Summary
In vivo mikroskopisk kalciumavbildning är ett ovärderligt verktyg som möjliggör realtidsövervakning av neuronala aktiviteter hos fritt beter sig djur. Att tillämpa denna teknik på amygdala har dock varit svårt. Detta protokoll syftar till att ge en användbar riktlinje för att framgångsrikt rikta amygdala celler med ett miniatyriserat mikroskop hos möss.
Abstract
In vivo realtidsövervakning av neuronala aktiviteter hos fritt rörliga djur är en av viktiga metoder för att länka neuronal aktivitet till beteende. För detta ändamål har en in vivo-bildteknik som detekterar kalciumöverstienter hos nervceller med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs), ett miniatyriserat fluorescensmikroskop och en gradient brytningsindex (GRIN) lins utvecklats och framgångsrikt applicerats på många hjärnstrukturer1,2,3,4,5,6. Denna bildframställningsteknik är särskilt kraftfull eftersom den möjliggör kronisk samtidig avbildning av genetiskt definierade cellpopulationer under en långsiktig period upp till flera veckor. Även om det är användbart, har denna bildteknik inte lätt tillämpats på hjärnstrukturer som lokaliserar djupt inne i hjärnan som amygdala, en viktig hjärnstruktur för känslomässig bearbetning och associativt rädslaminne7. Det finns flera faktorer som gör det svårt att tillämpa bildtekniken på amygdala. Till exempel förekommer rörelseartefakter vanligtvis oftare under avbildningen som utförs i de djupare hjärnregionerna eftersom ett huvudmonterat mikroskop implanterat djupt i hjärnan är relativt instabilt. Ett annat problem är att den laterala ventrikeln är placerad nära den implanterade GRIN-linsen och dess rörelse under andning kan orsaka mycket oregelbundna rörelseartefakter som inte lätt kan korrigeras, vilket gör det svårt att bilda en stabil bildvy. Dessutom, eftersom celler i amygdala är vanligtvis tysta i vilande eller bedövade tillstånd, är det svårt att hitta och fokusera målcellerna som uttrycker GECI i amygdala under baseplating förfarande för senare bildbehandling. Detta protokoll ger en användbar riktlinje för hur man effektivt riktar in sig på celler som uttrycker GECI i amygdala med huvudmonterade miniatyriserade mikroskop för framgångsrik in vivo kalcium imaging i en så djupare hjärnregion. Det bör noteras att detta protokoll bygger på ett visst system (t.ex. Inscopix) men inte begränsat till det.
Introduction
Kalcium är en allestädes närvarande andra budbärare, spelar en avgörande roll i nästan alla cellulära funktioner8. I nervceller orsakar potentiell bränning och synaptisk ingång snabb förändring av intracellulär fri [Ca2 +]9,10. Därför ger spårning av kalciumtransienter en möjlighet att övervaka neuronal aktivitet. GECIs är kraftfulla verktyg som möjliggör övervakning [Ca2+] i definierade cellpopulationer och intracellulära fack11,12. Bland många olika typer av proteinbaserad kalciumindikator är GCaMP, en Ca2 + sond baserad på en enda GFP-molekyl13, den mest optimerade och därmed allmänt använda GECI. Genom flera tekniska rundor har ett antal varianter av GCaMP utvecklats12,14,15,16. Vi använder en av de nyligen utvecklade GCaMPs, GCaMP7b, i detta protokoll16. GCaMP-sensorer har i hög grad bidragit till studien av neurala kretsfunktioner i ett antal modellorganismer som avbildning av Ca2 + transienter underutveckling 17, in vivo-avbildning i ett specifiktnärskikt 18, mätning av kretsdynamik i motoruppgiftsinlärning19 ochbildbehandling av cellensembleaktivitet relaterad till associativt skräckminne i hippocampus och amygdala20,21.
Optisk avbildning av GECIs har flera fördelar22. Genetisk kodning gör det möjligt att stabilt uttrycka GECIs under en långsiktig tidsperiod i en specifik delmängd av celler som definieras av genetisk profil eller specifika mönster för anatomisk anslutning. Optisk avbildning möjliggör in vivo kronisk samtidig övervakning av hundratals till tusentals nervceller hos levande djur. Några optiska bildsystem har utvecklats för in vivo-avbildning och analys av GECIs i hjärnan av fritt beter sig möss med huvudmonterade miniatyriserade fluorescensmikroskop21,23,24,25. Trots att in vivo optisk bildteknik baserad på GECIs, GRIN-lins och ett huvudmonterat miniatyrmikroskop är ett kraftfullt verktyg för att studera sambandet mellan neural kretsaktivitet och beteende, har det varit svårt att tillämpa denna teknik på amygdala på grund av flera tekniska problem relaterade till att rikta GRIN-linsen till celler som uttrycker GECIs i amygdala utan att orsaka rörelseartefakter som allvarligt minskar kvaliteten på bildförvärv och hitta celler som uttrycker GECIs. Detta protokoll syftar till att ge en användbar riktlinje för kirurgiska ingrepp av baseplate bilaga och GRIN lins implantation som är kritiska steg för framgångsrika in vivo optiska kalcium imaging i amygdala. Även om detta protokoll riktar sig till amygdala, de flesta förfaranden som beskrivs här är allmänt tillämpliga på andra djupare hjärnregioner. Även om detta protokoll är baserat på ett visst system (t.ex. Inscopix), kan samma syfte lätt uppnås med andra alternativa system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av animaliska kommittén vid Korea Advanced Institute of Science and Technology. Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjen för den institutionella kommittén för djurvård och användning.
OBS: Detta protokoll består av sex viktiga steg: virusinjektionskirurgi, GRIN-linsimplantatkirurgi, validering av GRIN-linsimplantation, basplattafäste, optisk registrering av GCaMP-signal under ett beteendetest och databehandling (Figur 1A). Förutom kirurgi används det kommersiella mjukvarupaketet (Inscopix).
1. Stereotaxisk kirurgi – AAV Virusinjektion
OBS: Musstammen som används i detta kirurgiska ingrepp är C57BL6/J. Djurets kropp är täckt med ett sterilt draperi under operationen och alla steg i protokollet utförs med att bära sterila handskar. Flera operationer utförs vanligtvis inte samma dag. Men om flera möss måste genomgå samma operation samma dag, använd en separat uppsättning autoklaverade kirurgiska verktyg för varje mus och 70% etanol för att desinficera de kirurgiska instrumenten mellan möss. För att hålla musen varm under det kirurgiska ingreppet är musen täckt med en skräddarsydd kirurgisk filt efter fixerad vid stereotaxisk ram.
- Desinficera alla nödvändiga kirurgiska verktyg med 70% etanol och förbered en Hamilton-spruta och en glaspipett. Fyll glaspipetten med destillerat vatten.
OBS: Alla kirurgiska verktyg som används i protokollet är autoklaverade. Eftersom GRIN-linsen och skallskruvarna inte kan autoklaveras för sterilisering används 70 % etanol som desinfektionsmedel för att förhindra inflammation. Även om det inte provas kan andra former av sterilisering användas, t.ex. gas- eller kemisk sterilisering. - Bedöva musen med pentobarbital (83 mg▼kg-1 kroppsvikt) genom intraperitoneal injektion. När musen blir medvetslös rakar du pälsen på skallen.
- Rengör huden ovanför skallen med 70% etanol och fäst musen på stereotaxisk ram. Ta försiktigt bort huden och torka skallytan med en 35% väteperoxidlösning med hjälp av en applikator med bomullsspets. Applicera smörjmedel ögonsalva för att förhindra hornhinnans torkning under operationen.
OBS: Även om det vanligtvis inte är några problem med att använda 70% etanol endast för aseptisk hudberedning, rekommenderas att du använder 3 alternerande patroner desinfektionsmedel, t.ex. jodforer eller klorhexidinlösning, och 70% etanol. Högre koncentration av väteperoxid används i detta protokoll för att säkerställa att bindväv på musskalle avlägsnas så fullständigt som möjligt, vilket är avgörande för att minska rörelseartefakt under senare avbildning eftersom bindväven på skallen stör en fast fast fastsättning av basplattan till skallen. Det bör noteras att 35% väteperoxid är mycket högre än vad som normalt används (3%). - Fäst stiftet med en stereotaxisk sondhållare. Rikta in höjden på bregma och lambda med stiftet.
- Hitta den specifika platsen på musskalle för kraniotomi.
OBS: Koordinaterna för den laterala amygdala (LA) för virusinjektion är (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) från knäm i detta protokoll (AP; Främre bakre, ML; Medial-Lateral, DV; Dorsal-Ventral, varje förkortning anger relativt axiellt avstånd från bregma)26. Koordinaterna bör optimeras för varje experimentellt tillstånd. - Borra skallytan (figur 1B). Tvätta skallfraktionen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort det återstående lagret med tång eller en 27 G nål.
- När du borrar skallen, försök att inte röra det sista duraskiktet för att undvika skador på hjärnvävnadsytan. En skadad hjärnyta orsakar inflammation runt linsen, vilket inducerar allvarliga rörelseartefakter och hög autofluorescens under inspelningen. Storleken på kraniotomin är 1,6 mm. Borrhastigheten är 18 000 varv/min och borrens storlek är 0,6 mm.
- För att sänka GRIN-linsen från hjärnvävnadsytan på den borrade platsen till mål amygdala-platsen, beräkna avståndet som heter "Värde A" genom att subtrahera DV-skillnaden mellan bregman och den exponerade hjärnytan från DV-koordinaten för linsimplantationen, som är inställd baserat på bregman (4,2 mm i detta fall, figur 1C).
- Ladda 3 μL mineralolja och 0,7 μL av AAV-viruslösningen i glaspipetten.
OBS: Mineralolja hjälper till att separera viruslösning och vatten. 0,7 μL är en optimerad volym för LA-virusinjektionen som helt kan täcka LA. - Ta bort stiftet från stereotaxisk sondhållare och fäst glaspipetten på den.
- Placera glaspipetten på injektionsstället som nämns i steg 1.5. Sätt in glaspipetten i hjärnvävnaden efter att blödningen har stoppats helt.
- Leverera viruset genom en glaspipett med en insprutningspump.
OBS: Virusets titer bör vara högre än 1 x 1013 vg/ml för att erhålla ett tillräckligt antal GCaMP-uttrycksceller. Insprutningshastigheten är 0,1 μL/min och diffus i 10 min. Om det blöder, tvätta hjärnytan med PBS. Håll hjärnytan våt i det här steget. - Efter avslutad injektion, ta långsamt bort glaspipetten.
2. Stereotaxisk kirurgi – GRIN-linsimplantation
OBS: GRIN linsimplantatkirurgi är det mest kritiska steget i detta protokoll. Eftersom en konsekvent långsam hastighet av GRIN-linsrörelsen är avgörande för framgångsrik GRIN-linsimplantation, kan en motoriserad operationsarm vara användbar. Den motoriserade operationsarmen är en stereotaxisk manipulator som styrs av datorprogramvara. Även om den motoriserade armen används i detta protokoll, kan andra sätt också användas så länge linsen rör sig konsekvent och långsamt under implantationen. Detaljerad information om enheten finns i strukturförteckningen.
- Borra skallen för att implantera två skallskruvar. Tvätta alla skallfraktionen med PBS.
OBS: För att minska rörelseartefakterna i senare optisk avbildning krävs minst två skruvar. De två skallskruvarna och GRIN-linsimplantatets läge bildar en liksidig triangel (figur 1B). Craniotomys storlek bör passa tätt med skruvens diameter. Om det blöder, tvätta blödningsytan med PBS. Borrhastigheten är 18 000 varv/min och borrens storlek är 0,6 mm. - Desinficera skruvarna med 70% etanol för att förhindra inflammation. Implantera skruvarna så djupt som möjligt.
OBS: Skruvarna ska vara ordentligt fastsatta utan ytterligare vidhäftning såsom cement. - Montera en motoriserad operationsarm på stereotaxiska ramen. Anslut den maskinvara som krävs till den bärbara dator där styrprogramvaran är installerad (Materialförteckning).
- Innan du sänker GRIN-linsen, förbered dig på att göra ett nålspår med en 26 G nål.
OBS: Nålspåret är ett slags guidespår som hjälper till att implantera den relativt tjocka GRIN-linsen i djupa hjärnregioner som amygdala utan att orsaka en allvarlig förvrängning av hjärnstrukturen längs injektionsvägen. Detta guidespår kallas ett nålspår eftersom det görs genom ett sänknings- och förhöjande förfarande på relativt tunn 26 G-nål. - Fäst kanylhållaren för att hålla nålen på stereotaxisk ram.
- Greppa 26 G-nålen med kanylhållaren och beräkna koordinaterna för nålinsättningsstället.
OBS: I detta protokoll är koordinaterna för nålinsättningsstället 50 μm laterala från virusinjektionsstället (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm). - Få tillgång till styrprogramvaran och slutför förberedelsen för att manipulera nålpositionen.
- Kör styrprogramvaran och välj knappen Starta nytt projekt för att börja styra sessionen.
Obs: I den kontrollerande sessionen finns det flera tomma rutor och menyknappar. De tomma rutorna är inmatningsutrymme för koordinater. När du har gått in i koordinater i de tomma rutorna rör sig den motoriserade stereotaxiska armen genom att klicka på knappen Gå till. Knappen Gå till ändras till en STOP-knapp när stereotaxiska armen rör sig. Bland flera menyknappar krävs bara knappen Verktyg i det här protokollet. - Klicka på knappen Verktyg. Kalibrera styrprogramvaran genom att klicka på knappen Kalibrera rammenyn. Kalibrering är den process genom vilken manipulatorns faktiska position ställs in som värden på Stereodrive-programvaran.
- Kör styrprogramvaran och välj knappen Starta nytt projekt för att börja styra sessionen.
- Leta reda på nålens spets vid den exponerade hjärnytan på skallytan med hjälp av stereotaxisk manipulator.
OBS: Nålens hastighet ställs in med hjälp av Microdrive-hastighetsmenyn i verktygsmenyn. Standardhastigheten är 3,0 mm/s. En hastighet på 0,5 mm/s rekommenderas dock i detta steg. Nålens rörelse styrs av piltangenterna. - Tillsätt 2-3 droppar PBS för att hålla hjärnytan våt. Fyll i den tomma rutan på datorskärmen med lämpliga DV-koordinater för LA. Om hjärnytan är torr hindrar det nålpenetration i hjärnvävnaden.
- Sänk 26 G-nålen genom att klicka på gå till-knappen. Den stannar automatiskt när nålen når målplatsen som ställts in med DV-koordinater. Nålens hastighet är 100 μm/min. Om det blöder, stoppa nålen genom att klicka på STOP-knappen och tvätta hjärnytan med PBS. Håll hjärnytan våt i det här steget. När blödningen har stoppats, börja sänka igen.
- När nålen helt slutar röra sig, ange 45,00 mm i den tomma lådan på datorskärmen.
OBS: 45,00 mm är ett värde av DV-koordinat som gör att nålen återgår till startläget. - Lyft nålen genom att klicka på knappen Gå till. Nålrörelsens hastighet är 100-200 μm/min.
- När nålen slutar röra sig, ta bort PBS på hjärnytan. Avinstallera nålen och kanylhållaren från stereotaxiska ramen. Experimenteraren kan manuellt stoppa nålen genom att klicka på STOP-knappen vid behov.
- Utrusta stereotaxisk stång med linshållaren. Montera GRIN-objektivet på linshållaren.
OBS: GRIN-objektivet som är optimerat för att rikta in sig på LA (0,6 mm i diameter, 7,3 mm lång) används i detta protokoll. Om linshållaren inte är förberedd är ett alternativt sätt att använda ett bulldogklämma för att greppa GRIN-linsen. - Desinficera objektivet med 70% etanol och fäst stereotaxisk stång på stereotaxiska ramar.
- Placera spetsen på GRIN-objektivet på den angivna platsen på skallytan (samma metod som beskrivs i steg 2.8).
OBS: Grin-objektivets koordinat är (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (figur 1C). Linsen får inte vidröra skallen för att undvika skador på spetsen. - Beräkna DV-koordinaten genom att subtrahera det absoluta värdet av "Värde A" från DV-koordinaten för linsimplantationen som beskrivs i steg 2.16.
- Släpp 2-3 droppar PBS på hjärnytan. Ange 1000 μm för sänkning och 300 μm för att höja objektivet i den tomma lådan på datorskärmen.
- Upprepa sänkning (1000 μm nedåt) och höjning (300 μm uppåt) av GRIN-objektivet tills den når målplatsen. Detta upp- och nedprocedur används för att frigöra trycket som genereras inuti hjärnvävnaden på grund av linsens sänkningsprocedur som annars kan orsaka förvrängning av hjärnstrukturer längs implantationsbanan.
OBS: Grin-linsrörelsens hastighet är 100 μm/min. Även om det blöder, sluta inte flytta GRIN-linsen och tvätta hjärnytan med PBS. Håll hjärnytan våt i det här steget. Om hjärnytan är torr fastnar hjärnvävnaden på GRIN-linsytan och det orsakar förvrängning av hjärnstrukturen. - Om GRIN-objektivet når målplatsen, ta bort PBS och applicera försiktigt hartstandcementet runt GRIN-objektivet, skruvarna och deras sidovägg (Figur 1D).
OBS: Applicering av hartscement över hela skallen kan minska rörelseartefakter. Tvärtom, om hartscementet oavsiktligt täcker musklerna som är fästa vid skallen, ökar rörelseartefakter. - När hartstandcementet härdar, demontera GRIN-linsen från linshållaren och applicera akrylcement över hela skallen (Figur 1D).
- För att fästa huvudplattan, demontera linshållaren från stereotaxiska stången och fäst huvudplattan på stångens spets med hjälp av band. Kontrollera om huvudplattan är horisontell.
OBS: En lutad huvudplatta orsakar en lutad vy. En huvudplatta krävs för att fästa mushuvudet i det mobila hembursystemet (i basplattans tillbehörssektion). Om experimenteraren inte använder systemet hoppar du över det här steget (steg 2.22) och följande steg 2.23. - Sänk långsamt stången tills huvudplattan finns högst upp på linsens manschett. Sänk huvudplattan 1000 μm mer. Flytta huvudplattan för den implanterade GRIN-linsen för att lokalisera på höger kant på huvudplattans inre ring.
OBS: Huvudplattan ska placeras lägre än den implanterade GRIN-linsytan; Annars kan mikroskopet inte närma sig tillräckligt nära den implanterade GRIN-linsen för att justera fokalplanet på grund av akrylcementet. - Applicera akrylcement för att fästa huvudplattan på cementskikten (Figur 1D).
- Fäst paraffinfilmen på den implanterade GRIN-linsytan för att skydda linsytan från damm. Applicera sedan avtagbar epoxibindning på paraffinfilmen för att hålla paraffinfilmen kvar på linsytan.
- Injicera Carprofen, en smärtstillande (0,5 mg/ml i PBS) och Dexametason, en antiinflammatorisk läkemedelslösning (0,02 mg/ml i PBS), i musens peritoneala hålighet.
OBS: Dosen av läkemedlet är beroende av kroppsvikten: Carprofen (5 mg▼kg-1 kroppsvikt) och Dexametason (0, 2 mg▼kg-1 kroppsvikt). Både Carprofen och Dexametason administreras efter operation och en gång om dagen i 7 dagar efter operationen. - Blanda 0,3 mg/ml amoxicillin, ett antibiotikum, i hembursvatten för att administrera läkemedlet i 1 vecka.
- Sätt tillbaka musen i hemburen och låt 5-8 veckor för återhämtning och virustransduktion.
OBS: Musen återvinns i en förvärmd bur på en elektrisk filt tills musen vaknar upp från bedövningen.
3. Validering av GRIN-linsimplantationen
OBS: Validering av GRIN-linsimplantationen ger information om huruvida den implanterade GRIN-linsen är på målet för GCaMP-uttrycksceller. Baserat på denna information sparar experimenteraren sin tid från tidskrävande processer som beteendetest och databehandling genom att utesluta djur med off-targeted GRIN-linsimplantation. Under valideringsproceduren bör celler med GCaMP-uttryck fokuseras i inspelningsfältet. En husbilsbur används i detta steg. En husbilsbur är en specialiserad rundformad apparat som gör det möjligt för huvudade möss att fritt flytta benen under valideringen av GRIN-linsimplantationen och basplattan. Ett luftbrobord i denna apparat där benen på huvudade möss placeras möjliggör sådan fri rörlighet för ben även om huvudet är fastsatt. Cellerna i amygdalas laterala kärna är vanligtvis tysta i vilande eller bedövat tillstånd så GCaMP fluorescenssignaler detekteras sällan under dessa förhållanden, vilket gör det mycket svårt, ibland omöjligt, att hitta celler som uttrycker GCaMP under valideringen av GRIN-linsimplantationen och basplattan. Benens rörelse producerar dock ofta GCaMP fluorescenssignaler i cellerna i lateral kärnan i amygdala och kan därmed hjälpa till att lokalisera mikroskopet. Således används husbilsburen i detta protokoll.
- Montera den stereotaxiska manipulatorn i det mobila hembursystemet.
- Söv musen med 1,5% isoflurangas. När musen är helt medvetslös, placera musen på huvudstången i det mobila hembursystemet.
- Leta reda på kolburen under musen. Stäng kolburen och slå på luftflödet för att få buret att röra sig fritt utan friktion. Vänta några minuter tills musen blir aktiv.
OBS: Luftflödets hastighet bör optimeras för varje experimentellt tillstånd (här, 100 L/min). - Ta bort paraffinfilm och epoxibindning på ytan av den implanterade GRIN-linsen och torka linsytan med 70% etanol med linspapper.
- Förbered programvaran för dataförvärv (DAQ) (t.ex. Inscopix). Ställ in bildförhållandena.
DAQ-programvaran används för att styra mikroskopet (LED-effekt, linsfokus etc. )och datalagring.- Slå på DAQ-lådan och anslut ett mikroskop till den. Anslut den sedan till en bärbar dator antingen direkt med en kabel eller via trådlöst internet.
DAQ-programvaran installeras i den extra hårdvaran som kallas DAQ-box (t.ex. Inscopix). Genom att ansluta DAQ-lådan till den bärbara datorn blir DAQ-programvaran tillgänglig i en bärbar dator. - Få tillgång till DAQ-programvaran via en webbläsare (Firefox rekommenderas).
- Ange alla nödvändiga detaljer (datum, mus-IDosv.)i den definierade sessionen. Klicka sedan på Spara och fortsätt. När du har sparat öppnar du körsessionen.
- I körningssessionenställer du in avbildningsförhållandena som exponeringstid, förstärkning, elektroniskt fokus och exponerings-LED-effekt.
OBS: Förstärknings- och exponerings-LED-effekt kan ändras beroende på laboratorieförhållandena. Rekommenderat värde för elektriskt fokus är 500 och exponeringstiden är 50 ms. Det finns ingen begränsning för att ändra LED-ström och vinst. En högre ljusintensitet kan dock orsaka mer blekning. Exponeringstiden för inspelningen bestämmer en bildhastighet för videoinspelning. Högre bildhastigheter minskar signalintensiteten. Bildhastigheterna bör optimeras för de GECIs som används för avbildningen.
- Slå på DAQ-lådan och anslut ett mikroskop till den. Anslut den sedan till en bärbar dator antingen direkt med en kabel eller via trådlöst internet.
- För att hålla mikroskopet på en stereotaxisk manipulator, fäst stereotaxisk stång med mikroskophandtag på stereotaxisk manipulator.
OBS: Gripdonet är ett litet tillbehör som kan fästas på stereotaxiska apparaten för att hålla en mikroskopkropp för att placera den på målhjärnplatsen. - Greppa mikroskopet med mikroskophandtaget. Tänd LED-lampan som är ansluten till mikroskopet och rikta mikroskopet vertikalt. Sänk mikroskopet medan du observerar bilden tills ytan på den implanterade GRIN-linsen dyker upp.
- Rikta in mitten av den implanterade GRIN-linsen mot mitten av vyn.
OBS: Validering av GRIN-linsimplantationen kan utföras i detta steg (nämns i resultatavsnittet, figur 2B, figur 2D, figur 2F). - Ta bild av den implanterade GRIN-linsytan (Klicka på Prt Sc-knappen på tangentbordet). Bilden av den implanterade GRIN-linsytan krävs för att avmarkera icke-neuronala komponenter under senare databehandling (steg 6.8).
- Hitta lämplig position för mikroskopet. Lyft långsamt upp objektivet av mikroskop medan du observerar bilden för att söka efter celler med GCaMP7b-uttryck.
OBS: Det kan vara nödvändigt att justera förstärkningen av bildförvärvet eller exponerings-LED-kraften. Validering av GRIN-linsimplantationen kan utföras i detta steg (nämns i resultatavsnittet, figur 2A, figur 2C, figur 2E).
4. Tillbehör till basplatta
OBS: Monteringssteget i basplattan följer valideringen av GRIN-linsimplantation. Basplattan är en plattform för montering av mikroskopet till mössens huvud. Som nämnts i föregående avsnitt används en husbilsbur i detta protokoll.
- Efter validering av GRIN-linsimplantation, demontera ett miniatyrmikroskop från mikroskophandtaget.
- Fäst basplattan i mikroskopet. Dra åt skruven med sexkantsnyckeln för stabil fastsättning av bottenplattan i mikroskopet.
- Greppa mikroskopet med mikroskophandtaget. Tänd LED-lampan som är ansluten till mikroskopet och rikta mikroskopet vertikalt. Sänk mikroskopet tills ytan på implanterad GRIN-lins observeras. Rikta in mitten av den implanterade GRIN-linsen mot mitten av vyn.
- Hitta lämplig position för mikroskopet. Lyft långsamt upp mikroskopets objektiv tills du hittar ett fokalplan som ger bästa bilder av celler med GCaMP7b-uttryck (Figur 2A).
OBS: Det kan vara nödvändigt att justera förstärkningen av bildförvärv eller exponerings-LED-kraft under detta steg. - Applicera akrylcementet för att stabilt fästa bottenplattan på huvudplattan (Figur 2G). Bygg upp sidoväggarna med akrylcement mellan bottenplattan och huvudplattan.
OBS: Akrylcementet krymper när det härdar. Av denna anledning, ta inte bort mikroskopet förrän cementet är helt härdat (det här steget tar minst 30 minuter). Cementering bör göras mycket noggrant för att undvika oönskad cementering av mikroskopet och dess objektiva lins med akrylcement. - Efter akrylcement härdar helt, lossar skruven och höjer mikroskopkroppen långsamt.
- Om det finns ett mellanrum på sidoväggen, gör om ytterligare cementering för att skydda den implanterade GRIN-linsen från damm.
- Täck basplattan för att skydda den implanterade GRIN-linsen från damm och dra åt skruven på basplattan.
- Lossa huvudplattan från huvudstången. Sätt tillbaka musen i hemburen tills framtida optisk avbildning.
5. Optisk inspelning av GCaMP-signal under ett beteendetest
OBS: Proceduren för GCaMP-signalinspelning under beteende kan vara mycket olika beroende på de system som används för optisk avbildning, experimentell design och laboratoriemiljö. Därför beskrivs det på ett enkelt sätt i det här avsnittet.
- Utför flera dagars hantering före beteendetestet.
- Förbered beteendeapparaten (t.ex. rädsla konditioneringskammare, beteendeprogramvara och Coulbourn Instrument) och bärbar dator.
- Anslut mikroskopet till DAQ-lådan och slå på DAQ-lådan.
- Anslut DAQ-lådan till den bärbara datorn via trådlös internetanslutning.
- Starta DAQ-programvaran (Firefox-webbläsaren rekommenderas) på den bärbara datorn. Klicka på knappen Filhanterare och kontrollera den återstående lagringskapaciteten i DAQ-rutan för att spara inspelade data.
OBS: Datastorleken är cirka 80 GB för 30 minuters inspelning. - Ange nödvändig information (datum, mus-IDosv.)i den definierade sessionen och delta i körsessionen.
- Ta försiktigt tag i musen och ta bort basplattans lock på huvudet. Placera mikroskopet på basplattans plattform.
- Dra åt basplattans skruv och placera djuret med ett huvudmonterat mikroskop i beteendekammaren.
OBS: Musen försöker fly i det här steget om hanteringen inte räcker till. - Anslut NI-brädan till DAQ-lådans TRIG-port med en BNC-kabel. NI-brädan tar emot TTL-signaler från beteendeprogramvara (t.ex. FreezeFrame) och samordnar samtidig inspelningsprocedur för GCaMP-signal och djurets beteende.
- Justera brännplanet.
OBS: Fokalplanet bestäms av avståndet mellan objektivlinsen av mikroskop och GRIN-linsen som implanteras i hjärnan. För att justera brännplanet manipuleras objektivets position när du observerar bilder. Avståndet mellan dessa två linser som visar tydlig morfologi av celler och blodkärl är inställt som brännplan för avbildning. I detta protokoll används DAQ-programvaran för att styra objektivets rörelse under justeringen. - Ställ in optimerad exponeringstid, förstärkning, LED-effekt i Kör session.
OBS: I allmänhet används 50 ms för exponeringstid. Förstärkning och LED-effekt ställs in baserat på bild histogram. Histogram visar fördelningen av pixlarna fluorescensintensitet. Baserat på visuell inspektion bör histogrammets högra kant ha ett värde mellan 40% och 60% när det gäller GCaMP7b. Det ändras beroende på vilka GECIs som används för avbildning. - Ändra inspelningsalternativet till utlöst inspelning. Klicka på Spela in och starta beteendet.
Det utlösta inspelningsalternativet ger en matchad tidslinje för inspelningssessionen och beteendesessionen. Om TTL-signalen tas emot tänds en röd lampa ovanför TRIG-porten. - Efter avslutad beteendetest, lossa mikroskopet och fäst basplattans lock.
- Sätt tillbaka musen i hemburen. Välj sedan Filhanterare och exportera data från DAQ-rutan.
- Efter beteendetestet, offra musen för postmortem histologisk verifiering.
6. Databehandling
OBS: Databehandlingsproceduren är mycket olika beroende på databehandlingsprogramvaran och GECIs som används för bildexperimentet. Därför beskrivs det på ett enkelt sätt i det här avsnittet. Detta protokoll använder kommersiell databehandlingsprogramvara (se Materialförteckning ). Alternativt kan annan programvara med öppen källkod som nämns i diskussionsavsnittet också användas utan problem. Variablerna som används i det här protokollet visas i tabell 1.
- Importera inspelningsvideodatafilen (1280 pixlar x 800 pixlar) från DAQ-rutan till den stationära datorn för databehandling. Starta databehandlingsprogrammet.
OBS: Databehandlingsprogram skiljer sig från DAQ-programvara i tidigare steg. I databehandlingsprogram finns det 6 steg: nedprovtagning, beskärning, rumsligt filter, rörelsekorrigering, ΔF/F-beräkning, händelsedetektering som är nödvändiga för att extrahera encelliga kalciumtransientdata från inspelad video. - Nedsampla och beskär videon.
OBS: Nedsampling och beskärning är nödvändiga för att öka databehandlingshastigheten. Beskär det område utom den region där GCaMP-signalen observeras. - Använd rumsligt filter. När du har tillämpat spatialt filter skapar du en genomsnittlig intensitetprojektionsbild.
OBS: Spatial filter skiljer varje pixel i inspelad videobild och ger en bild med hög kontrast. Det finns två typer av brytfilter, lågt och högt brytfilter. Det högre värdet av låga brytfilter ökar bildens kontrast men samtidigt ökar också det totala grå bruset. Det lägre värdet på högskärningsfiltret gör bilden suddig. - Tillämpa rörelsekorrigering. Använd den genomsnittliga intensitetsprojektionsbilden som referensbild för rörelsekorrigering.
- Använd rörelsekorrigering igen med bilden av den första bildrutan som referensbild.
OBS: Två steg för rörelsekorrigering minskar signifikant rörelseartefakt. - Använd ΔF/F-beräkning för att visualisera pixlar som visar en förändring i ljusstyrkan.
OBS: Ljusstyrksförändringen hos pixlar orsakas av fluorescensintensitetsförändring av GCaMP, och det indikerar kalciumtransienter. - Applicera PCA/ICA-algoritmen för att visualisera kalciumtransientkurvan för varje cell.
PCA/ICA är en algoritm för att sortera en datagrupp i en uppsättning enskilda komponentdata. Variablerna bör optimeras för varje laboratorietillstånd. I det här protokollet är alla variabler standard utom ICA temporal vikt (0,4 används i det här protokollet)27. - Avmarkera manuellt icke-neuronala komponenter bland identifierade komponenter baserat på de kriterier som beskrivs i följande anmärkning.
OBS: Två huvudkriterier används för detta ändamål. För det första ser GCaMP-signalen från en neuron ut som en tydlig sfärisk form. Således väljs endast signalen med en tydlig sfärisk form som en neuron. För det andra, med tanke på diametern på cellkroppen i amygdala pyramidalcell är känd för att vara cirka 20 μm28,29,30, endast signalen matchar ungefär med denna storlek väljs som en neuron. För att bestämma storleken på GCaMP-signalen beräknas den faktiska storleken på en enskild pixel baserat på den infångade bilden av linsytan (steg 3.9) och den maximala bredden på en enda sfärisk form beräknas. I detta protokoll är till exempel diametern på den implanterade GRIN-linsen 600 μm. Därför, om linsens diameter är 800 pixlar, är den faktiska storleken på den enda pixeln 1,5 μm (20 μm är ca 7 pixlar). - Applicera händelsedetekteringsfunktionen för att upptäcka en signifikant ökning av kalciumtransient (kalciumhändelse).
OBS: I det här steget krävs variabeln som kallas händelse minsta sönderfallstid (τ). I det här protokollet används 1,18s som en optimerad variabel för GCaMP7b. Den genomsnittliga halveringstiden (t1/2=0,82s) beräknas baserat på ΔF/F-kurvan under cellernas spontana aktivitet. Eftersom GCaMP följer exponentiellt sönderfall, τ =
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av GRIN-linsimplantation
Innan man kroniskt fäster basplattan på hjärnan genom cementering måste GRIN-linsimplantationen valideras. Hos djur med framgångsrik linsimplantation observerades både GCaMP-uttrycksceller och blodkärl tydligt inom ett fokalt planområde som bestämdes av avståndet mellan objektiv lins av mikroskop och implanterad GRIN-lins (figur 2A och B). Hos djur med off-target implantation observerades däremot inte en tydlig bild av GCaMP-uttrycksceller inom fokalplansområdet (antingen ur fokus eller utom synbar). När det gäller ofokuserade, välfokuserade blodkärl kunde observeras men endast suddiga bilder för celler inom fokalplanet(figur 2C och D). När det gäller utom synfält observerades inte blodkärlen i de flesta fall och ingen fluorescenssignal upptäcktes inom fokalplanets område (figur 2E). Dessutom, till skillnad från andra fall, visade den implanterade GRIN-linsen en ljus kant (Figur 2F). Basplattans tillbehör utförs endast på validerade djur med på mål GRIN-linsimplantation.
Registrering av GCaMP-signaler i LA-neuron som svar på auditiva stimuli
I detta protokoll presenterades 4 fall av pseudorandomized ton (2,8 kHz, 200 ms varaktighet, 25 pulser) för en mus och GCaMP signaler registrerades optiskt i LA celler hos möss med huvud-mount mikroskop. Möss injiceras med AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE i ensidiga laterala amygdala användes för imaging. Hos djur med framgångsrik GRIN-linsimplantation observerades virus som uttrycker celler och blodkärl tydligt inom fokalplansområdet (figur 3A). I beteendetillståndet uppvisade cirka 50-150 celler vanligtvis en betydande fluorescensförändring inom synfältet i LA även utan ton som visas i ΔF/F-bilden, sannolikt spontant aktiva celler (Figur 3B). Vid tonpresentationen visade endast ett fåtal celler en tonspecifik förändring av GCaMP-signalen enligt ΔF/F-bildanalys (6 celler i figur 3C och figur 3D). Samma procedurer utfördes på möss injicerade med AAV2/1-CaMKIIα-GFP som en kontroll. Även om GFP-uttrycksceller upptäcktes inom fokalplansområdet, visade inga celler en signifikant fluorescensförändring med eller utan ton enligt ΔF/F-bildanalys (figur 3E och figur 3F).
För histologisk verifiering av GCaMP-uttryck och inriktning av GRIN-lins undersöks koronaldelar av postmortemhjärnan under fluorescensmikroskopet (figur 4A och figur 4B). DAPI-färgning används för att bekräfta intakta celler och inga tecken på vävnadsskada på grund av inflammation i hjärnvävnaden runt GRIN-linsen (Figur 4C).
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde och diagram för stereotaxisk kirurgi för mikroskopisk kalciumavbildning in vivo i LA. (A) Ett schematiskt arbetsflöde för mikroskopisk kalciumavbildning in vivo i LA. B) En mikroskopisk bild som visar tvådimensionella koordinater för kraniotomiplatser för virusinjektionen och GRIN-linsimplantatkirurgin. Två skallskruvar och linsen bildar en liksidig triangel. c) Ett diagram över den relativa positionen mellan virusinjektionsstället och den implanterade GRIN-linsen samt en schematisk förklaring till beräkningen av "Värde A". D) Tvärsnitt av cementskiktet från skallytan till huvudplattan i de sista stegen av operationen. Hartstandcement bör täcka väggen på skruvarna och den implanterade GRIN-linsen. Akrylcement appliceras på hartstandcementet. Huvudplatta är fäst på cementskiktet. Paraffinfilm täcker den implanterade GRIN-linsytan och skyddar den från damm. Avtagbar epoxibindning förhindrar att paraffinfilm tas bort. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Validering av GRIN-linsimplantationen och konfigurationen av cementskikt efter basplattans fastsättning. A) En representativ endoskopisk ögonblicksbildbild från djur med framgångsrik GRIN-linsimplantation. Både GCaMP uttrycker celler och blodkärl observeras tydligt. B) Ögonblicksbildbild av den implanterade GRIN-linsytan från djur med framgångsrik GRIN-linsimplantation. c) En representativ endoskopisk ögonblicksbildbild från djur med grinlinsimplantation utanför fokus. (D) Ögonblicksbildbild av den implanterade GRIN-linsytan från djur med GRIN-linsimplantation utanför fokus. När det gäller ofokus observeras blodkärlen ibland tydligt men bara suddiga bilder för celler inom fokalplansområdet. e) En representativ endoskopisk ögonblicksbildbild från djur med grinlinsimplantation utanför syn. När det gäller utom synfält observeras inte blodkärlen i de flesta fall och ingen fluorescenssignal detekteras inom fokalplanets område. F) En ögonblicksbild av den implanterade GRIN-linsytan från djur med grinlinsimplantation utanför syn. Till skillnad från andra fall observeras den ljusa kanten i detta fall. G) Konfiguration av cementskikt för tillbehör till underplatta. Basplatta och huvudplatta fästs med akrylcement. Det bör finnas ett utrymme ofyllt med akrylcement mellan basplattan och GRIN-linsen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Inspelning av GCaMP-signaler i LA-nervcellerna. (A till C) Data från en mus som injicerats med AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE. (A) En representativ endoskopisk ögonblicksbildbild under ett beteendetest. GCaMP7b uttrycker celler och blodkärl observerades tydligt inom fokal planområdet. B) En representativ ögonblicksbildbild som visar ΔF/F-signal. Vit linje anger celler som visade en betydande fluorescensförändring i intresseområdet under beteendetestet. Skalstång = 50 μm. (C) Maximal intensitet projektionsbild. Totalt 6 celler visade en tonspecifik förändring av GCaMP-signalen. Skalstång = 50 μm. (D) Representativa ΔF/F-spår av tonkänsliga celler. Varje färg motsvarar varje enskild cell med samma färg på panelen (C). (E och F) Data från en mus som injicerats med AAV2/1-CaMKIIα-GFP. (E) En representativ endoskopisk ögonblicksbildbild under ett beteendetest. GFP uttrycker celler upptäcktes tydligt inom fokal planområdet. (F) En representativ ögonblicksbildbild som visar ΔF/F-signal. Skalstreck = 50μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologisk kontroll av GRIN-linsens position och GCaMP7b-uttrycket. (A) En representativ koronarsektionsbild som visar GCaMP7b-uttryck i LA. Skalstång = 200μm. (B) Förstorad bild. Skalstång = 50 μm. (C) Fluorescens mikroskopisk bild som visar DAPI färgningssignal. Skalbar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Faktor | Värde |
| Provtagningsfaktor för rumslig ned | 2 |
| Provtagningsfaktor för temporal ned | 2 |
| Rumsligt filter: Hög brytning | 0.5 |
| Rumsligt filter: Låg brytning | 0.005 |
| Rörelsekorrigering: Hög brytning | 0.016 |
| Rörelsekorrigering: Låg brytning | 0.004 |
| Rörelsekorrigering: Maxöversättning | 20 |
| Referensram för ΔF/F | Genomsnittlig ram |
| PCA/ICA: blockeraSize | 1000 |
| PCA/ICA: konvergensThreshold | 1x10^-5 |
| PCA/ICA: icaTemporalWeight | 0.4 |
| PCA/ICA: numIC | 120 |
| PCA/ICA: numPCs | 150 |
| PCA/ICA: unmixType | Temporal |
| Händelsedetektering: Förfall konstant | 1.18 |
| Händelseidentifiering: Tröskelvärde | 4 |
Tabell 1: Förteckning över variabler för databehandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skickliga kirurgi tekniker är avgörande för att uppnå framgångsrika in vivo optiska kalcium imaging med head-mount miniatyrmikroskopi i djupare hjärnregioner såsom amygdala som vi beskrev här. Därför, även om detta protokoll ger en riktlinje för optimerade kirurgiska processer av baseplate bilaga och GRIN lins implantation, ytterligare optimeringsprocesser kan vara nödvändiga för kritiska steg. Som nämnts i protokollavsnittet, amygdala koordinater i kirurgi, luftflödeshastighet i basplattans fastsättningssteg, bildförvärvsinställningar (bildhastighet, LED-effekt etc.) i kalciumregistrering och variabler (ICA temporalvikt, händelse minsta sönderfallstid etc.) i databehandling måste optimeras.
Steget för bifogade filer i basplattan kan ändras. Huvudplattan är nödvändig eftersom den hjälper till att fixa huvudet på vakna möss under basplattan som utförs i husbilsburen. Men om husbilsburen inte är förberedd i laboratoriet är isoflurangasbedövningssystemet ett alternativt alternativ. För detta alternativa sätt kan koncentrationen av isoflurangas vara kritisk. Vi observerade att GCaMP-signal sällan detekteras i amygdala hos möss under 1,5% isofluran. Tvärtom detekteras GCaMP-signalen under ett isoflurantillstånd på 0,8% och möss håller sig i ett nästan vaken tillstånd men utan betydande huvudrörelser i detta tillstånd. Detta bedövningstillstånd gör det möjligt att utföra basplattans tillbehör utan att använda ytterligare enheter som huvudplatta och husbilsbur.
Instabil fastsättning av skallskruven, cementet, basplattan och mikroskopet kan orsaka rörelseartefakter som kan korrigeras med hjälp av rörelsekorrigeringsprogramalgoritm. Rörelsen av den laterala ventrikeln tros orsaka en oregelbunden typ av rörelse artefakter som inte lätt kan korrigeras med för närvarande tillgängliga rörelsekorrigering programvara. Sådana oregelbundna rörelseartefakter är minimala i de flesta ytliga hjärnregioner som hippocampus och cortex. Det upptäcks dock ofta under optisk avbildning i amygdala. För att övervinna detta problem föreslår detta protokoll implantering av GRIN-linsen 50 μm bort från viral injektionsställe till sidosidan (Figur 1C), vilket avsevärt förbättrar bildförvärvsprocessen genom att minska de potentiella rörelseartefakterna som härrör från den laterala ventrikeln. Även om vi ställer in 50 μm i förhållande till det virala injektionsstället, kan målkoordinaten för linsimplantation också ställas in i förhållande till den laterala ventrikeln. I det här protokollet resonerade vi att det är mer kritiskt att exakt rikta in sig på den virala uttrycksplatsen för framgångsrik prestanda för avbildning. Således använde vi en viral injektionskoordinate som referens för att ställa in målkoordinaten för linsimplantation. Genom upprepade försök etablerade vi ett optimalt tillstånd som tillät GRIN-linsen för att effektivt rikta in sig på viralt uttrycksställe samtidigt som vi undviker rörelseartefakter orsakade av laterala ventrikelrörelser. Så småningom skulle metoden som effektivt och exakt kan korrigera alla rörelseartefakter vara till stor hjälp för att komma åt optisk avbildning till djupare hjärnregioner i framtiden.
Även om den optiska kalciumavbildningen in vivo med huvudmonterade miniatyrmikroskop är ett kraftfullt verktyg och har optimerats, finns det fortfarande utrymme för förbättringar i många aspekter. Detta protokoll kommer att underlätta studier som syftar till att undersöka neural aktivitet i realtid i amygdala av fritt beuppfostrande djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
