Vellykket In vivo kalsiumavbildning med et hode-Mount Miniatyrisert mikroskop i Amygdala av fritt oppfører seg mus
Summary
In vivo mikroskopisk kalsiumavbildning er et uvurderlig verktøy som muliggjør sanntidsovervåking av nevronale aktiviteter hos fritt oppfører seg dyr. Det har imidlertid vært vanskelig å bruke denne teknikken på amygdala. Denne protokollen tar sikte på å gi en nyttig retningslinje for vellykket målretting av amygdala celler med et miniatyrisert mikroskop hos mus.
Abstract
In vivo sanntidsovervåking av nevronale aktiviteter hos fritt bevegelige dyr er en av viktige tilnærminger for å knytte nevronal aktivitet til atferd. For dette formålet har en in vivo imaging teknikk som oppdager kalsiumtransienter i nevroner ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer), et miniatyrisert fluorescensmikroskop og en gradient brytningsindeks (GRIN) linse blitt utviklet og vellykket brukt på mange hjernestrukturer1,2,3,4,5,6. Denne bildeteknikken er spesielt kraftig fordi den muliggjør kronisk samtidig avbildning av genetisk definerte cellepopulasjoner i en langsiktig periode opptil flere uker. Selv om det er nyttig, har denne bildeteknikken ikke lett blitt brukt på hjernestrukturer som finner dypt inne i hjernen som amygdala, en viktig hjernestruktur for emosjonell behandling og assosiativ fryktminne7. Det er flere faktorer som gjør det vanskelig å bruke bildeteknikken til amygdala. For eksempel forekommer bevegelsesartefakter vanligvis oftere under avbildningen utført i de dypere hjerneområdene fordi et hodemontert mikroskop implantert dypt i hjernen er relativt ustabil. Et annet problem er at sideartikkelen er plassert nær den implanterte GRIN-linsen, og bevegelsen under åndedrett kan forårsake svært uregelmessige bevegelsesartefakter som ikke lett kan korrigeres, noe som gjør det vanskelig å danne en stabil bildevisning. Videre, fordi celler i amygdala vanligvis er stille i hvile eller bedøvet tilstand, er det vanskelig å finne og fokusere målcellene som uttrykker GECI i amygdala under baseplating prosedyre for senere avbildning. Denne protokollen gir en nyttig retningslinje for hvordan du effektivt målretter celler som uttrykker GECI i amygdala med hodemontert miniatyrisert mikroskop for vellykket in vivo kalsiumavbildning i et så dypere hjerneområde. Det bemerkes at denne protokollen er basert på et bestemt system (f.eks. Inscopix), men ikke begrenset til den.
Introduction
Kalsium er en allestedsnærværende andre budbringer, spiller en avgjørende rolle i nesten alle cellulærefunksjoner 8. I nevroner forårsaker virkningspotensial avfyring og synaptisk input rask endring av intracellulær fri [Ca2+]9,10. Derfor gir sporing av kalsiumtransienter en mulighet til å overvåke nevronal aktivitet. GECIer er kraftige verktøy som tillater overvåking [Ca2 +] i definerte cellepopulasjoner og intracellulærerom 11,12. Blant mange forskjellige typer proteinbasert kalsiumindikator er GCaMP, en Ca2 + sonde basert på et enkelt GFP-molekyl13,det mest optimaliserte og dermed mye brukte GECI. Gjennom flere runder med engineering, en rekke varianter av GCaMP har blitt utviklet12,14,15,16. Vi bruker en av de nylig utviklede GCaMPs, GCaMP7b, i denne protokollen16. GCaMP sensorer har i stor grad bidratt til studiet av nevrale kretsfunksjoner i en rekke modellorganismer som avbildning av Ca2 + transienter under utvikling17, in vivo imaging i et bestemt kortikalelag 18, måling av kretsdynamikk i motoroppgavelæring19 og avbildning av celleensembleaktivitet relatert til assosiativ fryktminne i hippocampus og amygdala20,21.
Optisk avbildning av GECIer har flere fordeler22. Genetisk koding gjør det mulig for GECIer å bli stabilt uttrykt i en langsiktig periode i en bestemt undergruppe av celler som er definert av genetisk profil eller spesifikke mønstre av anatomisk tilkobling. Optisk avbildning muliggjør in vivo kronisk samtidig overvåking av hundrevis til tusenvis av nevroner hos levende dyr. Noen optiske bildesystemer er utviklet for in vivo avbildning og analyse av GECIer i hjernen til fritt oppfører seg mus med hode-mount miniatyrisert fluorescensmikroskoper 21,23,24,25. Til tross for in vivo optisk bildeteknikk basert på GECIer, GRIN linse, og en head-mount miniatyr mikroskop som et kraftig verktøy for å studere koblingen mellom neural krets aktivitet og atferd, bruke denne teknologien til amygdala har vært vanskelig på grunn av flere tekniske problemer knyttet til målretting GRIN linsen til celler som uttrykker GECIer i amygdala uten å forårsake bevegelsesartefakter som sterkt redusere kvaliteten på bilde oppkjøp og finne celler uttrykker GECIer. Denne protokollen tar sikte på å gi en nyttig retningslinje for kirurgiske prosedyrer for baseplate vedlegg og GRIN linse implantasjon som er kritiske skritt for vellykket in vivo optisk kalsiumavbildning i amygdala. Selv om denne protokollen retter seg mot amygdala, gjelder de fleste prosedyrene som er beskrevet her, ofte for andre dypere hjerneregioner. Selv om denne protokollen er basert på et bestemt system (f.eks. Inscopix), kan det samme formålet enkelt oppnås med andre alternative systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dyktige kirurgi teknikker er avgjørende for å oppnå vellykket in vivo optisk kalsiumavbildning med head-mount miniatyr mikroskopi i dypere hjerneregioner som amygdala som vi beskrev her. Derfor, selv om denne protokollen gir en retningslinje for optimaliserte kirurgiske prosesser av baseplate vedlegg og GRIN linse implantasjon, kan ytterligere optimaliseringsprosesser være nødvendig for kritiske trinn. Som nevnt i protokolldelen koordinerer amygdala i kirurgi, luftstrømhastighet i baseplatevedleggstrinn, bildeanska…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Samsung Science and Technology Foundation (Prosjektnummer SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
