Summary
In vivo micro-endoscopische calciumbeeldvorming is een onschatbaar hulpmiddel dat real-time monitoring van neuronale activiteiten bij vrijdragende dieren mogelijk maakt. Het toepassen van deze techniek op de amygdala was echter moeilijk. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor het succesvol richten op amygdalacellen met een geminiaturiseerde microscoop bij muizen.
Abstract
In vivo real-time monitoring van neuronale activiteiten bij vrij bewegende dieren is een van de belangrijkste benaderingen om neuronale activiteit te koppelen aan gedrag. Voor dit doel is een in vivo beeldvormingstechniek ontwikkeld die calciumtransiënten in neuronen detecteert met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's), een geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop en een gradiënt brekingsindex (GRIN) lens is ontwikkeld en met succes toegepast op veel hersenstructuren1,2,3,4,5,6. Deze beeldvormingstechniek is bijzonder krachtig omdat het chronische gelijktijdige beeldvorming van genetisch gedefinieerde celpopulaties mogelijk maakt voor een langdurige periode tot enkele weken. Hoewel nuttig, is deze beeldvormingstechniek niet gemakkelijk toegepast op hersenstructuren die zich diep in de hersenen bevinden, zoals amygdala, een essentiële hersenstructuur voor emotionele verwerking en associatief angstgeheugen7. Er zijn verschillende factoren die het moeilijk maken om de beeldvormingstechniek toe te passen op de amygdala. Bewegingsartefacten komen bijvoorbeeld meestal vaker voor tijdens de beeldvorming in de diepere hersengebieden, omdat een hoofdsteunmicroscoop die diep in de hersenen is geïmplanteerd relatief onstabiel is. Een ander probleem is dat de laterale ventrikel dicht bij de geïmplanteerde GRIN-lens is geplaatst en dat de beweging tijdens de ademhaling zeer onregelmatige bewegingsartefacten kan veroorzaken die niet gemakkelijk kunnen worden gecorrigeerd, waardoor het moeilijk is om een stabiel beeldbeeld te vormen. Bovendien, omdat cellen in de amygdala meestal stil zijn in een rustende of verdoofde toestand, is het moeilijk om de doelcellen te vinden en te concentreren die GECI uitdrukken in de amygdala tijdens de bodemplaatprocedure voor latere beeldvorming. Dit protocol biedt een nuttige richtlijn voor het efficiënt targeten van cellen die GECI uitdrukken in de amygdala met head-mount geminiaturiseerde microscoop voor succesvolle in vivo calcium beeldvorming in zo'n dieper hersengebied. Opgemerkt wordt dat dit protocol is gebaseerd op een bepaald systeem (bijv. Inscopix) maar niet beperkt tot het.
Introduction
Calcium is een alomtegenwoordige tweede boodschapper en speelt een cruciale rol in bijna elke cellulaire functie8. Bij neuronen veroorzaken actiepotentieel afvuren en synaptische input een snelle verandering van intracellulaire vrije [Ca2+]9,10. Daarom biedt het volgen van calciumtransiënten de mogelijkheid om neuronale activiteit te volgen. GECI 's zijn krachtige hulpmiddelen die het mogelijk maken [Ca2+] te monitoren in gedefinieerde celpopulaties en intracellulairecompartimenten 11,12. Onder veel verschillende soorten op eiwitten gebaseerde calciumindicator is GCaMP, een Ca2+ sonde op basis van een enkel GFP-molecuul13,de meest geoptimaliseerde en dus veel gebruikte GECI. Door middel van meerdere engineeringrondes is een aantal varianten van GCaMP ontwikkeld12,14,15,16. We gebruiken een van de recent ontwikkelde HUISARTSEN, GCaMP7b, in dit protocol16. GCaMP-sensoren hebben sterk bijgedragen aan de studie van neurale circuitfuncties in een aantal modelorganismen zoals beeldvorming van Ca2+ transiënten tijdens ontwikkeling17, in vivo beeldvorming in een specifieke corticale laag18, meting van circuitdynamiek in motorisch taakleren19 en beeldvorming van celensembleactiviteit gerelateerd aan associatief angstgeheugen in de hippocampus en amygdala20,21.
Optische beeldvorming van GECI's heeft verschillende voordelen22. Genetische codering maakt het mogelijk om GECI's gedurende een lange periode stabiel uit te drukken in een specifieke subset van cellen die worden gedefinieerd door genetisch profiel of specifieke patronen van anatomische connectiviteit. Optische beeldvorming maakt in vivo chronische gelijktijdige monitoring van honderden tot duizenden neuronen bij levende dieren mogelijk. Er zijn enkele optische beeldvormingssystemen ontwikkeld voor in vivo beeldvorming en analyse van GECI 's in de hersenen van vrijdragende muizen met head-mount geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopen21,23,24,25. Ondanks dat de in vivo optische beeldvormingstechniek op basis van GECI's, GRIN-lens en een miniatuurmicroscoop met kopsteun een krachtig hulpmiddel is om het verband tussen neurale circuitactiviteit en gedrag te bestuderen, is het toepassen van deze technologie op de amygdala moeilijk geweest vanwege verschillende technische problemen met het richten van de GRIN-lens op cellen die GECI's in de amygdala uitdrukken zonder bewegingsartefacten te veroorzaken die de kwaliteit van beeldverwerving ernstig verminderen en cellen vinden die GECI's uitdrukken. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor chirurgische procedures van baseplate attachment en GRIN lensimplantatie die kritieke stappen zijn voor succesvolle in vivo optische calciumbeeldvorming in de amygdala. Hoewel dit protocol zich richt op de amygdala, zijn de meeste hier beschreven procedures algemeen toepasbaar op andere diepere hersengebieden. Hoewel dit protocol is gebaseerd op een bepaald systeem (bijv. Inscopix), kan hetzelfde doel gemakkelijk worden bereikt met andere alternatieve systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Korea Advanced Institute of Science and Technology. Alle experimenten zijn uitgevoerd volgens de richtlijn van de Institutional Animal Care and Use Committee.
OPMERKING: Dit protocol bestaat uit zes belangrijke stappen: virusinjectiechirurgie, GRIN-lensimplantaatchirurgie, validatie van GRIN-lensimplantatie, basisplaatbevestiging, optische opname van GCaMP-signaal tijdens een gedragstest en gegevensverwerking (figuur 1A). Met uitzondering van chirurgie wordt het commerciële softwarepakket (Inscopix) gebruikt.
1. Stereotaxie chirurgie – AAV Virus injectie
OPMERKING: De muisbelasting die bij deze chirurgische ingreep wordt gebruikt, is C57BL6/J. Het lichaam van het dier is bedekt met een steriel doek tijdens de operatie en alle stappen in het protocol worden uitgevoerd met het dragen van steriele handschoenen. Meerdere operaties worden meestal niet op dezelfde dag uitgevoerd. Als meerdere muizen echter dezelfde operatie op dezelfde dag moeten ondergaan, gebruik dan een aparte set autoclaaf chirurgische hulpmiddelen voor elke muis en 70% ethanol om de chirurgische instrumenten tussen muizen te desinfecteren. Om de muis warm te houden tijdens de chirurgische ingreep, wordt de muis bedekt met een op maat gemaakte chirurgische deken nadat deze aan het stereotaxicframe is bevestigd.
- Desinfecteer alle benodigde chirurgische hulpmiddelen met 70% ethanol en bereid een Hamilton-spuit en een glazen pipet voor. Vul de glazen pipet met gedestilleerd water.
OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen die in het protocol worden gebruikt, zijn autoclaaf. Omdat de GRIN-lens en schedelschroeven niet kunnen worden geautoclaveerd voor sterilisatie, wordt 70 % ethanol gebruikt als ontsmettingsmiddel om ontstekingen te voorkomen. Hoewel niet geprobeerd, kunnen andere vormen van sterilisatie worden gebruikt, bijvoorbeeld gas- of chemische sterilisatie. - Verdoof de muis met pentobarbital (83 mg∙kg-1 lichaamsgewicht) door intraperitoneale injectie. Nadat de muis bewusteloos is geraakt, scheer je de vacht op de schedel.
- Reinig de huid boven de schedel met 70% ethanol en bevestig de muis aan het stereotaxicframe. Verwijder voorzichtig de huid en veeg het schedeloppervlak af met een 35% waterstofperoxideoplossing met behulp van een katoenen applicator. Breng glijmiddel oogzalf aan om te voorkomen dat het hoornvlies tijdens de operatie uitdroogt.
OPMERKING: Hoewel er meestal geen probleem is met het gebruik van 70% ethanol alleen voor aseptische huidvoorbereiding, wordt het aanbevolen om 3 afwisselende rondes ontsmettingsmiddel te gebruiken, bijvoorbeeld iodoforen of chloorhexidineoplossing, en 70% ethanol. In dit protocol wordt een hogere concentratie waterstofperoxide gebruikt om ervoor te zorgen dat bindweefsel op de muisschedel zo volledig mogelijk wordt verwijderd, wat van cruciaal belang is voor het verminderen van bewegingsartefac tijdens latere beeldvorming, omdat het bindweefsel op de schedel interfereert met een stevige bevestiging van de bodemplaat aan de schedel. Opgemerkt moet worden dat 35% waterstofperoxide een stuk hoger is dan wat normaal wordt gebruikt (3 %). - Bevestig de pin met een stereotaxic sondehouder. Lijn de hoogte van de bregma en lambda uit met de pin.
- Zoek de specifieke locatie op de schedel van de muis voor craniotomie.
OPMERKING: Coördinaten van de laterale amygdala (LA) voor virusinjectie zijn (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) van bregma in dit protocol (AP; Voorste-Achterste, ML; Mediaal-Lateral, DV; Dorsaal-Ventral, elke afkorting geeft relatieve axiale afstand tot de bregma aan)26. De coördinaten moeten voor elke experimentele toestand worden geoptimaliseerd. - Boor het schedeloppervlak (figuur 1B). Was schedelfracties met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de resterende laag met een tang of een naald van 27 G.
- Probeer bij het boren van de schedel de laatste duralaag niet aan te raken om schade aan het hersenweefseloppervlak te voorkomen. Een beschadigd hersenoppervlak veroorzaakt ontstekingen rond de lens, wat ernstige bewegingsartefacten en hoge autofluorescentie tijdens het opnemen veroorzaakt. De grootte van de craniotomie is 1,6 mm. De boorsnelheid is 18.000 tpm en de bitgrootte is 0,6 mm.
- Voor het verlagen van de GRIN-lens van het hersenweefseloppervlak van de geboorde site naar de doel amygdala-site, berekent u de afstand die "Waarde A" wordt genoemd door het DV-verschil tussen het bregma en het blootgestelde hersenoppervlak af te trekken van de DV-coördinaat van de lensimplantatie, die is ingesteld op basis van de bregma (4,2 mm in dit geval, figuur 1C).
- Laad 3 μL minerale olie en 0,7 μL van de AAV-virusoplossing in de glazen pipet.
OPMERKING: Minerale olie helpt bij het scheiden van virusoplossing en water. 0,7 μL is een geoptimaliseerd volume voor de LA-virusinjectie die de LA volledig kan dekken. - Verwijder de pen van de stereotaxic-sondehouder en bevestig de glazen pipet eraan.
- Plaats de glazen pipet op de in stap 1.5 genoemde injectieplaats. Steek de glazen pipet in het hersenweefsel nadat het bloeden volledig is gestopt.
- Lever het virus af via een glazen pipet met behulp van een injectiepomp.
OPMERKING: De titer van het virus moet hoger zijn dan 1 x 1013 vg/ml om een voldoende aantal GCaMP-uitdrukkende cellen te verkrijgen. Injectiesnelheid is 0,1 μL/min en diffuus gedurende 10 minuten. Als er bloedingen zijn, was dan het hersenoppervlak met PBS. Houd het hersenoppervlak nat in deze stap. - Verwijder na het beëindigen van de injectie de glazen pipet langzaam.
2. Stereotaxie chirurgie – GRIN lensimplantatie
OPMERKING: GRIN lensimplantaatchirurgie is de meest kritieke stap in dit protocol. Omdat een consistente lage snelheid van de GRIN-lensbeweging van cruciaal belang is voor succesvolle GRIN-lensimplantatie, kan een gemotoriseerde operatiearm nuttig zijn. De gemotoriseerde operatiearm is een stereotaxic manipulator die wordt aangestuurd door computersoftware. Hoewel de gemotoriseerde arm in dit protocol wordt gebruikt, kunnen ook andere manieren worden gebruikt zolang de lens consistent en langzaam beweegt tijdens implantatie. Gedetailleerde informatie over het apparaat staat in de tabel met materialen.
- Boor de schedel om twee schedelschroeven te implanteren. Was alle schedelfracties met PBS.
OPMERKING: Om de bewegingsartefacten in latere optische beeldvorming te verminderen, zijn ten minste twee schroeven vereist. De twee schedelschroeven en de positie van het GRIN-lensimplantaat vormen een gelijkzijdige driehoek (figuur 1B). De grootte van de craniotomie moet goed passen bij de diameter van de schroef. Als er bloedingen zijn, wast u het bloedingsoppervlak met PBS. De boorsnelheid is 18.000 tpm en de bitgrootte is 0,6 mm. - Desinfecteer de schroeven met 70% ethanol om ontstekingen te voorkomen. Implanteert de schroeven zo diep mogelijk.
OPMERKING: Schroeven moeten stevig worden bevestigd zonder extra hechting zoals cement. - Installeer een gemotoriseerde operatiearm op het stereotaxicframe. Sluit de benodigde hardware aan op de laptopcomputer waarin besturingssoftware is geïnstalleerd(Materialentabel).
- Voordat u de GRIN-lens laat zakken, bereidt u zich voor om een naaldspoor te maken met een 26 G-naald.
OPMERKING: De naaldspoor is een soort geleidespoor dat helpt bij het implanteren van de relatief dikke GRIN-lens in diepe hersengebieden zoals amygdala zonder een ernstige vervorming van de hersenstructuur langs het injectiepad te veroorzaken. Deze geleiderail wordt een naaldspoor genoemd omdat deze wordt gemaakt door een verlagings- en verheffende procedure van een relatief dunne naald van 26 G. - Bevestig de canulehouder om de naald stabiel op het stereotaxicframe te houden.
- Pak de 26 G naald vast met de canulehouder en bereken de coördinaten van de naaldinbrengende plaats.
OPMERKING: In dit protocol zijn de coördinaten van de naaldinbrengende plaats 50 μm zijdelings van de virusinjectieplaats (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm). - Toegang tot de besturingssoftware en volledige voorbereiding voor het manipuleren van de naaldpositie.
- Voer de besturingssoftware uit en selecteer de knop Nieuw project starten om de sessie te beheren.
OPMERKING: In de controlesessie zijn er verschillende lege vakken en menuknoppen. De lege vakken zijn invoerruimte voor coördinaten. Nadat u coördinaten in de lege vakken hebt ingevoerd, beweegt de gemotoriseerde stereotaxic-arm door op de knop Ga naar te klikken. De knop Ga naar verandert in een STOP-knop wanneer de stereotaxic-arm beweegt. Onder verschillende menuknoppen is alleen de knop Tool vereist in dit protocol. - Klik op de knop Gereedschap. Kalibreer de besturingssoftware door op de knop Het framemenu kalibreren te klikken. Kalibratie is het proces waarbij de werkelijke positie van de manipulator wordt ingesteld als waarden op de Stereodrive-software.
- Voer de besturingssoftware uit en selecteer de knop Nieuw project starten om de sessie te beheren.
- Plaats de punt van de naald op het blootgestelde hersenoppervlak op het schedeloppervlak met behulp van stereotaxische manipulator.
OPMERKING: De snelheid van de naald wordt ingesteld met behulp van het menu Microdrive-snelheid in het menu Tool. De standaardsnelheid is 3,0 mm/s. In deze stap wordt echter een snelheid van 0,5 mm/s aanbevolen. De beweging van de naald wordt geregeld door de pijltjestoetsen. - Voeg 2-3 druppels PBS toe om het hersenoppervlak nat te houden. Vul het lege vak op het computerscherm in met de juiste DV-coördinaten van de LA. Als het hersenoppervlak droog is, belemmert het de penetratie van de naald in het hersenweefsel.
- Laat de 26 G naald zakken door op de knop Ga naar te klikken. Het stopt automatisch wanneer de naald de doellocatie bereikt die is ingesteld door DV-coördinaten. De snelheid van de naald is 100 μm/min. Als er bloedingen zijn, stop dan de naald door op de STOP-knop te klikken en was het hersenoppervlak met PBS. Houd het hersenoppervlak nat in deze stap. Nadat het bloeden is gestopt, begint u opnieuw te dalen.
- Nadat de naald volledig stopt met bewegen, voert u 45,00 mm in het lege vak op het computerscherm in.
OPMERKING: 45,00 mm is een waarde van DV-coördinaat waardoor de naald terugkeert naar de startpositie. - Verhef de naald door op de knop Ga naar te klikken. De snelheid van de naaldbeweging is 100-200 μm/min.
- Nadat de naald stopt met bewegen, verwijdert u de PBS op het hersenoppervlak. Verwijder de naald- en canulehouder van het stereotaxicframe. De experimenteerder kan de naald handmatig stoppen door indien nodig op de STOP-knop te klikken.
- Rust de stereotaxicstang uit met de lenshouder. Installeer de GRIN-lens op de lenshouder.
OPMERKING: De GRIN-lens die is geoptimaliseerd voor het richten op de LA (0,6 mm in diameter, 7,3 mm lang) wordt in dit protocol gebruikt. Als de lenshouder niet is voorbereid, is een alternatieve manier om een bulldogclip te gebruiken om de GRIN-lens vast te pakken. - Desinfecteer de lens met 70% ethanol en bevestig de stereotaxic staaf aan de stereotaxic frames.
- Plaats de punt van de GRIN-lens op de aangewezen plaats op het schedeloppervlak (dezelfde methode beschreven in stap 2.8).
OPMERKING: De coördinaat van de GRIN-lens is (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (figuur 1C). De lens mag de schedel niet aanraken om schade aan de punt te voorkomen. - Bereken de DV-coördinaat door de absolute waarde van "Waarde A" af te trekken van de DV-coördinaat van de lensimplantatie zoals beschreven in stap 2.16.
- Laat 2-3 druppels PBS vallen op het hersenoppervlak. Voer 1000 μm in voor het verlagen en 300 μm voor het verhogen van de lens in de lege doos op het computerscherm.
- Herhaal het verlagen (1000 μm naar beneden) en het verhogen (300 μm naar boven) van de GRIN-lens totdat deze de doellocatie bereikt. Deze op en neer procedure wordt gebruikt om te helpen vrijgeven van de druk gegenereerd in het hersenweefsel als gevolg van de verlagingsprocedure van lens die anders kan leiden tot vervorming van de hersenstructuren langs het implantatiepad.
OPMERKING: De snelheid van de GRIN-lensbeweging is 100 μm/min. Zelfs als er bloedingen zijn, stop dan niet met het bewegen van de GRIN-lens en was het hersenoppervlak met PBS. Houd het hersenoppervlak nat in deze stap. Als het hersenoppervlak droog is, kleeft hersenweefsel aan het GRIN-lensoppervlak en veroorzaakt het vervorming van de hersenstructuur. - Als de GRIN-lens de doelplaats bereikt, verwijdert u PBS en past u voorzichtig het harsbitercement rond de GRIN-lens, de schroeven en hun zijwand aan (figuur 1D).
OPMERKING: Het aanbrengen van het harscement over de hele schedel kan bewegingsartefacten verminderen. Integendeel, als het harscement per ongeluk de spieren bedekt die aan de schedel zijn bevestigd, verhoogt het bewegingsartefacten. - Nadat het tandcement van de hars is gehard, demonteert u de GRIN-lens uit de lenshouder en past u acrylcement over de hele schedel aan(figuur 1D).
- Om de hoofdplaat te bevestigen, demonteert u de lenshouder van de stereotaxic-staaf en bevestigt u de hoofdplaat aan de punt van de staaf met behulp van tapes. Controleer of de kopplaat horizontaal is.
OPMERKING: Een gekantelde kopplaat zorgt voor een gekanteld zicht. Een hoofdplaat is vereist voor het bevestigen van de muiskop in het stacaravankooisysteem (in het gedeelte van de basisplaatbevestiging). Als de experimenteerer het systeem niet gebruikt, slaat u deze stap (stap 2.22) en de volgende stap 2.23 over. - Laat de stang langzaam zakken totdat de kopplaat zich aan de bovenkant van de lensmanchet bevindt. Laat de kopplaat 1000 μm meer zakken. Beweeg de hoofdplaat voor de geïmplanteerde GRIN-lens om zich aan de rechterrand van de binnenring van de hoofdplaat te bevinden.
OPMERKING: De hoofdplaat moet lager worden geplaatst dan het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak; anders kan de microendoscoop niet dicht genoeg bij de geïmplanteerde GRIN-lens komen om het brandpuntsvlak aan te passen vanwege het acrylcement. - Breng acrylcement aan om de kopplaat aan de cementlagen te bevestigen(figuur 1D).
- Bevestig paraffinefilm op het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak om het lensoppervlak te beschermen tegen stof. Breng vervolgens verwijderbare epoxybinding aan op de paraffinefilm om paraffinefilm op het lensoppervlak te houden.
- Injecteer Carprofen, een pijnstillende (0,5 mg/ml in PBS) en Dexamethason, een ontstekingsremmend geneesmiddel (0,02 mg/ml in PBS) oplossing, in de buikholte van de muis.
OPMERKING: De dosis van het geneesmiddel is afhankelijk van het lichaamsgewicht: Carprofen (5 mg∙kg-1 lichaamsgewicht) en Dexamethason (0,2 mg∙kg-1 lichaamsgewicht). Zowel Carprofen als Dexamethason wordt toegediend na de operatie en eenmaal daags gedurende 7 dagen na de operatie. - Meng 0,3 mg/ml amoxicilline, een antibioticum, in huiskooiwater om het medicijn gedurende 1 week toe te dienen.
- Breng de muis terug naar de huiskooi en laat 5-8 weken toe voor herstel en virustransductie.
OPMERKING: De muis wordt teruggevonden in een voorverwarmde kooi op een elektrische deken totdat de muis wakker wordt van de verdoving.
3. Validatie van de GRIN lensimplantatie
OPMERKING: Validatie van de GRIN-lensimplantatie geeft informatie over de vraag of de geïmplanteerde GRIN-lens on-target is voor GCaMP-uitdrukkende cellen. Op basis van deze informatie bespaart de experimenteerder tijd van tijdrovende processen zoals de gedragstest en gegevensverwerking door dieren uit te sluiten met off-targeted GRIN lensimplantatie. Tijdens de validatieprocedure moeten cellen met GCaMP-expressie worden gericht in het opnameveld. In deze stap wordt een stacaravankooi gebruikt. Een stacaravankooi is een gespecialiseerd rondvormig apparaat waarmee hoofdgefixeerde muizen hun benen vrij kunnen bewegen tijdens de validatie van de GRIN-lensimplantatie en basisplaatbevestiging. Een luchtheftafel in dit apparaat waarop de poten van vaste muizen van het hoofd zijn geplaatst, maakt een dergelijke vrije beweging van de benen mogelijk, hoewel het hoofd vaststaat. De cellen in de laterale kern van de amygdala zijn meestal stil in een rustende of verdoofde toestand, dus GCaMP fluorescentiesignalen worden zelden gedetecteerd in deze omstandigheden, wat het erg moeilijk, soms onmogelijk maakt om cellen te vinden die GCaMP uitdrukken tijdens de validatie van de GRIN-lensimplantatie en basisplaatbevestiging. De beweging van benen produceert echter vaak GCaMP fluorescentiesignalen in de cellen van laterale kern van amygdala en kan daardoor helpen om de microscoop te lokaliseren. Zo wordt de stacaravankooi in dit protocol gebruikt.
- Monteer de stereotaxic manipulator op het stacaravankooisysteem.
- Verdoof de muis met 1,5% isofluraangas. Nadat de muis volledig bewusteloos is, plaatst u de muis op de hoofdbalk van het stacaravankooisysteem.
- Zoek de koolstofkooi onder de muis. Sluit de koolstofkooi en schakel de luchtstroom in om de kooi vrij te laten bewegen zonder wrijving. Wacht een paar minuten tot de muis actief wordt.
OPMERKING: De snelheid van de luchtstroom moet worden geoptimaliseerd voor elke experimentele toestand (hier, 100 L/min). - Verwijder paraffinefilm en epoxybinding op het oppervlak van de geïmplanteerde GRIN-lens en veeg het lensoppervlak af met 70% ethanol met lenspapier.
- Bereid de DAQ-software (Data Acquisition) voor (bijv. Inscopix). Stel de beeldvormingsvoorwaarden in.
OPMERKING: De DAQ-software wordt gebruikt voor het regelen van de microscoop (LED-vermogen, lensfocus,enz.) en gegevensopslag.- Zet de DAQ-box aan en sluit er een microscoop op aan. Sluit het vervolgens rechtstreeks via een kabel of via draadloos internet aan op een laptopcomputer.
OPMERKING: De DAQ-software is geïnstalleerd in de extra hardware genaamd DAQ box (bijv. Inscopix). Door de DAQ-box op de laptopcomputer aan te sluiten, wordt DAQ-software toegankelijk in een laptopcomputer. - Toegang tot de DAQ-software via een internetbrowser (Firefox wordt aanbevolen).
- Stel alle benodigde details (datum, muis-ID,enz.) in de gedefinieerde sessiein. Klik vervolgens op Opslaan en doorgaan. Ga na het opslaan naar de sessie Uitvoeren.
- Stel in de runsessiede beeldvormingsomstandigheden in, zoals belichtingstijd, versterking, elektronische scherpstelling en belichtings-LED-voeding.
OPMERKING: Versterking en blootstellings-LED-vermogen zijn veranderlijk afhankelijk van de laboratoriumomstandigheden. De aanbevolen waarde voor elektrische scherpstelling is 500 en de belichtingstijd is 50 ms. Er is geen beperking voor het veranderen van LED-vermogen en versterking. Een hogere lichtintensiteit kan echter meer bleken veroorzaken. De belichtingstijd van de opname bepaalt een framesnelheid van video-opname. Hogere framesnelheden verminderen de signaalintensiteit. Framesnelheden moeten worden geoptimaliseerd voor de GECI's die voor de imaging worden gebruikt.
- Zet de DAQ-box aan en sluit er een microscoop op aan. Sluit het vervolgens rechtstreeks via een kabel of via draadloos internet aan op een laptopcomputer.
- Om de microscoop op een stereotaxic manipulator te houden, bevestigt u de stereotaxic staaf met microscoop grijper aan stereotaxic manipulator.
OPMERKING: De grijper is een klein accessoire dat aan het stereotaxic-apparaat kan worden bevestigd om een microscooplichaam vast te houden om het op de locatie van de doelhersenen te plaatsen. - Pak de microscoop vast met de microscoopgrijper. Schakel het LED-licht in dat op de microscoop is aangesloten en lijn de microscoop verticaal uit. Laat de microscoop zakken tijdens het observeren van het beeld totdat het oppervlak van de geïmplanteerde GRIN-lens verschijnt.
- Lijn het midden van de geïmplanteerde GRIN-lens uit met het midden van het aanzicht.
OPMERKING: Validatie van de GRIN-lensimplantatie kan in deze stap worden uitgevoerd (vermeld in het resultaatgedeelte, figuur 2B, figuur 2D, figuur 2F). - Maak een afbeelding van het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak (Klik op de Prt Sc-knop op het toetsenbord). Het beeld van het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak is vereist voor het deselecteren van niet-neuronale componenten tijdens latere gegevensverwerking (stap 6.8).
- Zoek de juiste positie van de microscoop. Verhef langzaam de objectieve lens van de microscoop terwijl u het beeld observeert om cellen te zoeken met GCaMP7b-expressie.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de versterking van de beeldverwerving of het belichtings-LED-vermogen aan te passen. Validatie van de GRIN-lensimplantatie kan in deze stap worden uitgevoerd (vermeld in het resultaatgedeelte, figuur 2A, figuur 2C, figuur 2E).
4. Bevestiging van de bodemplaat
OPMERKING: De stap voor het bevestigen van de bodemplaat volgt op de validatie van GRIN-lensimplantatie. De bodemplaat is een platform voor het monteren van de microscoop op de kop van muizen. Zoals vermeld in het vorige gedeelte, wordt in dit protocol een stacaravankooi gebruikt.
- Na het valideren van GRIN lensimplantatie, demonteer je een miniatuurmicroscoop van de microscoopgrijper.
- Bevestig de bodemplaat aan de microscoop. Draai de schroef vast met behulp van de zeskantsleutel voor een stabiele bevestiging van de bodemplaat aan de microscoop.
- Pak de microscoop vast met de microscoopgrijper. Schakel het LED-licht in dat op de microscoop is aangesloten en lijn de microscoop verticaal uit. Laat de microscoop zakken totdat het oppervlak van de geïmplanteerde GRIN-lens wordt waargenomen. Lijn het midden van de geïmplanteerde GRIN-lens uit met het midden van het aanzicht.
- Zoek de juiste positie van de microscoop. Verhef langzaam de objectieve lens van de microscoop tot het vinden van een brandpuntsvlak dat de beste beelden van cellen met GCaMP7b-expressie geeft (figuur 2A).
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de versterking van beeldverwerving of belichtings-LED-vermogen tijdens deze stap aan te passen. - Breng acrylcement aan om de bodemplaat stabiel aan de kopplaat te bevestigen(figuur 2G). Bouw de zijwanden op met acrylcement tussen de bodemplaat en de kopplaat.
OPMERKING: Acrylcement krimpt wanneer het uithard. Verwijder daarom de microscoop pas als het cement volledig is uithard (deze stap duurt minstens 30 minuten). Cementeren moet zeer zorgvuldig worden gedaan om ongewenste cementering van de microscoop en de objectieve lens met acrylcement te voorkomen. - Nadat acrylcement volledig is uithard, draai je de schroef los en verhef je het microscooplichaam langzaam.
- Als er een opening op de zijwand is, moet u extra cementeren om de geïmplanteerde GRIN-lens tegen stof te beschermen.
- Bedek de bodemplaat om de geïmplanteerde GRIN-lens tegen stof te beschermen en draai de schroef van de bodemplaat vast.
- Maak de kopplaat los van de hoofdbalk. Keer de muis terug naar de thuiskooi tot toekomstige optische beeldvorming.
5. Optische opname van GCaMP-signaal tijdens een gedragstest
OPMERKING: De procedure van GCaMP-signaalopname tijdens gedrag kan zeer verschillend zijn, afhankelijk van de systemen die worden gebruikt voor optische beeldvorming, experimenteel ontwerp en laboratoriumomgeving. Daarom wordt het op een eenvoudige manier beschreven in deze sectie.
- Voer enkele dagen behandeling uit vóór de gedragstest.
- Bereid het gedragsapparaat voor (bijv. angstconditioneringskamer, gedragssoftware en het Coulbourn-instrument) en de laptopcomputer.
- Sluit de microscoop aan op de DAQ-box en schakel de DAQ-box in.
- Sluit de DAQ-box aan op een laptop via een draadloze internetverbinding.
- Start de DAQ-software (Firefox-browser wordt aanbevolen) op de laptop. Klik op de knop Bestandsbeheer en vink de resterende opslagcapaciteit van het DAQ-vakje aan voor het opslaan van opgenomen gegevens.
OPMERKING: De gegevensgrootte is ongeveer 80 GB voor 30 minuten opname. - Voer de benodigde informatie (datum, muis-ID,enz.) in de gedefinieerde sessie in en voer de run-sessiein.
- Pak voorzichtig de muis en verwijder de bodemplaatafdekking op het hoofd. Het plaatsen van de microscoop op het bodemplaatplatform.
- Draai de grondplaatschroef vast en plaats het dier met een microendoscoop met kopsteun in de gedragskamer.
OPMERKING: De muis probeert in deze stap te ontsnappen als de hantering niet voldoende is. - Sluit het NI-bord aan op de TRIG-poort van de DAQ-box met behulp van een BNC-kabel. Ni board ontvangt TTL-signalen van gedragssoftware (bijv. FreezeFrame) en coördineert gelijktijdige opnameprocedure van GCaMP-signaal en gedrag van dieren.
- Stel het brandpuntsvlak in.
OPMERKING: Het brandpuntsvlak wordt bepaald door de afstand tussen de objectieve lens van de microscoop en de GRIN-lens die in de hersenen is geïmplanteerd. Om het brandpuntsvlak aan te passen, wordt de objectieve lenspositie gemanipuleerd tijdens het observeren van beelden. De afstand tussen deze twee lenzen die een duidelijke morfologie van cellen en bloedvaten vertoont, wordt ingesteld als het brandpuntsvlak voor beeldvorming. In dit protocol wordt de DAQ-software gebruikt om de beweging van de objectieve lens tijdens het afstellen te regelen. - Stel de geoptimaliseerde belichtingstijd, versterking, LED-voeding in Run-sessiein.
OPMERKING: Over het algemeen wordt 50 ms gebruikt voor blootstellingstijd. Versterking en LED-voeding worden ingesteld op basis van beeld histogrammen. Histogrammen geven de verdeling van de fluorescentie-intensiteit van de pixels aan. Op basis van visuele inspectie moet de rechterrand van het histogram een waarde hebben tussen 40% en 60% in het geval van GCaMP7b. Het verandert afhankelijk van de GECI's die worden gebruikt voor imaging. - Opnameoptie wijzigen in Geactiveerde opname. Klik op Opnemen en start het gedrag.
OPMERKING: De geactiveerde opnameoptie biedt een overeenkomende tijdlijn van de opnamesessie en de gedragssessie. Als het TTL-signaal wordt ontvangen, gaat er een rood lampje boven de TRIG-poort branden. - Maak na het voltooien van de gedragstest de microscoop los en bevestig de bodemplaatafdekking.
- Breng de muis terug naar de huiskooi. Selecteer vervolgens Bestandsbeheer en exporteer gegevens vanuit het vak DAQ.
- Offer na de gedragstest de muis op voor histologische verificatie na de dood.
6. Gegevensverwerking
OPMERKING: De gegevensverwerkingsprocedure is zeer verschillend, afhankelijk van de gegevensverwerkingssoftware en de GECI's die worden gebruikt voor het beeldvormingsexperiment. Daarom wordt het op een eenvoudige manier beschreven in deze sectie. Dit protocol maakt gebruik van commerciële gegevensverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen). Als alternatief kan andere open source-software die in de discussiesectie wordt genoemd, ook zonder problemen worden gebruikt. De variabelen die in dit protocol worden gebruikt, worden weergegeven in tabel 1.
- Importeer het opnamevideogegevensbestand (1280 pixels x 800 pixels) vanuit het vak DAQ in de desktopcomputer voor gegevensverwerking. Start de gegevensverwerkingssoftware.
OPMERKING: Gegevensverwerkingssoftware verschilt in eerdere stappen van DAQ-software. In gegevensverwerkingssoftware zijn er 6 stappen: down-sampling, bijsnijden, ruimtelijk filter, bewegingscorrectie, ΔF/F-berekening, gebeurtenisdetectie die nodig zijn voor het extraheren van eencellige calciumtransiëntgegevens uit opgenomen video. - Downsample en snijd de video bij.
OPMERKING: Downsampling en bijsnijden zijn nodig om de verwerkingssnelheid te verhogen. Snijd het gebied bij, met uitzondering van het interessegebied waar het GCaMP-signaal wordt waargenomen. - Ruimtelijk filter toepassen. Nadat u een ruimtelijk filter hebt toegepast, maakt u een projectieafbeelding met gemiddelde intensiteit.
OPMERKING: Ruimtelijk filter onderscheidt elke pixel in opgenomen videobeelden en biedt een afbeelding met een hoog contrast. Er zijn twee soorten afkapfilters, laag- en hoogafkapfilter. De hogere waarde van filters met een lage cut-off verhoogt het contrast van het beeld, maar tegelijkertijd neemt ook de grijze ruis toe. De lagere waarde van een hoog afgesneden filter zorgt ervoor dat het beeld wazig wordt. - Bewegingscorrectie toepassen. Gebruik de projectieafbeelding met gemiddelde intensiteit als referentieafbeelding voor bewegingscorrectie.
- Pas bewegingscorrectie opnieuw toe met behulp van de afbeelding van het eerste frame als referentieafbeelding.
OPMERKING: Twee stappen van bewegingscorrectie verminderen het bewegingsartefact aanzienlijk. - Pas de ΔF/F-berekening toe om pixels te visualiseren die een verandering in helderheid weergeven.
OPMERKING: De helderheidsverandering van pixels wordt veroorzaakt door fluorescentie-intensiteitsverandering van GCaMP en geeft calciumtransiënten aan. - Pas het PCA/ICA-algoritme toe om de calciumtransiëntcurve van elke cel te visualiseren.
OPMERKING: PCA/ICA is een algoritme voor het sorteren van een groep gegevens in een set gegevens met één component. De variabelen moeten voor elke laboratoriumtoestand worden geoptimaliseerd. In dit protocol zijn alle variabelen standaard, behalve het ICA-tijdelijke gewicht (0,4 wordt gebruikt in dit protocol)27. - Schakel handmatig niet-neuronale componenten uit tussen geïdentificeerde componenten op basis van de criteria die in de volgende notitie worden beschreven.
OPMERKING: Hiervoor worden twee belangrijke criteria gebruikt. Ten eerste lijkt het GCaMP-signaal afkomstig van een neuron op een duidelijke bolvorm. Zo wordt alleen het signaal met een duidelijke bolvorm geselecteerd als neuron. Ten tweede, gezien de diameter van het cellichaam van amygdala piramidale cel is bekend dat ongeveer 20 μm28,29,30,alleen het signaal ongeveer overeenkomt met deze grootte is geselecteerd als een neuron. Om de grootte van het GCaMP-signaal te bepalen, wordt de werkelijke grootte van een enkele pixel berekend op basis van het vastgelegde beeld van het lensoppervlak (stap 3.9) en wordt de maximale breedte van één bolvorm berekend. In dit protocol is de diameter van de geïmplanteerde GRIN-lens bijvoorbeeld 600 μm. Daarom, als de diameter van de lens 800 pixels is, is de werkelijke grootte van de enkele pixel 1,5 μm (20 μm is ongeveer 7 pixels). - Pas de gebeurtenisdetectiefunctie toe om een significante toename van calciumtransiënt (calciumgebeurtenis) te detecteren.
OPMERKING: In deze stap is de variabele genaamd gebeurtenis kleinste vervaltijd (τ) vereist. In dit protocol wordt 1.18s gebruikt als geoptimaliseerde variabele voor GCaMP7b. De gemiddelde half vervaltijd (t1/2=0,82s) wordt berekend op basis van ΔF/F curve tijdens spontane activiteit van cellen. Aangezien GCaMP exponentieel verval volgt, τ =
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validatie van GRIN lensimplantatie
Voordat de bodemplaat chronisch aan de hersenen wordt bevestigd door te cementeren, moet de GRIN-lensimplantatie worden gevalideerd. Bij dieren met succesvolle lensimplantatie werden zowel GCaMP-uitdrukkende cellen als bloedvaten duidelijk waargenomen binnen een brandpuntsvlakbereik dat werd bepaald door de afstand tussen objectieve lens van microscoop en geïmplanteerde GRIN-lens (figuur 2A en B). Bij dieren met een off-target implantatie werd daarentegen geen duidelijk beeld van GCaMP-uitdrukkende cellen waargenomen binnen het bereik van het brandpuntsvlak (niet scherp of uit het zicht). In het geval van onscherpe, goed gerichte bloedvaten konden worden waargenomen, maar alleen wazige beelden voor cellen binnen het bereik van het brandpuntsvlak (figuur 2C en D). In het geval van uit het zicht werden in de meeste gevallen geen bloedvaten waargenomen en werd geen fluorescentiesignaal gedetecteerd binnen het bereik van het brandpuntsvlak (figuur 2E). Bovendien vertoonde de geïmplanteerde GRIN-lens, in tegenstelling tot andere gevallen, een heldere rand (figuur 2F). De bevestiging van de bodemplaat wordt alleen uitgevoerd op gevalideerde dieren met op doel GRIN lensimplantatie.
Registratie van GCaMP-signalen in het LA-neuron als reactie op auditieve stimuli
In dit protocol werden 4 gevallen van pseudorandomized toon (2,8 kHz, 200 ms duur, 25 pulsen) gepresenteerd aan een muis, en GCaMP-signalen werden optisch geregistreerd in de LA-cellen van muizen met head-mount microendoscoop. Muizen geïnjecteerd met AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE in de unilaterale laterale amygdala werden gebruikt voor de beeldvorming. Bij dieren met een succesvolle GRIN-lensimplantatie werden virusuitdrukkingscellen en bloedvaten duidelijk waargenomen binnen het brandpuntsvlakbereik (figuur 3A). In de gedragsomstandigheden vertoonden ongeveer 50-150 cellen meestal een significante fluorescentieverandering in het gezichtsveld in de LA, zelfs zonder toon zoals weergegeven in de ΔF/F-afbeelding, waarschijnlijk spontaan actieve cellen (figuur 3B). Bij toonpresentatie vertoonden slechts enkele cellen een toonspecifieke verandering van GCaMP-signaal zoals bepaald door ΔF/F-beeldanalyse (6 cellen in figuur 3C en figuur 3D). Dezelfde procedures werden uitgevoerd op muizen geïnjecteerd met AAV2/1-CaMKIIα-GFP als controle. Hoewel GFP-uitdrukkende cellen werden gedetecteerd binnen het bereik van het brandpuntsvlak, vertoonden geen cellen een significante fluorescentieverandering met of zonder toon zoals bepaald door ΔF/F-beeldanalyse (figuur 3E en figuur 3F).
Voor histologische verificatie van GCaMP-expressie en targeting van GRIN-lens worden coronale delen van de postmortemhersenen onderzocht onder de fluorescentiemicroscoop (figuur 4A en figuur 4B). DAPI-kleuring wordt gebruikt om intacte cellen te bevestigen en geen teken van weefselschade als gevolg van ontsteking van het hersenweefsel rond de GRIN-lens(figuur 4C).
Figuur 1: Schematische workflow en diagrammen voor stereotaxische chirurgie voor in vivo micro-endoscopische calciumbeeldvorming in de LA. (A) Een schematische workflow van in vivo micro-endoscopische calciumbeeldvorming in de LA. (B) Een microscopisch beeld dat tweedimensionale coördinaten van craniotomieplaatsen voor de virusinjectie en de grin lensimplantaatchirurgie toont. Twee schedelschroeven en de lens vormen een gelijkzijdige driehoek. (C) Een diagram voor de relatieve positie tussen de virusinjectieplaats en de geïmplanteerde GRIN-lens, en schematische uitleg voor het berekenen van "Waarde A". D) Doorsnede van de cementlaag van het schedeloppervlak naar de hoofdplaat in de laatste stappen van de operatie. Hars tandcement moet de wand van de schroeven en de geïmplanteerde GRIN-lens bedekken. Acrylcement wordt aangebracht op het tandcement van de hars. Kopplaat is bevestigd op de cementlaag. Paraffinefilm bedekt het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak en beschermt het tegen stof. Verwijderbare epoxybinding voorkomt het losmaken van paraffinefilm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Validatie van de GRIN-lensimplantatie en configuratie van cementlagen na de bevestiging van de bodemplaat. (A) Een representatief endoscopisch snapshotbeeld van dieren met succesvolle GRIN-lensimplantatie. Zowel GCaMP uitdrukkende cellen als bloedvaten worden duidelijk waargenomen. (B) Snapshot-afbeelding van het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak van dieren met succesvolle GRIN-lensimplantatie. (C) Een representatief endoscopisch snapshotbeeld van dieren met out-of-focus GRIN-lensimplantatie. (D) Snapshot-afbeelding van het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak van dieren met out-of-focus GRIN-lensimplantatie. In het geval van onscherpe bloedvaten worden soms duidelijk waargenomen, maar alleen wazige beelden voor cellen binnen het bereik van het brandpuntsvlak. (E) Een representatief endoscopisch snapshotbeeld van dieren met out-of-view GRIN lensimplantatie. In het geval van uit het zicht worden in de meeste gevallen geen bloedvaten waargenomen en wordt er geen fluorescentiesignaal gedetecteerd binnen het bereik van het brandpuntsvlak. (F) Een momentopname van het geïmplanteerde GRIN-lensoppervlak van dieren met out-of-view GRIN-lensimplantatie. In tegenstelling tot andere gevallen wordt in dit geval de heldere rand waargenomen. (G) De configuratie van cementlagen voor de bevestiging van de bodemplaat. Bodemplaat en kopplaat worden bevestigd door acrylcement. Er moet een ruimte onvervuld met acrylcement tussen de bodemplaat en grin lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Registratie van GCaMP-signalen in de LA-neuronen. (A tot en met C) Gegevens verkregen van een muis geïnjecteerd met AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE. (A) Een representatief endoscopisch snapshotbeeld tijdens een gedragstest. GCaMP7b uitdrukkende cellen en bloedvaten werden duidelijk waargenomen binnen het focale vlakbereik. B) Een representatieve momentopname met ΔF/F-signaal. Witte lijn geeft cellen aan die tijdens de gedragstest een significante fluorescentieverandering in het interessegebied hebben weergegeven. Schaalbalk = 50 μm. (C) Projectiebeeld met maximale intensiteit. In totaal 6 cellen vertoonden een toonspecifieke verandering van GCaMP-signaal. Schaalbalk = 50 μm. (D) Representatieve ΔF/F sporen van toonresponsieve cellen. Elke kleur komt overeen met elke afzonderlijke cel met dezelfde kleur in het deelvenster (C). (E en F) Gegevens verkregen van een muis geïnjecteerd met AAV2/1-CaMKIIα-GFP. (E) Een representatief endoscopisch snapshotbeeld tijdens een gedragstest. GFP-uitdrukkende cellen werden duidelijk gedetecteerd binnen het bereik van het brandpuntsvlak. (F) Een representatieve momentopname met ΔF/F-signaal. Schaalbalk = 50μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische verificatie van de GRIN-lenspositie en GCaMP7b-expressie. (A) Een representatieve coronale sectieafbeelding met GCaMP7b-expressie in de LA. Schaalbalk = 200μm. (B) Uitvergrote afbeelding. Schaalbalk = 50 μm. (C) Fluorescentie microscopisch beeld met DAPI-kleuringssignaal. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Factor | Waarde |
| Ruimtelijke down sampling factor | 2 |
| Temporele down sampling factor | 2 |
| Ruimtelijk filter: Hoge afsluiting | 0.5 |
| Ruimtelijk filter: Lage afsluiting | 0.005 |
| Bewegingscorrectie: Hoge afsluiting | 0.016 |
| Bewegingscorrectie: Lage cut-off | 0.004 |
| Bewegingscorrectie: Maxtranslation | 20 |
| ΔF/F referentiekader | Gemiddeld frame |
| PCA/ICA: blockSize | 1000 |
| PCA/ICA: convergentieThreshold | 1x10^-5 |
| PCA/ICA: icaTemporalGewicht | 0.4 |
| PCA/ICA: numIC's | 120 |
| PCA/ICA: numPC's | 150 |
| PCA/ICA: unmixType | Tijdelijke |
| Gebeurtenisdetectie: vervalconstante | 1.18 |
| Gebeurtenisdetectie: drempelwaarde | 4 |
Tabel 1: Lijst van variabelen voor gegevensverwerking
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bekwame operatietechnieken zijn essentieel voor het bereiken van succesvolle in vivo optische calciumbeeldvorming met head-mount miniatuurmicroscopie in diepere hersengebieden zoals de amygdala zoals we hier beschreven. Daarom, hoewel dit protocol een richtlijn biedt voor geoptimaliseerde chirurgische processen van basisplaatbevestiging en GRIN-lensimplantatie, kunnen aanvullende optimalisatieprocessen nodig zijn voor kritieke stappen. Zoals vermeld in de protocolsectie, moeten amygdala-coördinaten in chirurgie, luchtstroomsnelheid in de basisplaatbevestigingsstap, instellingen voor beeldverwerving (framesnelheid, LED-vermogen,enz.) in calciumregistratie en variabelen (ICA-temporeel gewicht, gebeurtenis kleinste vervaltijd,enz.) in gegevensverwerking worden geoptimaliseerd.
De stap voor het bevestigen van de bodemplaat kan worden gewijzigd. De hoofdplaat is nodig omdat het helpt bij het repareren van de kop van wakkere muizen tijdens de bevestiging van de bodemplaat in de stacaravankooi. Als de stacaravankooi echter niet in het laboratorium wordt bereid, is het isofluraangasanesthesiesysteem een alternatieve optie. Op deze alternatieve manier kan de concentratie isofluraangas van cruciaal belang zijn. We merkten op dat GCaMP-signaal zelden wordt gedetecteerd in de amygdala van muizen onder 1,5% isofluraan. Integendeel, het GCaMP-signaal wordt gedetecteerd onder een isofluraantoestand van 0,8% en muizen blijven in een bijna wakkere toestand, maar zonder substantiële hoofdbeweging in deze toestand. Deze anesthesievoorwaarde maakt het dus mogelijk om de basisplaatbevestiging uit te voeren zonder extra apparaten zoals hoofdplaat en stacaravankooi te gebruiken.
Onstabiele bevestiging van de schedelschroef, cement, bodemplaat en microscoop kan bewegingsartefacten veroorzaken die kunnen worden gecorrigeerd met behulp van het algoritme voor bewegingscorrectiesoftware. Men denkt dat de beweging van de laterale ventrikel een onregelmatig type bewegingsartefacten veroorzaakt dat niet gemakkelijk kan worden gecorrigeerd met momenteel beschikbare bewegingscorrectiesoftware. Dergelijke onregelmatige bewegingsartefacten zijn minimaal in de meeste oppervlakkige hersengebieden zoals de hippocampus en de cortex. Het wordt echter vaak gedetecteerd tijdens optische beeldvorming in de amygdala. Om dit probleem op te lossen, stelt dit protocol voor om de GRIN-lens 50 μm van de virale injectieplaats naar de zijkant te implanteren(figuur 1C),wat het beeldverwervingsproces aanzienlijk verbetert door de potentiële bewegingsartefacten afkomstig van de laterale ventrikel te verminderen. Hoewel we 50 μm instellen ten opzichte van de virale injectieplaats, kan de doelcoördinaat voor lensimplantatie ook worden ingesteld ten opzichte van de laterale ventrikel. In dit protocol redeneerden we dat het belangrijker is om de virale uitdrukkende site precies te targeten voor succesvolle prestaties van beeldvorming. Zo gebruikten we een virale injectiecoördinaat als referentie om de doelcoördinaat van lensimplantatie in te stellen. Door herhaalde proeven hebben we een optimale conditie vastgesteld die de GRIN-lens in staat stelde om efficiënt te richten op virale uitdrukkende site terwijl bewegingsartefacten veroorzaakt door zijdelingse ventrikelbeweging werden vermeden. Uiteindelijk zou de methode die alle bewegingsartefacten efficiënt en nauwkeurig kan corrigeren, van grote hulp zijn om in de toekomst toegang te krijgen tot optische beeldvorming tot diepere hersengebieden.
Hoewel de in vivo optische calciumbeeldvorming met head-mount miniatuurmicroscoop een krachtig hulpmiddel is en is geoptimaliseerd, is er nog steeds ruimte voor verbetering in veel aspecten. Dit protocol zal studies vergemakkelijken die gericht zijn op het onderzoeken van real-time neurale activiteit in de amygdala van vrij zich gedragende dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van De Stichting van de Wetenschap en van de Technologie van Samsung (Projectnummer SSTF-BA1801-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E.
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
