Summary
Vi tilbyr en protokoll for å generere en farmakologisk DYT / PARK-ATP1A3 dystoni mus modell via implantasjon av kanyler i basale ganglier og lillehjernen koblet til osmotiske pumper. Vi beskriver induksjonen av dystonilignende bevegelser ved bruk av en motorutfordring og karakterisering av fenotypen via atferdspoengsystemer.
Abstract
Genmodifiserte musemodeller står overfor begrensninger, spesielt når man studerer bevegelsesforstyrrelser, hvor de fleste tilgjengelige transgene gnagermodeller ikke presenterer en motorfenotype som ligner de kliniske aspektene ved den menneskelige sykdommen. Farmakologiske musemodeller gir mulighet for en mer direkte studie av pathomechanisms og deres effekt på atferdsfenotypen. Osmotiske pumper koblet til hjernekanyler åpner muligheten for å lage farmakologiske musemodeller via lokal og kronisk legemiddellevering. For den arvelige bevegelsesforstyrrelsen av rask dystoni-parkinsonisme kan tap av funksjonsmutasjon i α3-underenheten av Na+/ K+-ATPase simuleres av en svært spesifikk blokade via glykosidabain. For å lokalt blokkere α3-underenheten i basalgangliene og lillehjernen, som er de to hjernestrukturene som antas å være tungt involvert i patogenesen av rask dystoni-parkinsonisme, blir en bilateral kanyle stereotaxisk implantert inn i striatum og en ekstra enkelt kanyle blir introdusert i lillehjernen. Kanylene er koblet via vinylrør til to osmotiske pumper, som er subkutant implantert på baksiden av dyrene og tillater kronisk og presis levering av ouabain. Den farmakologiske musemodellen for rask dystoni-parkinsonisme bærer den ekstra fordelen av å rekatolere de kliniske og patologiske egenskapene til asymptomatiske og symptomatiske mutasjonsbærere. Akkurat som mutasjonsbærere av rask dystoni parkinsonisme utvikler ouabain-perfused musene dystonilignende bevegelser først etter ytterligere eksponering for stress. Vi viser et mildt stressparadigme og introduserer to modifiserte poengsystemer for vurdering av en motorfenotype.
Introduction
Fordelene med en kontinuerlig legemiddellevering direkte inn i hjernen er mange. Repeterende og hyppige injeksjoner, som representerer en unødvendig stressfaktor for dyr, kan unngås og en mer konstant intracerebral konsentrasjon av stoffet kan oppnås. Dette er spesielt gyldig når systemisk administrerte legemidler ikke lett trenger inn i blodhjernsbarrieren. Videre, kronisk narkotika levering via osmotiske pumper gjør det mulig for lokalisert levering av substrater som ellers ville ha systemomfattende bivirkninger. Legemidlene kan leveres på en målrettet måte til de ønskede hjernestrukturene, den resulterende effekten kan dermed spores direkte. Dette kan benyttes for en rekke applikasjoner, for eksempel studiet av terapeutiske effekter samt studiet av pathomechanisms. Denne siste applikasjonen ble brukt i prosjektet heri for å lage en farmakologisk musemodell for dystoni.
Analysen og forståelsen av dystoniske syndromer, som representerer den tredje vanligste bevegelsesforstyrrelsen, har vært sterkt begrenset av det faktum at genetiske dyremodeller i stor grad ikke klarer å reprodusere sykdommen fenotype som finnes i syke mennesker, så vel som patofysiologien. Dette problemet er ikke begrenset til dystoniske syndromer, men faktisk gjelder mange transgene gnagermodeller innen bevegelsesforstyrrelser1,2. Årsaken til mangelen på fenotype i transgene gnagermodeller kan være basert på svært effektive kompenserende mekanismer3. I tilfelle av dystoni er sykdommen preget av ufrivillige muskelsammentrekninger som forårsaker vridning bevegelser og unormale stillinger4. Studien av sekundære årsaker (f.eks. hjerneskade) av dystoniske symptomer, har bidratt til å identifisere strukturene som er involvert i manifestasjonen av disse motoriske abnormitetene, for eksempel basal ganglia5. Hjerneavbildningsstudier av arvelige former for dystoni har vist funksjonelle abnormiteter i nesten alle hjerneregioner som er ansvarlige for motorkontroll og sensoriskintegrasjon 6,,7. Imidlertid er gnagermodeller fortsatt nødvendig for å utdype forståelsen av nevrale dysfunksjoner på molekylært og stort nettverksnivå, samt for utvikling av terapeutiske alternativer. Det er her farmakologiske musemodeller gir mulighet til å gjenskape de kliniske og patologiske egenskapene til en sykdom på en mer presis måte.
Rask dystoni-parkinsonisme (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) er en av de arvelige former for dystoni. Det er forårsaket av tap av funksjonsmutasjoner i ATP1α3-genet, som koder for α3-underenheten til Na+/K+-ATPase8. Videre er det anerkjent at genmutasjonsbærere kan være fri for symptomer i mange år før de akutt utvikler vedvarende generalisert dystoni og parkinsonisme etter eksponering for en stressende hendelse. Faktisk er penetrance av DYT / PARK-ATP1A3 ufullstendige og stressende hendelser som fungerer som en utløser varierer fra fysisk overexertion og ekstreme temperaturer til overforbruk av alkohol og infeksjoner9,10. For å studere DYT / PARK-ATP1A3 og for å finne potensielle terapeutiske inngrep, har det blitt prøvd mange ganger for å etterligne stressavhengig sykdomsutvikling i gnagermodeller. Men bortsett fra den eksisterende genetiske DYT / PARK-ATP1A3 musemodellen, hvor forbigående unormale og krampelignende bevegelser ble indusert av hypotermi, har alle publiserte genetiske musemodeller for DYT / PARK-ATP1A3 ikke klart å produsere dystoniske symptomer1,11,12. Calderon et al. har tidligere vist at blokkering av α3-underenheten bilateralt i basalgangliaene og lillehjernen via hjerteglykosid ouabain hos villtypemus resulterer i mild gangforstyrrelse13. Den ekstra eksponeringen for elektriske fotstøt i et varmt miljø førte til en dystonisk og bradykinetisk fenotype, og viste dermed at kronisk og målrettet perfusjon av ouabain etterfulgt av stress imiterer DYT / PARK-ATP1A3 fenotype.
Men å utsette dyr for elektriske fotstøt i et varmt miljø på 38-40 ° C over en to timers periode induserer smerte og angst hos dyr, noe som representerer forvirrende faktorer, spesielt for vurdering av endringer i katekolaminsystemet knyttet til utvikling av dystoni. Dermed beskriver vi her en annen type stressparadigme med høy translasjonell verdi, som relaterer seg tilbake til det faktum at mild til moderat trening har blitt beskrevet som utløsere hos DYT / PARK-ATP1A3 pasienter9. Videre er repeterende trening en velkjent utløser for fokal dystoni14. Mus ble gjentatte ganger utsatt for utfordrende motoriske oppgaver bestående av tre nedstammer av en trestang ("pole test") og tre løp på et Rotarod-apparat ("Rotarod ytelsestest"). Plasseringen av dyr på toppen av en 50 cm trestang ble brukt til å tvinge dyrene til å stige ned, Rotarod-apparatet ble ansatt for å utsette mus for tvungen aktivitet ved å plassere dem på en roterende stang.
Karakteriseringen av motorfenotypen til en musemodell for dystoni er spesielt utfordrende på grunn av mangel på forhåndsdefinerte tester og score. Imidlertid har en variant av en motorisk funksjonshemmingsvurdering gjentatte ganger blitt brukt i løpet av de siste årene for å evaluere alvorlighetsgraden og fordelingen av dystonilignende bevegelser hos gnagere13,,15,,16. Vi presenterer her en modifisert versjon av dystonivurderingsskalaen, som viste seg å være effektiv i evalueringen av dystonilignende fenotype dyr når det observeres over en tidsperiode på fire minutter. Som en annen metode for å vurdere dystonilignende bevegelser, presenterer vi et nyutviklet poengsystem for vurdering av unormale bevegelser under en halefjæringstest. Det gjør det mulig å vurdering av hyppigheten og varigheten av dystonilignende bevegelser og stillinger av de fremre lemmer, bakben samt trunk.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med gjeldende internasjonale, nasjonale og/eller institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av dyr. De lokale myndighetene ved Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland, godkjente alle dyreforsøk.
1. Grunning av osmotiske pumper
MERK: Dette trinnet må utføres minst 48 timer før operasjonen. ALZET osmotiske pumper må forhåndsfylles for å sikre at pumpehastigheten når en jevn tilstand før implantasjon.
- Forbered ønsket løsning for kronisk perfusjon på forhånd. Kontroller at oppløsningsvæsken og midlet er kompatible med osmotiske pumper og katetre. For prosjektet heri, tine en 10x lagerløsning av ouabain (lagret ved -20 °C) ved romtemperatur og virvel i 10 s.
FORSIKTIG: Ouabain er giftig: Den skal kun håndteres med hansker og åpnes bare under en steril hette for å unngå innånding. - Slå på den sterile hetten; desinfisere hetten samt alle instrumentene og materialet som trengs før du legger dem under panseret.
- Ta på deg kirurgiske hansker før du håndterer osmotiske pumper. Separat forberede ouabain-løsning utpekt for pumpene i striatum og lillehjernen.
MERK: Tenk på at konsentrasjonen av oppløsningen i pumpen for striatum må dobles sammenlignet med konsentrasjonen av oppløsningen i pumpen som er utpekt for lillehjernen. Dette skyldes det faktum at pumpen for striatum er koblet til en dobbel kanyle, strømningshastigheten er imidlertid den samme som for pumpen av lillehjernen, som er koblet til en enkelt kanyle. - Beregn mengden løsning som trengs ved hjelp av følgende formel:
masseleveringshastighet (ko) = volumleveringshastighet (Q) x konsentrasjon av agenten i kjøretøyet (Cd)
For det nåværende prosjektet ble osmotiske pumper primet og fylt med enten ouabainløsning med en konsentrasjon på 11,2 ng / t eller 0,9% saltvann for kontrollgruppen. - Vortex både ouabain-løsninger for 10 s og sterilt filter (f.eks. 0,22 μm sprøyte-end filter) dem i separate, nye mikrocentrifuge rør, ved hjelp av et annet filter for hver løsning.
- Vei de tomme osmotiske pumpene sammen med strømningsmoderatoren (ca. 0,4 g).
- Fyll en 1 ml sprøyte med en 27 G fyllingsmetel (helst med en stump spiss) med steril filtrert ouabain-løsning eller kjøretøyløsning.
- Få alle luftboblene ut av sprøyten, hold den osmotiske pumpen i oppreist stilling, sett kanylen helt inn i pumpen og fyll sakte reservoaret til overflødig oppløsning vises på toppen (unngå rask fylling, da dette kan føre til luftbobler i pumpen). Deretter setter du strømningsmoderatoren inn i pumpen (overflødig løsning skal vises på toppen).
- Trekk strømningsmoderatoren ut (ca. 5 mm), ta forsiktig av den hvite flensen med saks og koble et stykke vinylrør til strømningsmoderatoren. Sørg for at kateteret har en lengde på ca. 2 cm for å tillate riktig mobilitet av dyret.
- Vei den fylte osmotiske pumpen igjen for å sikre at forskjellen i vekt mellom fylt og tom pumpe er konkordant med den forventede vekten av den som er lastet.
MERK: For de fleste vandige løsninger er denne vekten lik volumet i mikroliter. Hvis vekten ikke samsvarer med forventet volum, kan det hende at luft blir fanget inne i pumpen, som må tømmes og etterfylles. - For grunning av pumpene, forberede to 2 ml mikrocentrifuge rør, ett rør for striatum og en for lillehjernen.
- Senk pumpene ned i mikrocentrifugerørene som er fylt halvveis med 0,9 % saltvannsløsning. Ikke senk den åpne enden av kateteret ned. Sett mikrocentrifugerørene i en termocycler i 48 timer ved 37 °C for å sikre at pumpen har nådd en jevn pumpehastighet før implantasjon og kateterene er forhåndsutfylt.
2. Kanyle og osmotisk pumpeimplantasjon
- Plasser musen (mann, C57Bl/6N, 11-12 uker) i et kammer designet for innånding anestesi; sette strømningshastigheten til isofluran til 2-3% og strømningshastigheten av oksygen til 2 L / min.
- Etter at musen er dypt bedøvet i henhold til godkjente protokoller, barber toppen av dyrets hode, rygghals og proksimal tredjedel av ryggen.
- Plasser dyret i en stereotaktisk ramme og fortsett anestesi med isofluran via en museanestesimaske designet for stereotaktisk instrument (isofluranstrømningshastighet 1,5-2%, 2 L / min oksygen).
- Bruk gummispisser eller ikke-bruddørestenger, fest dyrets hode i stereotaktisk ramme, og ta vare på at hodet er jevnet.
- For å forhindre hypotermi, plasser en varmepute under dyret, sett inn en rektal temperaturprobe og sett temperaturen til 37 °C. Beskytt dyrets øyne mot å tørke ut ved hjelp av en dråpe oftalmisk salve på hvert øye.
- Påfør et smertestillende, som Carprofen (5 mg/kg kroppsvekt), subkutant før operasjonen begynner.
- Med en sprøyte subkutant injisere opptil 0,2 ml bupivakain 0,25% og vent 30 s for lokalbedøvelse å tre i kraft.
- Desinfiser de barberte områdene grundig med et antiseptisk middel, for eksempel okenidindikhydroklorid.
- Etter grundig desinfeksjon av det kirurgiske området, bruk en skalpell til å plassere et snitt på toppen av hodet og bruk saks for å fortsette snittet ned til forbenene. Utsett skallen ved hjelp av bulldogklemmer og tørk periosteum med en steril bomullstippet applikator.
- Juster enten en penn eller spissen av en kanyle farget i svart blekk med bregma og bruk de riktige koordinatene til å markere de tre inngangspunktene for hjernekanylene på skallen (koordinater for de bilaterale hullene som trengs for perfusjon av basalgangene: fremre / bakre: + 0,74 mm, medial/lateral: +/- 1,50 mm (+ indikerer høyre side, - venstre side i forhold til bregma); koordinater for hullet midt på cerebellum: fremre /bakre: - 6,90 mm). Deretter borer du forsiktig hullene for den doble kanylen som er utpekt for basalganglia og enkelt kanylen utpekt for lillehjernen (figur 1A).
- Bor et fjerde hull for en liten skrue mellom striatum og lillehjernen. Denne skruen vil til slutt bli innebygd i tannsement og gi ekstra tak for kanylene. Bruk fine tang og en skrutrekker, og sett forsiktig skruen inn i det lille hullet til den er godt festet i skallen. Ikke implanter skruen for dypt, da dette skader hjernevevet.
MERK: Det anbefales å fortsette med osmotisk pumpeimplantasjon før du setter inn de osmotiske kanylene. Dette unngår å forårsake utilsiktet skade på kanylene når du implanterer pumpene. - For å lage en liten lomme for den osmotiske pumpen på hver side av dyrene tilbake, bruk vevs tang for å skille de subkutane vevslagene. Før tangen mot ett bakben og åpne tangen litt for å utvide den subkutane lommen. Gjenta samme prosedyre for den andre siden, først fjerne tang fra snittet og deretter skyve dem forsiktig mot det andre bakbenet.
MERK: Lommen skal tillate pumpen å gli inn, men den bør ikke ha for mye plass til å bevege seg under huden. - Ved hjelp av vevs tang ta den første pumpen sammen med den tilkoblede stykke rør og skyve den inn i en subkutan lomme. Gjenta samme prosedyre med den andre pumpen.
- Bruk en minipumpeholder til å introdusere en enkelt osmotisk kanyle med en tilpasset lengde på 3,0 mm inn i hullet boret midt i lillehjernen. Ta av kanylehodet forsiktig og fest kanylen samt den lille skruen med tannsement, og ta vare på at det ikke dekker forbindelsesstykket for rørene til den osmotiske pumpen. Sørg for at tannsementen rundt kanylen er fullstendig tørket før du fortsetter med kirurgi.
- Før du setter inn en dobbel kanyle med en senter-til-sentrum avstand på 3,0 mm og skreddersydd lengde på 4,0 mm i bilateralt boret hull over basal ganglia, feste to korte stykker av vinyl rør (0,5 cm) til de to tilkoblingsbitene av den doble kanylen. Koble vinylrørene med en bifurcation adapter og nøye forhåndsfylle hele rørsystemet, inkludert adapteren og kanylen med ouabain løsning eller kjøretøy (romtemperatur, steril filtrert på forhånd). Dette kan gjøres best med en 1 ml sprøyte og en 27 G fyllingsmetral introdusert i den ene bakenden av bifurcation adapteren (Figur 1B).
- Bruk en minipumpeholder til å sette forsiktig den doble kanylen inn i de bilaterale hullene. Bruk en klemme til å løsne kanylehodet og fikse den doble kanylen med tannsement.
- Koble kateterene til osmotiske pumper til bifurcation adapter samt enkelt kanylen, henholdsvis. Sørg for at kateterne har et sterkt grep på de forbindelsesbitene på kanylene.
MERK: Begge pumpene har lik strømningshastighet, så vær forsiktig med å koble den osmotiske pumpen med den dobbeltkonsentrerte løsningen til bifurcation adapteren for å sikre at samme konsentrasjon når både basalganglia og lillehjernen. - Lukk snittet på baksiden av dyrene med masker så langt som mulig i retning av skallen, vær forsiktig så du ikke overstrekker huden (figur 1C).
- Injiser subkutant 0,5 ml 0,9% saltvann, som skal ha kroppstemperatur, inn i en hudfold på hver side av baksiden av dyrene for å unngå dehydrering av musene, og unngå pumpene forsiktig.
3. Motor utfordring
- Subjekt ouabain- eller kjøretøy-perfused mus til utfordrende motoriske oppgaver som en form for mild stresseksponering 4 timer etter operasjonen og repeterende hver 24 timer etterpå for å indusere dystonilignende bevegelser. Dette inkluderer ikke en atferdsmessig karakterisering. formålet er å indusere et høyere stressnivå sammenlignet med normal burholding.
- Plasser musen på en 50 cm grov overflate, trestang med en diameter på 1 cm, nesen vendt nedover. Sørg for at stangen er plassert i et stort bur med nok sengetøy i tilfelle fall. Det er ikke nødvendig å måle nedstigningstiden, men se opp for ufrivillige hyperextensions av fremre lemmer og bakben presentert av ouabain-perfused dyr mens du går ned i polen. La musene stige ned polen tre ganger og la 2 min utvinning mellom nedstammer.
MERK: Ouabain-perfused mus bør presentere første symptomer som bradykinesi 4 timer etter operasjonen. Imidlertid bør 24 timer etter operasjonen mus begynne å presentere ufrivillige hyperextensions av frontlemmer og bakben som et tegn på dystoni-lignende bevegelser under nedstigningen. - For den andre motoroppgaven, plasser mus på den roterende stangen som gjort for Rotarod ytelsestesten. Rotarod-apparatet brukes ikke som et mål på ventetiden for å falle, målet er å utsette mus for tvungen aktivitet. Plasser musene på den roterende stangen tre ganger og la 2 min utvinning mellom tester.
MERK: For å øke stresseksponeringen, bruk et akselererende Rotarod-apparat. For prosjektet som er beskrevet her, akselererer stangen fra 5 til 50 rpm over en bestemt tidsperiode på 300 sek. - La dyr komme seg i 30 min mellom poletesten og Rotarod ytelsestesten og igjen ytterligere 30 min før de scorer for dystonilignende bevegelser som beskrevet under protokolltrinn 4. Mellom de repeterende stresseksponeringene, la musene gjenopprette i 24 timerintervaller.
4. Scoringssystemer for vurdering av dystonilignende bevegelser
MERK: Eksperimentereren bør blindes for gruppeoppgaven som analyseres for å forhindre skjevhet. Atferdstestene som brukes til å karakterisere fenotypen til musene er to poengsystemer: en dystoni vurdering skala scoring unormal, dystoni-lignende bevegelser og en atferdsscore ved hjelp av halen suspensjon test. Vurder dystonilignende bevegelser etter en gjenopprettingstid på 30 min etter eksponering for mildt stress.
- Dystoni vurdering skala
MERK: På grunn av mangelen på forhåndsdefinerte atferdsoppgaver ble dystonivurderingsskalaen etablert som et observatørbasert poengsystem som ligner på de kliniske vurderingsskalaene til menneskelig dystoni. Det er en modifisert versjon av dystoni rating skala som brukes av Calderon et al.13.- Rekord holdning og gangart av dyr over en periode på 4 min etter at dyr har blitt plassert i en plast eller trekasse.
- Score for frekvens og distribusjon av dystoni-lignende bevegelser fra 0 til 4 poeng: (0) normal motorisk oppførsel; (1) unormal motorisk oppførsel, ingen dystonilignende bevegelser; (2) lett nedsatt motor med mild fokal dystonilignende bevegelser; (3) moderat nedsatt motorfunksjon med alvorlige fokale dystonilignende bevegelser; (4) alvorlig svekkelse, med vedvarende, generaliserte dystonilignende bevegelser (figur 2). Vurder følgende bevegelser eller stillinger som dystonilignende: hyperextension av frontlemmer, bred holdning eller hyperextension av hindlimbs samt kyfose. Vurder dystoni som fokal i tilfelle en enkelt kroppsdel påvirkes og som generalisert i tilfelle stammen og minst to andre kroppsdeler påvirkes.
- Test av halefjæring
MERK: Halefjæringstesten brukes ofte til å observere og score for hindlimb-låsing. Dette er imidlertid en svært uspesifikk fenotype som indikerer en motorisk svekkelse. Følgende protokoll foreslår et poengsystem som er spesifikt for dystonilignende bevegelser. På grunn av generalisering av dystoni hos DYT/PARK-ATP1A3-pasienter, bør dystonilignende bevegelser vurderes i fremre lemmer, trunk og hindlimbs. Et nyutviklet poengsystem fra 0-8 poeng ble utviklet, en total score < 2 indikerte at ingen dystonilignende bevegelser var til stede (figur 3).- Plukk musen opp ved halen nær basen og løft dyret opp. Ta opp en 2 min video av halefjæringstesten og tilordne en poengsum i en påfølgende, grundig analyse av opptaket.
- Score de fremre lemmer fra 0 til 4 poeng, hvor gjentatte eller vedvarende tonic tilbaketrekking av en eller begge foran lemmer, samt en hyperextension kombinert med kryssing av de fremre lemmer, ble klassifisert som dystoni-lignende: (0) ingen unormale bevegelser; (1) redusert bevegelse av fremre lemmer med hyperextensjon av poter sett ≥ 50% av den registrerte tiden; (2) milde dystonilignende bevegelser av fremre lem (er) < 50% av den registrerte tiden; (3) milde dystonilignende bevegelser av fremre lemmer ≥ 50 % av den registrerte tiden eller alvorlig < 50 % av den registrerte tiden; (4) alvorlige dystonilignende bevegelser av frontlem(er) ≥ 50 % av den registrerte tiden.
MERK: Hindlimb-låsing er en unormal bevegelse som ikke bør scores som dystonilignende. - Score bakblemmer fra 0 til 3 poeng, hvor tilbaketrekking og clenching av bakre lemmer samt vedvarende hyperextension ble vurdert som dystoni-lignende: (0) ingen unormale bevegelser; (1) redusert bevegelse av hindlimbs med hyperextension av poter sett ≥ 50% av den registrerte tiden; (2) dystoni-lignende bevegelser av en hindlimb; (3) dystonilignende bevegelser av begge bakkrom.
- Ved trøvelforvrengning > 80 % av den registrerte tiden, legges det til et ekstra punkt i poengsummen.
- Plasser dyret tilbake i buret.
Representative Results
Figur 4 er endret fra Rauschenberger et al.17. For dataanalyse av både dystonivurderingsskalaen (A) og halefjæringstesten (B), beregner du den totale poengsummen for hvert tidspunkt for hvert dyr. Gjennomsnittet for hvert tidspunkt og hver gruppe bør tegnes inn på en passende graf. Fordelingen av verdiene skal undersøkes, og den aktuelle statistiske testen bør brukes for å bestemme signifikans. Med et tilstrekkelig antall dyr kan en motorfenotype oppdages både med dystonivurderingsskalaen, samt med vurdering av unormale bevegelser i halefjæringstesten. Dystonilignende fenotype er demonstrert av signifikant høyere motorscore i begge vurderingene i ouabain-perfused, stresset gruppe sammenlignet med ouabain-perfused, ikke-stressede mus samt kontrollmusene.
Figur 1: De viktigste kirurgiske trinnene for kanyle og osmotisk pumpeimplantasjon. (A) For de angitte koordinatene må hull bores bilateralt for den doble kanylen utpekt for basalganglia og for enkelt kanylen plassert på midtlinjen av lillehjernen. De to fullt konstruerte osmotiske pumpene vises på hver side av dyret. Bildetviseren implantert, enkelt kanyle inn i lillehjernen, festet med tannsement. Den doble kanylen for basalganglia bør kobles til bifurcation adapteren og forhåndsfylles med ouabain før implantasjon. (C) Bilde av den ferdige prosedyren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vurdering av dystonilignende bevegelser med dystonivurderingsskala. Under en 4 min video ble dystonilignende bevegelser scoret basert på kroppsfordeling og varighet. Ufrivillig hyperextensjon av de fremre lemmer, en bred holdning eller hyperextension av hindlimbs samt kyfose ble vurdert som dystoni-lignende. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av dystonilignende bevegelser under en halefjæringstest. Det nyutviklede poengsystemet for unormale bevegelser under en 2 min hale suspensjon test evaluerer dystoni-lignende bevegelser i fremre lemmer, hindlimbs og trunk fra 0-8 poeng totalt. For de fremre lemmer, en hyperextension og kryssing av de fremre lemmer samt en tonic fleksjon mot stammen kvalifisert som dystoni-lignende. For baklimbs ufrivillig hyperextension samt tilbaketrekking med forlengelse over midline ble scoret som dystoni-lignende. En trøffelforvrengning over 80% av den registrerte tiden ble scoret med ett poeng. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative grafer av dystonia-rating skala og hale suspensjon test. (A)Grafen viser dystonia-rating skala for NaCl-perfused, stresset mus (stiplet svart linje), ouabain-perfused, ikke-stresset mus (stiplet oransje linje) og ouabain-perfused, stresset mus (mørk blå linje). For hvert tidspunkt vises gjennomsnittsverdiene ± standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). (B)Diagrammet viser vurderingen av unormale bevegelser under en 2-min hale suspensjon test for NaCl-perfused, stresset mus (stiplet svart linje), ouabain-perfused, ikke-stresset mus (stiplet oransje linje) og ouabain-perfused, stresset mus (mørk blå linje). Statistisk analyse ble gjort for dystonia rating skala og halen suspensjon test scoring ved hjelp av to-tailed Mann-Whitney test. Bonferroni-Holm korreksjon (§) av p-verdiene viste en betydelig forskjell for observasjonsperioden på 72 timer. Mørk blå * betegner betydelige forskjeller mellom ouabain-perfused, stressede mus og ouabain-perfused, ikke-stresset mus mus, svart * betegne betydelige forskjeller mellom NaCl-perfused, stressede mus og ouabain-perfused, stressede mus så vel som mellom NaCl-perfused, stressede mus og ouabain-perfused, ikke-stresset mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne DYT/PARK-ATP1A3 farmakologiske musemodellen muliggjør detaljert analyse av intracerebrale strukturelle og nevrokjemiske endringer indusert utelukkende ved hemming av natriumkaliumionpumpen i basalgangene og lillehjernen, samt endringer knyttet til stresseksponering. Ved mus kan maksimalt to osmotiske pumper implanteres subkutant. Vi presenterer her en metode som beskriver kronisk legemiddellevering til flere hjernestrukturer ved å implementere en dobbel kanyle koblet til en bifurcation adapter i tillegg til en enkelt kanyle. Denne metodikken kan brukes til ethvert program som krever at flere hjernestrukturer skal perfunderes samtidig og kronisk.
Vi presenterer en musemodell av en sjelden bevegelsesforstyrrelse, hvor pasienter utvikler permanente symptomer etter eksponering for stress. Denne antatte gen-miljømessige interaksjonen er fortsatt ikke godt forstått, men kan representere en av de viktigste pathomechanisms i DYT / PARK-ATP1A3 utvikling. Ulike metoder for å utsette mus for stress har blitt publisert tidligere og inkluderer elektriske fotstøt, begrensning, kaldt eller varmt miljø og eksponering for ulikelukt 11,,12,,13. I et forsøk på å utsette mus for en mild stressfaktor med translasjonell verdi, beskriver vi her den repeterende subjektive subjektive subjektive subjektive aktiviteten av mus for utfordrende motoriske oppgaver. For polet test, ouabain-perfused dyr avslørt ufrivillig hyperextension av fremre lemmer og hindlimbs. Disse bevegelsene var svært lik dystonilignende bevegelser observert under 4-min videoopptak av dyrene, samt halefjæringstesten. Anvendelsen av mildt stress i form av utfordrende motoriske oppgaver kan være nyttig i andre musemodeller som viser motoriske symptomer eller nevrodegenerasjon, hvor gen-miljømessige interaksjoner påvirker graden av sykdomsprogresjon.
Det er en generell mangel på forhåndsdefinerte atferdsoppgaver samt vurderingsskalaer for å klassifisere unormale bevegelser og stillinger hos mus. De fleste tilgjengelige motoroppgaver avslører uspesifikke abnormiteter, for eksempel hindlimb-låsing, som er et velkjent fenomen i mange musemodeller av bevegelsesforstyrrelser med nevrodegenerasjon18,,19. For riktig karakterisering av fenotype er det imidlertid nødvendig å analysere om musemodellen rekasitulerer de viktigste egenskapene til sykdommen. Her presenterer vi den modifiserte versjonen av en dystoni rating skala som brukes tidligere for vurdering av motorisk funksjonshemming i dystoni musemodeller15,16. Vi utviklet i tillegg et observatørbasert poengsystem for halefjæringstesten, som ble etablert på samme måte som de kliniske vurderingsskalaene til menneskelig dystoni. Begge vurderingsskalaene viser en signifikant høyere score hos ouabain-perfused, stressede mus sammenlignet med ouabain-perfused, ikke-stresset dyr samt kjøretøy-perfused dyr. Ulempene ved ethvert observatørbasert poengsystem er nødvendig opplæring av ratere for å sikre konsekvent scoring og for å redusere observatørvariabilitet, samt faren for en mulig skjevhet av rateren hvis ikke helt blindet for gruppen analysert. Observatørbaserte poengsystemer presenterer imidlertid fortsatt en lett tilgjengelig metode for å karakterisere en fenotype og kan tilpasses musemodellen analysert, som gjort i det nåværende prosjektet for vurdering av dystonilignende bevegelser. For å sikre konsekvent scoring blant ulike ratere, bør opplæringsvideoer gjøres tilgjengelig. For å redusere potensielle skjevheter anbefales det at forskjellige ratere scorer de samme videoklippene, og at de enkelte poengsummene er gjennomsnittlig. Begge scoringssystemene nevnt i dette arbeidet registrerer tilstedeværelsen av dystonilignende bevegelser hos dyr. Vurderingsskalaene kan tilpasses i henhold til de spesifikke kravene i et prosjekt, som gjort tidligere av Ip et al., hvor utelukkende baklimbs ble scoret for dystoni-lignende bevegelser i en musemodell for dystoni 1 (DYT-TOR1A)20. Vurderingsskalaene kan suppleres med andre tidligere publiserte poengsystemer, og vurderer for eksempel graden av bradykinesi hos gnagere som gjort med bevegelseshemmingsscoren av Calderon et al.13.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Det føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF DysTract til C.W.I.) og av Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) ved Universitetet i Würzburg (Z2-CSP3 til L.R.). Forfatterne takker Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger og Heike Menzel og for deres tekniske assistanse samt Helga Brünner for dyrepleien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
References
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
