Summary
生体内の微小内視鏡的カルシウムイメージングは、動物の行動を自由に行う神経活動をリアルタイムで監視できる貴重なツールです。しかし、扁桃体にこの技術を適用することは困難であった。このプロトコルは、マウスの顕微鏡を小型化した扁桃体細胞を標的にするための有用なガイドラインを提供することを目的としています。
Abstract
自由に動く動物の神経活動のリアルタイムモニタリングは、神経活動を行動に結びつける重要なアプローチの1つです。このため、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)、蛍光顕微鏡の微細化、および勾配屈折率(GRIN)レンズを用いてニューロンのカルシウム過渡症を検出するinvivoイメージング技術が開発され、多くの脳構造1、2、3、4、5、6に応用することに成功しました。このイメージング技術は、遺伝的に定義された細胞集団の長期にわたる数週間の慢性同時イメージングを可能にするため、特に強力です。有用であるが、このイメージング技術は、扁桃体、感情処理および連想恐怖記憶7に不可欠な脳構造である扁桃体などの脳内の深部に位置する脳構造に容易に適用されていない。扁桃体にイメージング技術を適用することが困難になるいくつかの要因があります。例えば、運動アーチファクトは、通常、脳の深部に移植されたヘッドマウント顕微鏡が比較的不安定であるため、より深い脳領域で行われるイメージング中により頻繁に発生する。もう一つの問題は、横心室が埋め込まれたGRINレンズの近くに位置し、呼吸中のその動きが、容易に矯正できない非常に不規則な運動アーチファクトを引き起こし、安定したイメージングビューを形成することが困難になることです。さらに、扁桃体の細胞は通常安静状態または麻酔状態で静かであるため、後のイメージングのための基固め手順の間に扁桃体中のGECIを発現する標的細胞を見つけて焦点を合わせるのは難しい。このプロトコルは、扁桃体でGECIを発現する細胞を頭部小型化顕微鏡で効率的に標的化し、このようなより深い脳領域で生体内カルシウムイメージングを成功させる方法に関する有用なガイドラインを提供する。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、それに限定されないことに留意された。
Introduction
カルシウムはユビキタスな第二のメッセンジャーであり、ほぼすべての細胞機能8において重要な役割を果たしている。ニューロンにおいて、作用電位焼成およびシナプス入力は、細胞内遊離の急速な変化を引き起こす [Ca2+]9,10.したがって、カルシウム過渡性を追跡することは、神経活動を監視する機会を提供する。GEC は、定義された細胞集団および細胞内区画11,12で [Ca2+] を監視できる強力なツールです。タンパク質ベースのカルシウム指標の多くの異なるタイプの中で、GCaMPは、単一のGFP分子13に基づくCa2+プローブで、最も最適化され、広く使用されているGECIです。複数のエンジニアリングを通じて、GCaMPの多くのバリエーションが12、14、15、16で開発されました。我々は、このプロトコル16で最近開発されたGCaMPの1、GCaMP7bを使用しています。GCaMPセンサは、開発中のCa2+過渡現象のイメージング、特定皮質層18における生体内イメージング、運動タスク学習19における回路ダイナミクスの測定、海馬および扁桃体20、20の連想恐怖記憶に関連する細胞アンサンブル活動のイメージングなど、多くのモデル生物における神経回路機能の研究に大きく貢献してきた。
GECI の光学イメージングには、いくつかの利点があります。遺伝的コード化により、GECは、遺伝的プロファイルまたは解剖学的接続性の特定のパターンによって定義される特定のサブセットの細胞において、長期間安定して発現することが可能になります。光学イメージングは、生きている動物のニューロンの数百から数千の生体内の慢性同時監視を可能にします。脳内でのGECのイメージングおよび解析のために、ヘッドマウント小型蛍光顕微鏡21、23、24、25を用いて、マウスを自由に振る舞う光学イメージングシステムがいくつか開発されている。GECを用いたin vivo光学イメージング技術、GRINレンズ、およびヘッドマウント小型顕微鏡は神経回路活動と行動との関連を研究する強力なツールであるにもかかわらず、この技術を扁桃体に適用することは、扁桃体でGECを発現する細胞に対するいくつかの技術的な問題により困難であった。このプロトコルは、扁桃体における生体内光学カルシウムイメージングを成功させるための重要なステップであるベースプレート付着およびGRINレンズ注入の外科的処置に役立つガイドラインを提供することを目的としている。このプロトコルは扁桃体を標的としますが、ここで説明するほとんどの手順は、一般的に他のより深い脳領域に適用されます。このプロトコルは特定のシステム(例えば、Inscopix)に基づいているが、他の代替システムでも同じ目的が容易に達成され得る。
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Protocol
すべての手続きは、韓国科学技術院の動物倫理委員会によって承認されました。すべての実験は、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従って行われました。
注:このプロトコルは、ウイルス注入手術、GRINレンズインプラント手術、GRINレンズ注入の検証、ベースプレートアタッチメント、行動テスト中のGCaMP信号の光学記録、およびデータ処理の6つの主要なステップで構成されています(図1A)。手術以外は市販のソフトウェアパッケージ(Inscopix)を使用しています。
1. 立体的手術 – AAV ウイルス注射
注意:この外科処置で使用されるマウスの緊張はC57BL6/Jである。動物の体は手術中に無菌ドレープで覆われており、プロトコルのすべてのステップは無菌手袋を着用して行われます。複数の手術は通常、同じ日に行われません。しかし、複数のマウスが同じ日に同じ手術を受ける必要がある場合は、マウスごとにオートクレーブされた外科用具の別々のセットを使用し、70%エタノールを使用してマウス間の手術器具を消毒する。外科的処置の間にマウスを暖かく保つために、マウスは立体的フレームに固定された後にカスタムメイドの外科用毛布で覆われる。
- 必要なすべての手術用具を70%エタノールで消毒し、ハミルトン注射器とガラスピペットを準備します。ガラスピペットに蒸留水を入れます。
注: プロトコルで使用されるすべての外科ツールはオートクレーブされています。GRINレンズとスカルスクリューは殺菌のためにオートクレーブすることができないため、70%エタノールが炎症を防ぐための消毒剤として使用されます。試みていないが、他の形態の殺菌は、例えばガスまたは化学殺菌を用いることができる。 - 腹腔内注射によりペントバルビタール(体重83mgのkg-1) でマウスを麻酔します。マウスが意識を失った後、頭蓋骨の毛を剃ります。
- 70%エタノールで頭蓋骨の上の皮膚をきれいにし、ステレオタックスフレームにマウスを固定します。慎重に皮膚を取り除き、綿先端アプリケーターを使用して35%過酸化水素溶液で頭蓋骨表面を拭きます。手術中に角膜乾燥を防ぐために潤滑剤の目軟膏を塗布してください。
注:通常、無菌性皮膚製剤にのみ70%エタノールを使用することに問題はありませんが、例えばヨウ素またはクロルヘキシジン溶液、および70%エタノールなどの消毒剤の3つの交互ラウンドを使用することをお勧めします。 このプロトコルでは、過酸化水素の濃度が高く、マウスの頭蓋骨上の結合組織が可能な限り完全に除去されるようにするために使用され、頭蓋骨の結合組織が頭蓋骨へのベースプレートのしっかりとした付着を妨げるため、後のイメージング中に動きアーティファクトを減らすために重要です。なお、過酸化水素35%は、通常使用されているものよりはるかに高い(3%)。 - ステレオタックスプローブホルダーでピンを固定します。ブレグマとラムダの高さをピンに合わせます。
- 頭蓋骨頭蓋切り出しのために、マウスの頭蓋骨上の特定の位置を見つけます。
注: ウイルス注入のための側扁桃体 (LA) の座標は、(AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.5 mm, -4.3 mm) このプロトコル (AP;前部-後部、ML;内側-ラテラル、DV;側側-腹側、各略語はブレグマからの相対軸距離を示す)26.座標は、実験条件ごとに最適化する必要があります。 - 頭蓋骨の表面をドリルする(図1B)。リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で頭蓋骨の分画を洗います。鉗子または27Gの針を使用して残りの層を取除く。
- 頭蓋骨を掘削するときは、脳組織表面への損傷を避けるために最後の硬膜層に触れないようにしてください。脳表面の損傷は、レンズの周りに炎症を引き起こし、記録中に重度の運動アーティファクトおよび高い自己蛍光を誘発する。頭蓋骨の大きさは1.6mmです。ドリル速度は18,000 rpm、ビットサイズは0.6mmです。
- 掘削部位の脳組織表面から標的扁桃体部位にGRINレンズを下げる場合、ブレグマに基づいて設定されたレンズ注入のDV座標からブレグマと露出した脳表面の間のDV差を差し引くことによって、「値A」と名付けられた距離を計算する(この場合は図1C)。
- 3 μLの鉱物油と0.7 μLのAAVウイルス溶液をガラスピペットにロードします。
注:ミネラルオイルは、ウイルス溶液と水を分離するのに役立ちます。0.7 μL は LA ウイルスインジェクション用に最適化されたボリュームで、LA を完全にカバーできます。 - ステレオタックスプローブホルダーからピンを取り外し、ガラスピペットを固定します。
- ステップ 1.5 で言及した注入部位でガラスピペットを見つけます。出血が完全に停止した後、ガラスピペットを脳組織に挿入します。
- 注入ポンプを使用してガラスピペットを介してウイルスを送達します。
注: 十分な数の GCaMP 発現細胞を得るために、ウイルスの力価は 1 x10 13 vg/mL より高くする必要があります。射出速度は0.1 μL/min、拡散は10分間です。出血がある場合は、PBSで脳表面を洗います。このステップで脳表面を濡らしてください。 - 注入を終えた後、ガラスピペットをゆっくり取り外します。
2. 立体外科 – GRINレンズの注入
注:GRINレンズインプラント手術は、このプロトコルの中で最も重要なステップです。GRINレンズの動きの一貫した遅い速度は成功したGRINレンズの注入のために重要であるので、モーター付きの外科の腕は有用であり得る。電動手術アームは、コンピュータソフトウェアによって制御される立体的マニピュレータです。電動アームはこのプロトコルで使用されますが、レンズが一貫してゆっくりと着床している限り、他の方法も使用できます。デバイスの詳細については、 資料一覧を参照してください。
- 頭蓋骨をドリルして2本の頭蓋骨ねじを埋め込みます。PBSですべての頭蓋骨の分数を洗います。
メモ:後で光学的なイメージングでモーションのアーチファクトを減らすには、少なくとも2つのネジが必要です。2本の頭蓋骨ねじとGRINレンズインプラント位置は、等三角形を形成する(図1B)。開頭術の大きさは、ネジの直径にしっかりとフィットする必要があります。出血がある場合は、PBSで出血表面を洗います。ドリル速度は18,000 rpm、ビットサイズは0.6mmです。 - 炎症を防ぐために70%エタノールでネジを消毒します。できるだけ深いネジを埋め込みます。
注:ネジはセメントなどの追加の接着なしでしっかりと固定する必要があります。 - ステレオタックスフレームに電動手術アームを取り付けます。必要なハードウェアを、制御ソフトウェアがインストールされているラップトップ コンピュータに接続します (資料一覧) 。
- GRINレンズを下げる前に、26G針で針路を作る準備をしてください。
注:ニードルトラックは、注射経路に沿って脳構造の深刻な歪みを引き起こすことなく、扁桃体などの深部脳領域に比較的厚いGRINレンズを埋め込むのに役立つガイドトラックの一種です。このガイドトラックは、比較的薄い26G針の下降と上昇手順によって作られるため、ニードルトラックと呼ばれています。 - カニューレホルダーを取り付けて、ステレオタックスフレームの針を安定して保持します。
- カニューレホルダーで26G針を握り、針挿入部位の座標を計算します。
注: このプロトコルでは、針挿入部位の座標は、ウイルス注入部位(AP、ML、DV)=(-1.6 mm、-3.55 mm、-3.7 mm)から50 μmの横座標です。 - 制御ソフトウェアにアクセスし、針の位置を操作するための完全な準備をします。
- 制御ソフトウェアを実行し、 新しいプロジェクトの開始 ボタンを選択してセッションの制御を開始します。
メモ: 制御セッションでは、いくつかの空白のボックスとメニューボタンがあります。空白のボックスは座標の入力スペースです。空白のボックスに座標を入力すると、電動ステレオタックス アームは [移動 ] ボタンをクリックして移動します。立体的なアームが動いているときに、[ 移動 ] ボタンが [停止 ] ボタンに変わります。いくつかのメニュー ボタンの中で、このプロトコルでは ツール ボタンのみが必要です。 - [ツール] ボタン を クリックします。フレームメニューボタンをクリックして、制御ソフトウェア を調整 します。キャリブレーションとは、ステレオ ドライブ ソフトウェア上の値としてマニピュレータの実際の位置を設定するプロセスです。
- 制御ソフトウェアを実行し、 新しいプロジェクトの開始 ボタンを選択してセッションの制御を開始します。
- 立体マニピュレータを使用して、頭蓋骨表面の露出した脳表面で針の先端を見つけます。
注: 針の速度は、ツールメニューのマイクロドライブ速度メニューを使用して設定されます。デフォルトの速度は 3.0 mm/s です。ただし、この手順では 0.5 mm/s の速度を推奨します。針の動きは矢印キーによって制御されます。 - 脳表面を濡らし続けるためにPBSの2〜3滴を追加します。コンピュータ画面上の空白のボックスに、LA の適切な DV 座標を入力します。脳表面が乾燥している場合,針の脳組織への侵入を妨げる。
- [ 移動 ] ボタンをクリックして、26 G 針を下げます。これは、針がDV座標で設定されたターゲット部位に到達すると自動的に停止します。針の速度は100 μm/分です。出血がある場合は 、STOP ボタンをクリックして針を止め、PBSで脳表面を洗います。このステップで脳表面を濡らしてください。出血を止めた後、再び下げ始める。
- 針が完全に動かなくなったら、コンピュータ画面上の空白のボックスに45.00mmと入力します。
注: 45.00 mm は、針を開始位置に戻す DV 座標の値です。 - [移動] ボタンをクリックして、針 を上げ 針の動きの速度は100-200 μm/分である。
- 針が動かなくなったら、脳表面のPBSを取り除きます。ステレオタックス フレームから針とカニューレ ホルダーをアンインストールします。実験者は、必要に応じて [STOP] ボタンをクリックして、手動で針を停止することができます。
- ステレオタックスロッドにレンズホルダーを装備します。GRINレンズをレンズホルダーに取り付けます。
注: LA (直径 0.6 mm、長さ 7.3 mm) をターゲットに最適化された GRIN レンズをこのプロトコルで使用します。レンズホルダーが用意されていない場合は、ブルドッグクリップを使用してGRINレンズを握る方法があります。 - 70%エタノールでレンズを消毒し、立体性の棒を立体帯に取り付けます。
- GRINレンズの先端を、頭蓋骨表面の指定部位に位置付けます(ステップ2.8で説明した方法と同じ方法)。
注: GRIN レンズの座標は (AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.55 mm, -4.2 mm) (図 1C)です。レンズは先端の損傷を避けるために頭蓋骨に触れてはならない。 - ステップ2.16で説明したレンズ注入のDV座標から「値A」の絶対値を差し引いてDV座標を計算する。
- 脳表面にPBSの2〜3滴をドロップします。下げる場合は1000 μm、コンピュータ画面上の空白のボックスにレンズを上げる場合は300 μmと入力します。
- 目標部位に到達するまで、GRINレンズを下げ(1000μm下方)、上方(300μm)上げます。この上下の手順は、そうでなければ、移植経路に沿って脳構造の歪みを引き起こす可能性のあるレンズの低下手順のために脳組織内で発生する圧力を解放するのに役立ちます。
注:GRINレンズの動きの速度は100 μm/minです。もし出血があっても、GRINレンズの動きを止め、脳表面をPBSで洗ってください。このステップで脳表面を濡らしてください。脳表面が乾燥している場合、脳組織はGRINレンズ表面に固執し、脳構造の歪みを引き起こす。 - GRINレンズがターゲット部位に到達した場合は、PBSを取り外し、GRINレンズ、ネジ、およびサイドウォールの周囲に慎重に樹脂歯科用セメントを塗布します(図1D)。
注: 頭蓋骨全体に樹脂セメントを塗布すると、動きが減少する場合があります。逆に、樹脂セメントが誤って頭蓋骨に付着した筋肉を覆う場合、それは動きのアーティファクトを増加させます。 - 樹脂製歯科用セメントが硬化した後、GRINレンズをレンズホルダーから分解し、頭蓋骨全体にアクリルセメントを塗布します(図1D)。
- ヘッドプレートを取り付けるには、ステレオタキシックロッドからレンズホルダーを分解し、テープを使用してロッドの先端にヘッドプレートを取り付けます。ヘッドプレートが水平かどうかを確認します。
注: ヘッド プレートが傾いている場合は、傾斜したビューが発生します。ヘッドプレートは、モバイルホームケージシステム(ベースプレート取り付けセクション)でマウスヘッドを固定するために必要です。実験者がシステムを使用しない場合は、このステップ(ステップ2.22)をスキップし、次のステップ2.23を実行します。 - ヘッドプレートがレンズカフの上部に位置するまで、ロッドをゆっくりと下げます。ヘッドプレートを1000μm以上下げます。埋め込まれた GRIN レンズのヘッドプレートを移動して、ヘッドプレートの内部リングの右端に配置します。
注:ヘッドプレートは、埋め込まれたGRINレンズ表面よりも低く配置する必要があります。そうでない場合、マイクロエンドスコープは、アクリルセメントによる焦点面を調整するために、埋め込まれたGRINレンズに十分近づくことはできません。 - アクリルセメントを適用してヘッドプレートをセメント層に取り付けます (図1D)。
- 埋め込まれたGRINレンズ表面にパラフィンフィルムを取り付け、レンズ表面を埃から保護します。その後、パラフィンフィルムに取り外し可能なエポキシ結合を塗布し、パラフィンフィルムをレンズ表面に残しておく。
- 鎮痛薬であるカルプロフェン(PBSで0.5mg/mL)、抗炎症薬であるデキサメタゾン(PBSで0.02mg/mL)溶液をマウスの腹腔に注入する。
注:薬物の用量は体重に依存する:カルプロフェン(体重の5 mg∙kg-1) とデキサメタゾン(体重の0.2 mg∙kg-1)。 カルプロフェンとデキサメタゾンの両方が手術後に、手術後7日間1日1回投与される。 - 0.3 mg/mLアモキシシリンを家庭のケージ水に混ぜて1週間投与する。
- マウスをホームケージに戻し、回復とウイルスの導入のために5〜8週間を許可します。
注:マウスが麻酔薬から目を覚ますまで、マウスは電気毛布の上に温め込まれたケージで回収されます。
3. GRINレンズ注入の検証
注:GRINレンズの注入の検証は、埋め込まれたGRINレンズがGCaMP発現細胞に対してオンターゲットであるかどうかに関する情報を提供します。この情報に基づいて、実験者は、オフターゲットGRINレンズの注入を有する動物を除外することにより、行動試験やデータ処理などの時間のかかるプロセスから時間を節約します。検証手順の間、GCaMP 式を持つセルは、記録フィールドにフォーカスする必要があります。この手順では、モバイル ホーム ケージを使用します。モバイルホームケージは、GRINレンズの注入とベースプレートアタッチメントの検証中に、ヘッド固定マウスが足を自由に動かすことができる特殊な丸型装置です。この装置の中に頭部固定マウスの脚が置かれている空輸テーブルは、頭部が固定されているが脚の自由な移動を可能にする。扁桃体の横核の細胞は通常、安静状態または麻酔状態で静かであるため、GCaMP蛍光シグナルはこれらの状態でほとんど検出されず、GRINレンズ注入およびベースプレート付着の検証中にGCaMPを発現する細胞を見つけることは非常に困難であり、時には不可能である。しかし、脚の動きは、しばしば扁桃体の横核の細胞にGCaMP蛍光シグナルを生成し、それによって顕微鏡を見つけるのに役立ちます。したがって、モバイルホームケージはこのプロトコルで使用されます。
- ステレオタキシックマニピュレータをモバイルホームケージシステムに組み立てます。
- 1.5%のイソフルランガスでマウスを麻酔します。マウスが完全に無意識になった後、モバイルホームケージシステムのヘッドバーにマウスを置きます。
- マウスの下のカーボンケージを見つけます。カーボンケージを閉じ、気流をオンにして、ケージを摩擦なく自由に動かします。マウスがアクティブになるまで数分待ちます。
注: 気流の速度は、実験条件ごとに最適化する必要があります(ここでは、100 L/分)。 - 埋め込まれたGRINレンズの表面にパラフィンフィルムとエポキシボンドを取り除き、レンズ紙を用いて70%エタノールでレンズ表面を拭きます。
- データ収集(DAQ)ソフトウェア(例えば、Inscopix)を準備します。イメージング条件を設定します。
メモ:DAQソフトウェアは、マイクロスコープ(LEDパワー、レンズフォーカスなど)およびデータストレージの制御に使用されます。- DAQボックスの電源を入れ、顕微鏡を差し込みます。次に、ケーブルを使用するか、無線インターネットを介してラップトップコンピュータに接続します。
注:DAQソフトウェアは、DAQボックスと呼ばれる追加のハードウェア(例えば、Inscopix)にインストールされています。DAQボックスをラップトップコンピュータに接続することで、ラップトップコンピュータでDAQソフトウェアにアクセスできるようになります。 - インターネットブラウザを介してDAQソフトウェアにアクセスします(Firefoxをお勧めします)。
- 定義されたセッションで必要な詳細情報 (日付、マウス IDなど)をすべて設定します。[保存して続行] をクリックします。保存後に、実行セッションにアクセスします。
- [ セッションの実行] で、露光時間、ゲイン、電子フォーカス、露出 LED 電源などのイメージング条件を設定します。
メモ:ゲインと露光LEDの電力は、実験室の条件に応じて変更可能です。電気的フォーカスの推奨値は 500 で、露光時間は 50 ミリ秒です。LEDパワーとゲインの変更に制限はありません。しかし、光の強度が高いと、より多くの漂白を引き起こす可能性があります。録画の露出時間は、ビデオ録画のフレームレートを決定します。フレームレートが高いほど、信号強度が低下します。フレーム レートは、イメージングに使用する GEC に合わせて最適化する必要があります。
- DAQボックスの電源を入れ、顕微鏡を差し込みます。次に、ケーブルを使用するか、無線インターネットを介してラップトップコンピュータに接続します。
- ステレオタックスマニピュレータに顕微鏡を保持するには、ステレオタキシックマニピュレータに顕微鏡グリッパー付きの立体的なロッドを取り付けます。
注意:グリッパーは、ステレオタックス装置に取り付けることができ、標的の脳の位置に置く顕微鏡本体を保持することができる小さな付属品である。 - 顕微鏡のグリッパーで顕微鏡をつかみなさい。マイクロスコープに接続されたLEDライトをオンにし、顕微鏡を垂直に位置合わせします。埋め込まれたGRINレンズの表面が現れるまで画像を観察しながら顕微鏡を下ろします。
- 埋め込まれた GRIN レンズの中央をビューの中央に合わせます。
注: GRIN レンズの注入の検証はこのステップで行うことができる(結果のセクション、 図2B、 図2D、 図2Fで述べた)。 - 埋め込まれたGRINレンズ表面のキャプチャ画像(キーボードの Prt Sc ボタンをクリック)。移植されたGRINレンズ表面の画像は、後のデータ処理中に非神経細胞成分の選択解除に必要である(ステップ6.8)。
- 顕微鏡の適切な位置を見つけます。画像を観察しながら顕微鏡の対物レンズをゆっくりと高め、GCaMP7b発現を有する細胞を探索する。
注: 画像取得または露光LED電力のゲインを調整する必要がある場合があります。GRINレンズ注入の検証は、このステップで行うことができる(結果セクション、図2A、図2C、図2Eで述べた)。
4. ベースプレートアタッチメント
メモ:ベースプレート取り付けステップは、GRINレンズの注入の検証に従います。ベースプレートは、マウスの頭部に顕微鏡を取り付けるためのプラットフォームです。前のセクションで説明したように、モバイル ホーム ケージはこのプロトコルで使用されます。
- GRINレンズの注入を検証した後、顕微鏡のグリッパーからミニチュア顕微鏡を分解しなさい。
- ベースプレートを顕微鏡に取り付けます。ベースプレートを顕微鏡に安定して取り付けるには、六重キーを使用してネジを締めます。
- 顕微鏡のグリッパーで顕微鏡をつかみなさい。マイクロスコープに接続されたLEDライトをオンにし、顕微鏡を垂直に位置合わせします。埋め込まれたGRINレンズの表面が観察されるまで顕微鏡を下げる。埋め込まれた GRIN レンズの中央をビューの中央に合わせます。
- 顕微鏡の適切な位置を見つけます。GCaMP7b発現を有する細胞の最良の画像を与える焦点面を見つけるまで、顕微鏡の対物レンズをゆっくりと高める(図2A)。
注: このステップでは、画像取得または露光LED電力のゲインを調整する必要があります。 - アクリルセメントを塗布して、ベースプレートをヘッドプレートに安定して取り付けます(図2G)。ベースプレートとヘッドプレートの間にアクリルセメントでサイドウォールを構築します。
注:アクリルセメントは硬化すると収縮します。このため、セメントが完全に硬化するまで顕微鏡を取り外さない(このステップは少なくとも30分かかります)。セメントは、アクリルセメントで顕微鏡とその対物レンズの不要なセメントを避けるために非常に慎重に行われるべきです。 - アクリルセメントが完全に固まった後、ネジを緩め、ゆっくりと顕微鏡本体を高くします。
- サイドウォールに隙間がある場合は、追加のセメンチングをやり直して、埋め込まれたGRINレンズをほこりから保護します。
- ベースプレートを覆って、埋め込まれたGRINレンズを埃から保護し、ベースプレートのネジを締めます。
- ヘッドバーからヘッドプレートを放します。将来の光学イメージングまでマウスをホームケージに戻します。
5. 行動テスト中のGCaMP信号の光記録
注:動作中のGCaMP信号記録の手順は、光イメージング、実験設計、実験室環境に使用されるシステムによって大きく異なる場合があります。したがって、このセクションでは簡単な方法で説明します。
- 動作テストの前に数日間の処理を行います。
- 動作装置(例えば、恐怖コンディショニングチャンバー、行動ソフトウェア、およびクールボーン機器)とラップトップコンピュータを準備します。
- 顕微鏡をDAQボックスに差し込み、DAQボックスの電源を入れます。
- DAQボックスを無線インターネット接続経由でノートパソコンに接続します。
- ラップトップコンピュータでDAQソフトウェア(Firefoxブラウザを推奨)を起動します。[ ファイルマネージャ ]ボタンをクリックし、DAQボックスの残りのストレージ容量をチェックして、記録されたデータを保存します。
注: データサイズは、30 分の記録で約 80 GB です。 - 定義セッションで必要な情報 (日付、マウス IDなど)を入力し、セッションの実行に入ります。
- そっとマウスをつかみ、その頭のベースプレートカバーを取り外します。ベースプレートプラットフォーム上に顕微鏡を配置します。
- ベースプレートのネジを締め、頭取りマイクロエンドスコープを備えた動物を行動室に入れます。
注: マウスは、処理が十分でない場合、この手順でエスケープしようとします。 - BNCケーブルを使用して、NIボードをDAQボックスのTRIGポートに接続します。NIボードは、動作ソフトウェア(フリーズフレームなど)からTTL信号を受信し、GCaMP信号と動物の行動の同時記録手順を調整します。
- 焦点面を調整します。
注:焦点面は、顕微鏡の対物レンズと脳に埋め込まれたGRINレンズとの距離によって決定されます。焦点面を調整するために、画像を観察しながら対物レンズの位置を操作します。細胞と血管の明確な形態を示すこれら2つのレンズ間の距離は、イメージングのための焦点面として設定されています。このプロトコルでは、DAQソフトウェアを使用して、調整中の対物レンズの動きを制御します。 - ラン・セッションで、最適化された露光時間、ゲイン、LED電源を設定します。
注: 通常、50 ミリ秒は露光時間に使用されます。ゲインとLEDのパワーは、画像ヒストグラムに基づいて設定されます。ヒストグラムは、ピクセルの蛍光強度の分布を示します。目視検査に基づいて、GCaMP7bの場合、ヒストグラムの右端の値は40%から60%の間になければなりません。イメージングに使用する GEC によって変わります。 - 記録オプションを 「トリガー済み記録」に変更します。[ 記録 ] をクリックして動作を開始します。
注: トリガーされた記録オプションは、記録セッションと動作セッションの一致したタイムラインを提供します。TTL 信号を受信すると、TRIG ポートの上の赤色のライトが点灯します。 - 動作試験を終えた後、顕微鏡を取り外し、ベースプレートカバーを取り付けます。
- マウスをホームケージに戻します。次に、[ ファイル マネージャ] を 選択し、[DAQ] ボックスからデータをエクスポートします。
- 行動テストの後、死後の組織学的検証のためにマウスを犠牲にする。
6. データ処理
注: データ処理手順は、データ処理ソフトウェアとイメージング実験に使用する GEC によって大きく異なります。したがって、このセクションでは簡単な方法で説明します。このプロトコルは、商用データ処理ソフトウェアを使用します ( 資料表を参照)。また、説明のセクションで言及されている他のオープンソースソフトウェアも問題なく使用することができます。このプロトコルで使用される変数は 、表 1に示しています。
- 録画ビデオ データ ファイル (1280 ピクセル x 800 ピクセル) を DAQ ボックスからデスクトップ コンピュータにインポートして、データ処理を行います。データ処理ソフトウェアを起動します。
注: データ処理ソフトウェアは、前の手順での DAQ ソフトウェアとは異なります。データ処理ソフトウェアでは、ダウンサンプリング、トリミング、空間フィルター、モーション補正、ΔF/F計算、記録されたビデオから単一細胞カルシウム過渡データを抽出するために必要なイベント検出の6つのステップがあります。 - ビデオをダウンサンプリングしてトリミングします。
注: データ処理速度を向上させるためには、ダウンサンプリングとトリミングが必要です。GCaMP信号が観測される対象領域以外の領域をトリミングします。 - 空間フィルターを適用します。空間フィルターを適用した後、平均強度投影画像を作成します。
注: 空間フィルターは、録画されたビデオ 画像の各ピクセルを区別し、ハイ コントラストイメージを提供します。カットオフフィルターには、ローカットオフフィルターとハイカットオフフィルターの2種類があります。カットオフ フィルタの値が小さいと、画像のコントラストは大きくなりますが、グレーノイズ全体が同じでも増加します。高カットオフフィルタの値が小さいと、画像がぼやけます。 - モーション補正を適用します。平均強度投影画像をモーション補正の基準画像として使用します。
- 最初のフレームの画像を基準画像として、モーション補正を再度適用します。
注: モーション補正の 2 つのステップは、モーションアーティファクトを大幅に減少させます。 - 明るさの変化を示すピクセルを視覚化するには、ΔF/F 計算を適用します。
注:ピクセルの明るさの変化は、GCaMPの蛍光強度の変化によって引き起こされ、カルシウム過渡性を示します。 - PCA/ICAアルゴリズムを適用して、各細胞のカルシウム過渡曲線を可視化します。
注: PCA/ICA は、データのグループを単一のコンポーネント データのセットに並べ替えるアルゴリズムです。変数は、各検査条件に合わせて最適化する必要があります。このプロトコルでは、ICA 時間重み (0.4 は、このプロトコルで使用されます) を除くすべての変数がデフォルトです27. - 以下の注に記載されている基準に基づいて、識別されたコンポーネント間で手動で非神経細胞成分の選択を解除します。
注: この目的には、2 つの主要な基準が使用されます。まず、ニューロンから発生したGCaMP信号は、明確な球形のように見えます。これにより、明確な球形を有する信号のみがニューロンとして選択される。第2に、扁桃体錐体の細胞体の直径が約20μm28、29、30であることが知られているので、この大きさと大まかに一致する信号のみがニューロンとして選択される。GCaMP信号のサイズを決定するために、レンズ表面の撮影画像(ステップ3.9)に基づいて、単一ピクセルの実際のサイズが計算され、単一球形状の最大幅が計算されます。例えば、このプロトコルでは、埋め込まれたGRINレンズの直径は600μmである。したがって、レンズの直径が800ピクセルの場合、単一ピクセルの実際のサイズは1.5μm(20μmは約7ピクセル)である。 - イベント検出機能を適用して、カルシウム一過性(カルシウムイベント)の有意な増加を検出します。
注: このステップでは、イベント最小減衰時間 (τ) と呼ばれる変数が必要です。このプロトコルでは、1.18s は GCaMP7b の最適化変数として使用されます。平均半減衰時間(t1/2=0.82s)は、細胞の自発的な活動中のΔF/F曲線に基づいて計算されます。GCaMP は指数的な減衰に従うため、 τ =
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Representative Results
GRINレンズ注入の検証
セメンテーションによってベースプレートを脳に慢性的に取り付ける前に、GRINレンズの注入を検証する必要があります。レンズの移植に成功した動物では、GCaMP発現細胞と血管の両方が、顕微鏡の対物レンズと埋め込まれたGRINレンズとの距離によって決定される焦点面範囲内で明確に観察された(図2AおよびB)。対照的に、オフターゲット移植を有する動物では、GCaMP発現細胞の鮮明な画像は、焦点外または視野外の範囲内で観察されなかった。焦点が合っていない場合、焦点が合った血管は観察できたが、焦点面範囲内の細胞に対してぼやけた画像しか観察できなかった(図2CおよびD)。視界外の場合、ほとんどの場合血管は観察されず、焦点面範囲内で蛍光シグナルは検出されなかった(図2E)。また、他の場合とは異なり、埋め込まれたGRINレンズは明るいエッジを示した(図2F)。ベースプレートの取り付けは、ターゲットGRINレンズの注入で検証された動物にのみ行われます。
聴覚刺激に応答したLAニューロンにおけるGCaMP信号の記録
このプロトコルでは、擬似ランダム化されたトーン(2.8 kHz、200 msの持続時間、25パルス)の4つの例がマウスに提示され、GCaMP信号はヘッドマウントマイクロエンドスコープを有するマウスのLA細胞に光学的に記録された。一方的な横扁桃体にAAV1-Syn-GCaMP7b-WPREを注射したマウスをイメージングに用いた。GRINレンズの移植に成功した動物では、ウイルス発現細胞および血管が焦点面範囲内で明確に観察された(図3A)。行動条件では、およそ50〜150個の細胞は、通常、ΔF/F画像に示すようにトーンがなくてもLAの視野に有意な蛍光変化を示し、自発的に活性細胞である可能性が高い(図3B)。トーン表示の際、ΔF/F画像解析で決定したGCaMP信号のトーン特異的変化を示したセルはごくわずかです(図3Cおよび図3Dの6セル)。同じ手順を、AAV2/1-CaMKIIα-GFPをコントロールとして注射したマウスにも実施した。GFP発現細胞は焦点面範囲内で検出されたが、ΔF/F画像解析で決定されたトーンの有無にかかわらず、有意な蛍光変化を示す細胞はなかった(図3Eおよび図3F)。
GCaMP発現およびGRINレンズの標的化の組織学的検証のために、死後の脳の冠状動脈部分を蛍光顕微鏡下で調べる(図4Aおよび図4B)。DAPI染色は、GRINレンズ周囲の脳組織の炎症による無傷の細胞と組織損傷の兆候を確認するために使用される(図4C)。
図1:LAにおける生体内 微小内視鏡的カルシウムイメージングのための立体的手術のための模式的ワークフローおよび図 (A)LA における生体内微小内視鏡的カルシウムイメージングの概略的ワークフロー。 (B) ウイルス注射およびGRINレンズインプラント手術のための頭蓋骨切り出し部位の2次元座標を示す顕微鏡写真。2本の頭蓋骨ねじとレンズは、等三角形を形成する。 (C) ウイルス注入部位と埋め込み型GRINレンズとの相対位置を表す図、および「値A」を算出するための概略説明。 (D) 外科手術の最終段階で、頭蓋骨表面からヘッドプレートまでのセメント層の断面。樹脂歯科用セメントは、ネジの壁と埋め込まれたGRINレンズをカバーする必要があります。アクリルセメントは、樹脂歯科用セメントに適用されます。ヘッドプレートはセメント層に取り付けられています。パラフィンフィルムは、埋め込まれたGRINレンズ表面を覆い、ほこりから保護します。取り外し可能なエポキシ結合はパラフィンフィルムの取り外しを防ぐ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ベースプレート付着後のGRINレンズの注入とセメント層の構成の検証。(A) GRINレンズの移植に成功した動物からの代表的な内視鏡的スナップショット画像。GCaMP発現細胞および血管の両方が明確に観察される。 (B)GRIN レンズの移植に成功した動物からの埋め込まれたGRINレンズ表面のスナップショット画像。 (C) 焦点が合っていないGRINレンズの注入を有する動物からの代表的な内視鏡的スナップショット画像。 (D) 焦点外のGRINレンズ注入を有する動物からの埋め込み型GRINレンズ表面のスナップショット画像。焦点が合っていない場合、血管は時々はっきりと観察されるが、焦点面範囲内の細胞のぼやけた画像だけである。 (E) 視野外のGRINレンズの注入を用いた動物からの代表的な内視鏡的スナップショット画像。視野外の場合、ほとんどの場合血管は観察されず、焦点面内で蛍光シグナルは検出されない。 (F) 視野外のGRINレンズ注入を用いた動物からの埋め込み型GRINレンズ表面のスナップショット画像。他の場合とは異なり、この場合は明るいエッジが観察されます。 (G) ベースプレート付着用セメント層の構成。ベースプレートとヘッドプレートはアクリルセメントで取り付けられています。ベースプレートとGRINレンズの間にアクリルセメントで満たされていないスペースが必要です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:LAニューロンにおけるGCaMP信号の記録(A~C)AAV1-Syn-GCaMP7b-WPREを注射したマウスから得られたデータ。(A)動作テスト中の代表的な内視鏡的スナップショットイメージ。GCaMP7b発現細胞および血管は、焦点面範囲内で明確に観察された。(B)ΔF/F信号を示す代表的なスナップショット画像。白線は、行動試験中に対象領域に有意な蛍光変化を示した細胞を示す。スケールバー = 50 μm( C)最大強度投影画像。合計6セルは、GCaMP信号のトーン特異的変化を示した。スケールバー= 50 μm. (D)トーン応答セルの代表ΔF/Fトレース。各色は、パネル(C)で同じ色を持つ各セルに対応しています。(E と F)AAV2/1-CaMKIIα-GFPを注入したマウスから得られたデータ。(E)動作テスト中の代表的な内視鏡的スナップショットイメージ。GFP発現細胞は、焦点面範囲内で明確に検出された。(F) ΔF/F信号を示す代表的なスナップショット画像。スケールバー= 50μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:GRINレンズ位置とGCaMP7b発現の組織学的検証。(A)LA におけるGCaMP7b発現を示す代表的なコロナセクション画像。スケールバー = 200μm. (B) 拡大画像。スケールバー =50μm(C)DAPI 染色信号を示す蛍光顕微鏡画像。スケールバー= 200 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 要因 | 値 |
| 空間ダウンサンプリング係数 | 2 |
| 時間下降サンプリング係数 | 2 |
| 空間フィルター: ハイカットオフ | 0.5 |
| 空間フィルター: ローカットオフ | 0.005 |
| モーション補正: ハイカットオフ | 0.016 |
| モーション補正: ローカットオフ | 0.004 |
| モーション補正: 最大変換 | 20 |
| ΔF/F リファレンス フレーム | 平均フレーム |
| PCA/ICA: ブロックサイズ | 1000 |
| PCA/ICA: 収束しきい値 | 1x10^-5 |
| PCA/ICA: ica経時体重 | 0.4 |
| PCA/ICA: ヌミクス | 120 |
| PCA/ICA: numPC | 150 |
| PCA/ICA: アンミックスタイプ | 時間 |
| イベント検出: 減衰定数 | 1.18 |
| イベントの検出: しきい値 | 4 |
表1:データ処理の変数のリスト
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Discussion
ここで述べたような扁桃体のような深部脳領域における頭部取付小型顕微鏡による生体内光学的カルシウムイメージングの成功を達成するためには、巧みな手術技術が不可欠である。したがって、このプロトコルは、ベースプレートアタッチメントとGRINレンズの移植の最適化された外科プロセスのためのガイドラインを提供しますが、重要なステップのために追加の最適化プロセスが必要な場合があります。プロトコルセクションで述べたように、手術における扁桃体座標、ベースプレート接続ステップにおける気流速度、画像取得設定(フレームレート、LEDパワーなど)をカルシウム記録及び変数(ICA時間重量、イベント最小減衰時間など)で最適化する必要がある。
ベースプレートのアタッチステップは変更できます。ヘッドプレートは、モバイルホームケージで行われたベースプレートアタッチメント中に目を覚ますマウスの頭部を固定するのに役立つため、必要です。しかし、移動式家庭用ケージが実験室で準備されていない場合、イソフルランガス麻酔システムは代替オプションです。この代替方法では、イソフルランガスの濃度が重要である可能性があります。我々は、1.5%のイオブルラン下のマウスの扁桃体でGCaMPシグナルがめったに検出されないことを観察した。それどころか、GCaMPシグナルは0.8%のイオブルラン状態で検出され、マウスはほぼ覚醒状態にとどまるが、この状態では頭部の動きは実質的にない。この麻酔条件により、ヘッドプレートやモバイルホームケージなどの追加のデバイスを使用せずにベースプレートアタッチメントを行うことができます。
スカルスクリュー、セメント、ベースプレート、および顕微鏡の不安定なアタッチメントは、モーション補正ソフトウェアアルゴリズムを使用して補正できるモーションアーチファクトを引き起こす可能性があります。横心室の動きは、現在利用可能なモーション補正ソフトウェアでは簡単に修正できない不規則なタイプのモーションアーティファクトを引き起こすと考えられています。このような不規則な動きのアーティファクトは、海馬や皮質などのほとんどの表面的な脳領域では最小限です。しかし、扁桃体における光学イメージング中に頻繁に検出される。この問題を克服するために、このプロトコルは、GRINレンズをウイルス注入部位から50μm離れた側側(図1C)に移植することを示唆しており、横心室から発生する潜在的な運動アーチファクトを低減することによって画像取得プロセスを大幅に改善する。ウイルス注入部位に対して50μmを設定するが、レンズ注入の目標座標も、側心室に対して設定することができる。このプロトコルでは、イメージングの成功したパフォーマンスのためにウイルス発現部位を正確に標的にすることがより重要であると推論した。そこで、レンズ注入の目標座標を設定するための基準としてウイルス注入座標を用いた。繰り返しの試験を経て、横心室の動きによる動きのアーチファクトを避けながら、効率的にウイルス発現部位を標的とするGRINレンズを可能にする最適条件を確立しました。最終的には、あらゆるモーションアーチファクトを効率的かつ正確に修正できる方法は、将来的に光学イメージングをより深い脳領域にアクセスするのに大きな助けになるでしょう。
頭部取り付け小型顕微鏡による生体内光学カルシウムイメージングは強力なツールであり、最適化されていますが、まだ多くの面で改善の余地があります。このプロトコルは、自由に振る舞う動物の扁桃体におけるリアルタイム神経活動の調査を目的とした研究を促進する。
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Disclosures
著者は開示するものが何もない
Acknowledgments
この研究は、サムスン科学技術財団(プロジェクト番号SSTF-BA1801-10)からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
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