Vellykket In vivo Calcium Imaging med en Head-Mount Miniaturized Mikroskop i Amygdala af frit opfører Mus
Summary
In vivo mikroskopisk calciumbilleddannelse er et uvurderligt værktøj, der muliggør realtidsovervågning af neuronale aktiviteter i frit barbering af dyr. Det har dog været vanskeligt at anvende denne teknik på amygdala. Denne protokol har til formål at give en nyttig retningslinje for vellykket målretning amygdala celler med en miniaturiseret mikroskop i mus.
Abstract
In vivo real-time overvågning af neuronale aktiviteter i frit bevægelige dyr er en af de vigtigste tilgange til at forbinde neuronal aktivitet til adfærd. Til dette formål er en in vivo billeddannelsesteknik, der registrerer calciumtransienter i neuroner ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer (GECIs), et miniaturiseret fluorescensmikroskop og en gradient brydningsindeks (GRIN) linse udviklet og anvendt med succes på mange hjernestrukturer1,2 ,3,4,5,6. Denne billeddannelsesteknik er særlig kraftfuld, fordi den muliggør kronisk samtidig billeddannelse af genetisk definerede cellepopulationer i en længere periode op til flere uger. Selvom det er nyttigt, er denne billeddannelsesteknik ikke let blevet anvendt på hjernestrukturer, der lokaliserer dybt inde i hjernen, såsom amygdala, en vigtig hjernestruktur til følelsesmæssig behandling og associativ frygthukommelse7. Der er flere faktorer, der gør det vanskeligt at anvende billeddannelsesteknikken på amygdala. For eksempel forekommer bevægelsesartefakter normalt oftere under billeddannelsen udført i de dybere hjerneområder, fordi et hovedmonteringsmikroskop implanteret dybt i hjernen er relativt ustabilt. Et andet problem er, at lateral ventrikel er placeret tæt på den implanterede GRIN linse og dens bevægelse under respiration kan forårsage meget uregelmæssig bevægelse artefakter, der ikke let kan korrigeres, hvilket gør det vanskeligt at danne en stabil billeddannelse opfattelse. Da cellerne i amygdala normalt er stille i hvile- eller bedøvet tilstand, er det desuden svært at finde og fokusere målcellerne, der udtrykker GECI i amygdala under baseplating-proceduren til senere billeddannelse. Denne protokol giver en nyttig retningslinje for, hvordan man effektivt målrette celler udtrykke GECI i amygdala med hoved-mount miniaturiseret mikroskop for vellykket in vivo calcium imaging i sådan en dybere hjerne region. Det skal bemærkes, at denne protokol er baseret på et bestemt system (f.eks.
Introduction
Calcium er en allestedsnærværende anden messenger, der spiller en afgørende rolle i næsten alle cellulære funktioner8. I neuroner, handling potentielle fyring og synaptisk input forårsage hurtig ændring af intracellulære fri [Ca2 +]9,10. Derfor giver sporing af calciumtransienter en mulighed for at overvåge neuronal aktivitet. GECIs er kraftfulde værktøjer, der gør det muligt at overvåge [Ca2+] i definerede cellepopulationer og intracellulære rum11,12. Blandt mange forskellige typer proteinbaseret calciumindikator er GCaMP, en Ca2 + sonde baseret på et enkelt GFP-molekyle13, den mest optimerede og dermed udbredte GECI. Gennem flere runder af teknik, en række varianter af GCaMP er blevet udviklet12,14,15,16. Vi bruger en af de nyligt udviklede GCaMPs, GCaMP7b, i denne protokol16. GCaMP sensorer har i høj grad bidraget til studiet af neurale kredsløb funktioner i en række model organismer såsom billeddannelse af Ca2 + transienter under udvikling17, in vivo billeddannelse i et bestemt kortikalt lag18, måling af kredsløb dynamik i motor opgave læring19 og billeddannelse af celle ensemble aktivitet i forbindelse med associative frygt hukommelse i hippocampus og amygdala20,21.
Optisk billedbehandling af GECIs har flere fordele22. Genetisk kodning gør det muligt at udtrykke GECIs stabilt i en længere periode i en bestemt delmængde af celler, der er defineret ved genetisk profil eller specifikke mønstre for anatomisk forbindelse. Optisk billeddannelse muliggør in vivo kronisk samtidig overvågning af hundreder til tusinder af neuroner hos levende dyr. Der er udviklet et par optiske billeddannelsessystemer til in vivo-billeddannelse og analyse af GECIs i hjernen hos frit barberende mus med miniaturiserede fluorescensmikroskoper21,23,24,25. På trods af in vivo optisk billeddannelse teknik baseret på GECIs, GRIN linse, og et hoved-mount miniature mikroskop er et kraftfuldt værktøj til at studere forbindelsen mellem neurale kredsløb aktivitet og adfærd, anvende denne teknologi til amygdala har været vanskeligt på grund af flere tekniske problemer i forbindelse med målretning grin linsen til celler udtrykke GECIs i amygdala uden at forårsage bevægelse artefakter, der alvorligt reducere kvaliteten af billedopsamling og finde celler udtrykke GECIs. Denne protokol har til formål at give en nyttig retningslinje for kirurgiske procedurer for bundplade vedhæftet fil og GRIN linse implantation, der er kritiske skridt for en vellykket in vivo optisk calcium billeddannelse i amygdala. Selvom denne protokol er rettet mod amygdala, er de fleste procedurer, der er beskrevet her, almindeligt anvendelige for andre dybere hjerneregioner. Selv om denne protokol er baseret på et bestemt system (f.eks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dygtige kirurgi teknikker er afgørende for at opnå en vellykket in vivo optisk calcium billeddannelse med hoved-mount miniature mikroskopi i dybere hjerne regioner såsom amygdala som vi beskrev her. Derfor, selv om denne protokol giver en retningslinje for optimerede kirurgiske processer af bundplade vedhæftet fil og GRIN linse implantation, yderligere optimering processer kan være nødvendige for kritiske trin. Som nævnt i protokolafsnittet skal amygdalakoordinater i kirurgi, luftstrømshastighed i fastgørelsestr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
