayvanın düzgün hareket etmesini sağlamak için yaklaşık 2 cm uzunluğa sahip olduğundan emin olun.
- Dolu ve boş pompa arasındaki ağırlık farkı yüklenen çözeltinin beklenen ağırlığı ile uyumlu olduğundan emin olmak için dolu ozmotik pompa bir kez daha tartın.
NOT: Çoğu sulu çözeltiiçin bu ağırlık mikrolitredeki hacme eşittir. Ağırlık beklenen hacimle uyuşmuyorsa, hava pompanın içinde sıkışıp kalabilir ve bu da boşaltılması ve doldurulması gerekir. - Pompaların astariçin, iki 2 mL mikrosantrifüj tüpleri, striatum için bir tüp ve beyincik için bir hazırlamak.
- Pompaları %0,9 tuzlu çözeltiile yarı yolda doldurulmuş mikrosentrifuge tüplere batırın. Kateterin açık ucunu batırmayın. Mikrosentrifuge tüplerini 37 °C'de 48 saat boyunca bir termocycler'a yerleştirin ve pompanın implantasyondan önce sabit bir pompalama hızına ulaştığından ve kateterlerin önceden doldurulduğundan emin olun.
2. Kanül ve ozmotik pompa implantasyonu
- Fareyi (erkek, C57Bl/6N, 11-12 haftalık yaş) inhalasyon anestezisi için tasarlanmış bir odaya yerleştirin; isoflurane akış hızını %2-3'e, oksijen akış hızını da 2 L/dk'ya ayarlayın.
- Fare onaylanan protokollere göre derinden uyuşturulup, hayvanın başının üst kısmını, sırt boynunu ve sırtın proksimal üçte birini tıraş edin.
- Hayvanı stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin ve stereotaktik alet için tasarlanmış bir fare anestezi maskesi (isofluran akış hızı %1.5-2, 2 L/dk oksijen) ile anesteziye devam edin.
- Kauçuk uçlar veya yırtılmayan kulak çubukları kullanarak, stereotaktik çerçeve içinde hayvanın başını düzeltmek, baş tesviye dikkat.
- Hipotermiyi önlemek için, hayvanın altına bir ısıtma yastığı yerleştirin, rektal sıcaklık sondası yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın. Her göz de oftalmik merhem bir damla kullanarak kuruyan hayvanın gözlerini koruyun.
- Cerrahiye başlamadan önce karprofen (5 mg/kg vücut ağırlığı) gibi bir analjezik uygulayın.
- Bir şırınga ile subkutan 0.2 mL bupivacaine 0.25% kadar enjekte ve lokal anestezi etkili olması için 30 s bekleyin.
- Oktaniddin dihidroklorür gibi bir antiseptik ile iyice tıraş alanları dezenfekte.
- Cerrahi alanın iyice dezenfeksiyonundan sonra, başın üst kısmında bir kesi yerleştirmek için bir neşter kullanın ve ön bacaklara kadar kesi devam etmek için makas kullanın. Bulldog kelepçeler yardımıyla kafatası ortaya ve steril bir pamuk uçlu aplikatör ile periost silin.
- Bregma ile siyah mürekkeple boyanmış bir kalemi veya kanülün ucunu hizalayın ve kafatasındaki beyin kanülleri için üç giriş noktasını işaretlemek için uygun koordinatları kullanın (bazal gangliaperfüzyonu için gerekli ikili delikleriçin koordinatlar: anterior/posterior: + 0,74 mm, medial/lateral: +/- 1.50 mm (+ sağ tarafı gösteren, - bregma göre sol tarafı); beyincik orta hattında delik koordinatları: anterior / posterior: - 6.90 mm). Daha sonra, bazal gangliyonlar için belirlenen çift kanül ve beyincik için belirlenen tek kanül için delikleri dikkatlice delin (Şekil 1A).
- Striatum ve beyincik arasında küçük bir vida için dördüncü bir delik delin. Bu vida sonunda diş çimentogömülü olacak ve kanüller için ek tutun sağlar. İnce çifenler ve bir tornavida kullanarak, vidayı kafatasında sıkıca sabitlene kadar küçük deliğe dikkatlice tanıtın. Beyin dokusuna zarar verirken vidayı çok derine yerleştirmeyin.
NOT: Ozmotik kanüller takmadan önce ozmotik pompa implantasyonuna devam edilmesi önerilir. Bu, pompaları yerleştirirken kanüllerde kazara hasara yol açmalarını önler. - Hayvanların her iki tarafında ozmotik pompa için küçük bir cep oluşturmak için, deri altı doku katmanları ayırmak için doku forseps kullanın. Bir arka bacak doğru forceps ilerleyin ve deri altı cebi genişletmek için biraz forceps açın. Diğer taraf için aynı işlemi tekrarlayın, önce forsepsleri kesiden çıkarıp sonra yavaşça ikinci arka baca doğru itin.
NOT: Cep kolayca slayt pompa izin vermelidir, ancak, cilt altında taşımak için çok fazla oda olmamalıdır. - Doku forceps yardımıyla boru bağlı parça ile birlikte ilk pompa almak ve bir deri altı cebine kaydırın. İkinci pompa ile aynı işlemi tekrarlayın.
- Bir minipump tutucu kullanarak, beyincik orta hattında delinmiş delik içine 3,0 mm özel uzunlukta tek bir ozmotik kanül tanıtmak. Kanül başını dikkatlice ayırın ve kanül yanı sıra diş çimentosu ile küçük vida düzeltmek, ozmotik pompa boru için bağlantı parçası kapsayacak şekilde değil dikkat. Kanül çevresindeki diş çimentosu ameliyata devam etmeden önce tamamen kurudu.
- Bazal ganglianın üzerinde iki kez delinmiş deliklere 3,0 mm merkezden merkeze uzaklığa ve özel olarak yapılmış 4,0 mm uzunluğunda bir çift kanül takmadan önce, çift kanülün iki bağlantı parçasına iki kısa vinil boru parçası (0,5 cm) takın. Vinil boruları çatallanma adaptörü ile bağlayın ve adaptör ve kanül ile ouabain solüsyonu veya araç (oda sıcaklığı, steril önceden filtrelenmiş) dahil olmak üzere tüm tüp sistemini dikkatlice önceden doldurun. Bu en iyi 1 mL şırınga ve 27 G dolgu kanül bifurkasyon adaptörü tek arka ucuna tanıtıldı ile yapılabilir (Şekil 1B).
- Bir minipump tutucu kullanarak, çift kanülü dikkatlice çift deliklere takın. Kanül başını ayırmak ve diş çimentosu ile çift kanül düzeltmek için bir kelepçe kullanın.
- Ozmotik pompaların kateterlerini çatallanma adaptörüne ve tek kanüle bağlayın. Kateterlerin kanüllerin bağlantı parçaları üzerinde güçlü bir tutuna sahip olduğundan emin olun.
NOT: Her iki pompa da eşit akış hızına sahiptir, bu nedenle aynı konsantrasyonun hem bazal ganglia hem de beyincik lere ulaşmasını sağlamak için ozmotik pompayı çatallanma adaptörüne çift konsantre çözeltiile bağlamaya dikkat edin. - Hayvanların arkasındaki kesiyi kafatası yönünde mümkün olduğunca dikişlerle kapatın, deriyi aşırı uzatmamaya dikkat edin(Şekil 1C).
- Farelerin susuz kalmamasını önlemek için, vücut ısısı olması gereken %0,9 tuzlu nun 0,5 mL'sini hayvanların arka tarafındaki bir deri kıvrımına dikkatlice enjekte edin.
3. Motor mücadelesi
- Konu ouabain- veya araç-hafif strese maruz kalma bir formu olarak zorlu motor görevleri için perfüzyon fareler 4 saat ameliyat sonrası ve tekrartekrar her 24 saat sonra distoni benzeri hareketleri ikna etmek için. Bu davranışsal bir karakterizasyon içermez; amacı normal kafes tutma ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir stres düzeyi neden etmektir.
- Fareyi 50 cm'lik pürüzlü yüzeyli, 1 cm çapında, burnu aşağıya bakan ahşap bir direğe yerleştirin. Kutup düşme durumunda yeterli yatak ile büyük bir kafes içine yerleştirilir emin olun. Bu iniş süresini ölçmek için gerekli değildir, ancak kutup inerken ouabain perfüzyon hayvanlar tarafından sunulan ön uzuvlar ve arka bacaklar istemsiz hiperuzantıları için dikkat edin. Fareler kutup üç kez inin ve iner arasında kurtarma 2 dakika izin verelim.
NOT: Ouabain perfüzyon fareler bradikinezi gibi ilk belirtiler sunmalıdır 4 saat ameliyat sonrası. Ancak, ameliyattan 24 saat sonra fareler inme sırasında distoni benzeri hareketlerin bir işareti olarak ön ekstremite ve arka ekstremitelerin istemsiz hiperuzantıları sunmaya başlamalıdır. - İkinci motor görevi için, rotarod performans testi için yapılan döner çubuk üzerinde fareler yerleştirin. Rotarod cihazı düşme gecikmesinin bir ölçüsü olarak kullanılmaz, amaç fareleri zorla aktiviteye tabi tatmaktır. Fareleri üç kez dönen çubuk üzerine yerleştirin ve testler arasında 2 dakika iyileşmeye izin verin.
NOT: Strese maruz kalmayı artırmak için hızlanan bir Rotarod cihazı kullanın. Burada açıklanan proje için çubuk, 300 sn'lik belirli bir süre içinde 5'ten 50 rpm'ye kadar hızlanır. - Hayvanlar kutup testi ve Rotarod performans testi arasında 30 dakika boyunca ve yine başka bir 30 dk için protokol adım 4 altında açıklandığı gibi distoni benzeri hareketler için puanlama önce kurtarAlım. Tekrarlayan stres maruziyetleri arasında, farelerin 24 saat aralıklarla iyileşmesini bekleyin.
4. Distoni benzeri hareketlerin değerlendirilmesi için puanlama sistemleri
NOT: Deneyci, önyargıyı önlemek için analiz edilen grup atamasına kör edilmelidir. Farelerin fenotipini karakterize etmek için kullanılan davranıştestleri iki skorlama sistemidir: anormal, distoni benzeri hareketler ve kuyruk süspansiyon testi kullanılarak davranışsal skor olan bir distoni derecelendirme ölçeği. Hafif strese maruz kaldıktan sonra 30 dakikalık bir iyileşme süresinden sonra distoni benzeri hareketleri değerlendirin.
- Distoni derecelendirme ölçeği
NOT: Önceden tanımlanmış davranışsal görevlerin olmaması nedeniyle, distoni derecelendirme ölçeği, insan distonisinin klinik derecelendirme ölçeklerine benzer gözlemci tabanlı bir puanlama sistemi olarak kurulmuştur. Calderon ve ark.13tarafından kullanılan distoni derecelendirme ölçeğinin değiştirilmiş bir versiyonudur.- Hayvanlar plastik veya ahşap bir kutuya yerleştirildikten sonra 4 dk'lık bir süre boyunca hayvanların duruşunu ve yürüyüşlerini kaydedin.
- Distoni benzeri hareketlerin 0'dan 4 puana kadar sıklığı ve dağılımı için puan: (0) normal motor davranışı; (1) anormal motor davranış, hiçbir distoni benzeri hareketler; (2) hafif fokal distoni benzeri hareketleri ile hafif motor bozukluğu; (3) şiddetli fokal distoni benzeri hareketleri ile orta motor bozukluk; (4) şiddetli bozukluk, sürekli, yaygın distoni benzeri hareketler(Şekil 2). Aşağıdaki hareketleri veya duruşları distoni benzeri olarak düşünün: ön ekstremitelerin hiperuzantısı, geniş duruş veya arka ekstremitelerin hiperuzantısı ve kifoz. Tek bir vücut parçasının etkilenmesi ve gövde nin ve en az iki diğer vücut parçasının etkilenmesi durumunda distopiyi odak noktası olarak düşünün.
- Kuyruk süspansiyon testi
NOT: Kuyruk süspansiyon testi genellikle gözlemlemek ve arka bacak clasping için puan kullanılır. Ancak bu, bir motor bozukluğu gösteren son derece belirsiz bir fenotiptir. Aşağıdaki protokol, distoni benzeri hareketlere özgü bir puanlama sistemi önermektedir. DYT/PARK-ATP1A3 hastalarında distoni yaygınlaşması nedeniyle ön ekstremitelerde, gövde ve arka ekstremitelerde distoni benzeri hareketler değerlendirilmelidir. 0-8 puan arasında yeni geliştirilen puanlama sistemi geliştirildi, toplam skor < 2 distoni benzeri hareketlerin olmadığını göstermiştir(Şekil 3).- Fareyi tabanına yakın kuyruk tarafından almak ve hayvan kaldırın. Kuyruk süspansiyon testinin 2 dk'lık videosunu kaydedin ve kaydın sonraki kapsamlı analizinde bir puan atayın.
- Bir veya her iki ön uzuvların tekrarlanan veya sürekli tonik geri çekilmelerinin yanı sıra ön uzuvların geçişiile birlikte hiperuzantısı distoni benzeri olarak sınıflandırılır: (0) hiçbir anormal hareketler; (1) kaydedilen sürenin ≥ % 50 görülen pençeleri hiperuzantısı ile ön ekstremitelerin azaltılmış hareketi; (2) ön ekstremite hafif distoni benzeri hareketleri(ler) < kaydedilen sürenin% 50; (3) ön ekstremite(ler) ≥ kaydedilen sürenin % 50'si veya şiddetli < kaydedilen sürenin %50'si; (4) ön ekstremite(ler) ≥ kaydedilen zaman% 50 şiddetli distoni benzeri hareketleri.
NOT: Hindlimb clasping distoni gibi puan olmamalıdır anormal bir harekettir. - Arka ekstremitelerin geri çekilmesi ve sıkıldığı ve sürekli hiperuzantısı distoni benzeri olarak değerlendirildiği 0'dan 3'e kadar puan: (0) anormal hareketler yok; (1) kaydedilen sürenin ≥ %50'si görülen patilerin hiperuzantısı ile arka ekstremitelerin hareketini azaltmış; (2) bir arka bacak distoni benzeri hareketleri; (3) her iki arka bacakta dadiston benzeri hareketler.
- Truncal distorsiyon > kaydedilen sürenin %80'i durumunda skora ek bir puan eklenir.
- Hayvanı tekrar kafesine yerleştirin.
Representative Results
Şekil 4 Rauschenberger ve ark.17değiştirilmiştir. Hem distoni derecelendirme ölçeğinin(A)hem de kuyruk süspansiyon testinin(B)veri analizi için, her hayvan için her zaman puanının toplam Puanını hesaplayın. Her zaman noktasının ve her grubun ortalaması uygun bir grafik üzerinde çizilmelidir. Değerlerin dağılımı araştırılmalı ve önemi belirlemek için uygun istatistiksel test uygulanmalıdır. Yeterli sayıda hayvanla, hem distoni derecelendirme ölçeğinde hem de kuyruk süspansiyon testinde anormal hareketlerin değerlendirilmesi ile bir motor fenotip saptanabilir. Distoni benzeri fenotip ouabain perfüzyon, stresli grup ouabain perfüzyon, stresli olmayan fareler yanı sıra kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında her iki değerlendirmede önemli ölçüde daha yüksek motor skoru ile gösterilmiştir.
Şekil 1: Kanül ve ozmotik pompa implantasyonu için ana cerrahi adımlar. (A) Belirtilen koordinatlar için bazal gangliyon için belirlenen çift kanül ve beyincik orta hattına yerleştirilen tek kanül için deliklerin iki taraflı olarak delinmeleri gerekir. İki tam inşa ozmotik pompalar hayvanın her iki tarafında gösterilir. (B) Resim, diş çimentosu ile sabit beyincik içine implante, tek kanül gösterir. Bazal gangliyonun çift kanülü çatallanma adaptörüne bağlanmalı ve implantasyondan önce ouabain ile önceden doldurulmalıdır. (C) Tamamlanan yordamın görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Distoni benzeri hareketlerin distoni derecelendirme ölçeği ile değerlendirilmesi. 4 dk video sırasında, distoni benzeri hareketler vücut dağılımı ve süresine göre puanlandı. Ön ekstremitelerin istemsiz hiperuzantısı, geniş bir duruş veya arka ekstremitelerin hiperuzantısı ve kifoz distoni benzeri olarak değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kuyruk süspansiyon testi sırasında distoni benzeri hareketlerin değerlendirilmesi. 2 dk kuyruk süspansiyon testi sırasında anormal hareketler için yeni geliştirilen skorlama sistemi, ön ekstremitelerde, arka bacaklarda ve gövdede distoni benzeri hareketleri toplamda 0-8 puan dan değerlendirir. Ön ekstremiteler için, bir hiperuzantısı ve ön ekstremite geçiş yanı sıra gövde doğru bir tonik fleksiyon distoni gibi nitelikli. Arka bacaklar için istemsiz hiperuzatma yanı sıra orta hat üzerinde uzantısı ile retraksiyon distoni gibi olarak puanlandı. Kaydedilen sürenin %80'inden fazla bir truncal distorsiyon bir puanla puanlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Distoni derecelendirme ölçeğinin ve kuyruk süspansiyon testinin temsili grafikleri. (A)Grafik, NaCl-perfüzyon, stresli fareler (noktalı siyah çizgi), ouabain perfüzyon, non-stresli fareler (noktalı turuncu çizgi) ve ouabain-perfüzyon, stresli fareler (koyu mavi çizgi) için distoni-derecelendirme ölçeğini tasvir eder. Her zaman noktası için ortalama (SEM) ortalama değerleri ± standart hatası gösterilir. (B) Diyagram, NaCl-perfüzyon, stresli fareler (noktalı siyah çizgi), ouabain perfüzyon, stresli olmayan fareler (noktalı turuncu çizgi) ve ouabain perfüzyon, stresli fareler (koyu mavi çizgi) için 2 dakikalık kuyruk süspansiyon testi sırasında anormal hareketlerin değerlendirilmesi gösterir. İki kuyruklu Mann-Whitney testi kullanılarak distoni derecelendirme ölçeği ve kuyruk süspansiyon testi için istatistiksel analiz yapıldı. Bonferroni-Holm düzeltme (§) p-değerleri 72 h gözlemsel dönem için önemli bir fark gösterdi. Lacivert * ouabain perfüzyon, stresli fareler ve ouabain perfüzyon, non-stresli fareler, siyah * NaCl-perfüzyon arasında önemli farklılıklar belirtmek, stresli fareler ve ouabain perfüzyon, stresli fareler yanı sıra NaCl-perfüzyon arasında stresli, stresli fareler ve ouabain perfüzyon, non-stresli fareler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu DYT/PARK-ATP1A3 farmakolojik fare modeli, sadece bazal gangliyon ve serebellumdaki sodyum-potasyum iyon pompasının inhibisyonu ve strese maruz kalma ile ilgili değişiklikler le intihal ile indüklenen intraserebral yapısal ve nörokimyasal değişikliklerin ayrıntılı analizini sağlar. Farelerde en fazla iki ozmotik pompa subkutan olarak implante edilebilir. Burada, tek bir kanüle ek olarak çataldan külasyon adaptöre bağlı çift kanül uygulayarak birden fazla beyin yapısına kronik ilaç teslimatını ayrıntılı olarak anlatan bir yöntem salıyoruz. Bu metodoloji aynı anda ve kronik olarak birden fazla beyin yapısının perfüzyon gerektiren herhangi bir uygulama için kullanılabilir.
Biz nadir bir hareket bozukluğu bir fare modeli salıyoruz, hastaların strese maruz kaldıktan sonra kalıcı belirtiler geliştirmek nerede. Bu tahmin gen-çevre etkileşimi hala iyi anlaşılamamıştır, ancak DYT/PARK-ATP1A3 gelişimindeki temel patomekanizmalarından birini temsil edebilir. Farelerin strese maruz kalmanın farklı yöntemleri geçmişte yayınlanmıştır ve elektrik ayak şokları, kısıtlama, soğuk veya sıcak ortam ve çeşitli kokulara maruz kalma11,12,13. Fareleri çeviri değeri olan hafif bir stres faktörüne maruz bırakmak amacıyla, farelerin zorlu motor görevlere tekrarlayan öznel öznelliğini burada açıklıyoruz. Kutup testi için, ouabain perfüzyon hayvanlar ön ekstremite ve arka bacaklar istemsiz hiperuzantısı ortaya. Bu hareketler, hayvanların 4 dakikalık video kaydı ve kuyruk süspansiyon testi sırasında gözlenen distoni benzeri hareketlere çok benziyordu. Zorlu motor görevler şeklinde hafif stres uygulanması motor belirtileri veya nörodejenerasyon gösteren diğer fare modellerinde yararlı olabilir, gen-çevresel etkileşimleri büyük ölçüde hastalığın ilerleme derecesini etkileyen nerede.
Farelerde anormal hareketleri ve duruşları sınıflandırmak için önceden tanımlanmış davranış görevlerinin yanı sıra derecelendirme ölçeklerinde genel bir eksiklik vardır. Mevcut motor görevlerin çoğu nörodejenerasyon ile hareket bozukluklarının birçok fare modellerinde iyi bilinen bir fenomen olan hindlimb clasping gibi, spesifik olmayan anormallikler ortaya18,19. Bir fenotipin doğru karakterizasyonu için, fare modelinin hastalığın belirgin özelliklerini özetleyip özetlemediğini analiz etmek gerekir. Burada, distoni fare modellerinde motor özürlülük değerlendirmesi için daha önce kullanılan bir distoni derecelendirme ölçeğinin değiştirilmiş sürümünü salıyoruz15,16. Ayrıca kuyruk süspansiyon testi için insan distonisinin klinik derecelendirme ölçeklerine benzer şekilde kurulmuş gözlemci tabanlı bir skorlama sistemi geliştirdik. Her iki derecelendirme ölçekleri ouabain perfüzyon, stresli fareler ouabain perfüzyon, stresli olmayan hayvanların yanı sıra araç perfüzyon hayvanlara göre önemli ölçüde daha yüksek bir puan göstermektedir. Herhangi bir gözlemci tabanlı puanlama sisteminin sakıncaları, tutarlı puanlama sağlamak ve gözlemci değişkenliğini azaltmak ve analiz edilen gruba tamamen kör değilse, orantörün olası bir önyargısı tehlikesini azaltmak için gerekli eğitimlerdir. Ancak, gözlemci tabanlı puanlama sistemleri hala bir fenotip karakterize etmek için kolay erişilebilir bir yöntem mevcut ve analiz fare modeli adapte edilebilir, distoni benzeri hareketlerin değerlendirilmesi için mevcut projede yapıldığı gibi. Farklı puanlayıcılar arasında tutarlı puanlama sağlamak için, eğitim videoları kullanılabilir yapılmalıdır. Herhangi bir potansiyel önyargıyı azaltmak için, farklı puanlayıcıların aynı video klipleri puanlaması ve tek tek puanların ortalaması nın olması önerilir. Bu çalışmada bahsedilen her iki skorlama sistemi hayvanlarda distoni benzeri hareketlerin varlığını kaydeder. Derecelendirme ölçekleri, daha önce Ip ve ark.'nın yaptığı gibi, bir projedeki özel gereksinimlere göre uyarlanabilir, burada distoni 1 (DYT-TOR1A)20için bir fare modelinde distoni benzeri hareketler için sadece arka bacaklar puanlanmıştır. Derecelendirme ölçekleri diğer daha önce yayınlanmış puanlama sistemleri ile tamamlanabilir, örneğin kemirgenlerde bradikinezi derecesini değerlendiren Calderon ve ark.13tarafından locomotion sakatlık puanı ile yapılır .
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF DysTract to C.W.I.) ve Würzburg Üniversitesi'ndeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) (Z2-CSP3'ten L.R.'a) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger ve Heike Menzel'e ve teknik yardımları için helga Brünner'e hayvan bakımı için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
