Framgångsrik in vivo kalciumavbildning med ett huvudmonterat miniatyriserat mikroskop i Amygdala av fritt beter sig mus
Summary
In vivo mikroskopisk kalciumavbildning är ett ovärderligt verktyg som möjliggör realtidsövervakning av neuronala aktiviteter hos fritt beter sig djur. Att tillämpa denna teknik på amygdala har dock varit svårt. Detta protokoll syftar till att ge en användbar riktlinje för att framgångsrikt rikta amygdala celler med ett miniatyriserat mikroskop hos möss.
Abstract
In vivo realtidsövervakning av neuronala aktiviteter hos fritt rörliga djur är en av viktiga metoder för att länka neuronal aktivitet till beteende. För detta ändamål har en in vivo-bildteknik som detekterar kalciumöverstienter hos nervceller med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs), ett miniatyriserat fluorescensmikroskop och en gradient brytningsindex (GRIN) lins utvecklats och framgångsrikt applicerats på många hjärnstrukturer1,2,3,4,5,6. Denna bildframställningsteknik är särskilt kraftfull eftersom den möjliggör kronisk samtidig avbildning av genetiskt definierade cellpopulationer under en långsiktig period upp till flera veckor. Även om det är användbart, har denna bildteknik inte lätt tillämpats på hjärnstrukturer som lokaliserar djupt inne i hjärnan som amygdala, en viktig hjärnstruktur för känslomässig bearbetning och associativt rädslaminne7. Det finns flera faktorer som gör det svårt att tillämpa bildtekniken på amygdala. Till exempel förekommer rörelseartefakter vanligtvis oftare under avbildningen som utförs i de djupare hjärnregionerna eftersom ett huvudmonterat mikroskop implanterat djupt i hjärnan är relativt instabilt. Ett annat problem är att den laterala ventrikeln är placerad nära den implanterade GRIN-linsen och dess rörelse under andning kan orsaka mycket oregelbundna rörelseartefakter som inte lätt kan korrigeras, vilket gör det svårt att bilda en stabil bildvy. Dessutom, eftersom celler i amygdala är vanligtvis tysta i vilande eller bedövade tillstånd, är det svårt att hitta och fokusera målcellerna som uttrycker GECI i amygdala under baseplating förfarande för senare bildbehandling. Detta protokoll ger en användbar riktlinje för hur man effektivt riktar in sig på celler som uttrycker GECI i amygdala med huvudmonterade miniatyriserade mikroskop för framgångsrik in vivo kalcium imaging i en så djupare hjärnregion. Det bör noteras att detta protokoll bygger på ett visst system (t.ex. Inscopix) men inte begränsat till det.
Introduction
Kalcium är en allestädes närvarande andra budbärare, spelar en avgörande roll i nästan alla cellulära funktioner8. I nervceller orsakar potentiell bränning och synaptisk ingång snabb förändring av intracellulär fri [Ca2 +]9,10. Därför ger spårning av kalciumtransienter en möjlighet att övervaka neuronal aktivitet. GECIs är kraftfulla verktyg som möjliggör övervakning [Ca2+] i definierade cellpopulationer och intracellulära fack11,12. Bland många olika typer av proteinbaserad kalciumindikator är GCaMP, en Ca2 + sond baserad på en enda GFP-molekyl13, den mest optimerade och därmed allmänt använda GECI. Genom flera tekniska rundor har ett antal varianter av GCaMP utvecklats12,14,15,16. Vi använder en av de nyligen utvecklade GCaMPs, GCaMP7b, i detta protokoll16. GCaMP-sensorer har i hög grad bidragit till studien av neurala kretsfunktioner i ett antal modellorganismer som avbildning av Ca2 + transienter underutveckling 17, in vivo-avbildning i ett specifiktnärskikt 18, mätning av kretsdynamik i motoruppgiftsinlärning19 ochbildbehandling av cellensembleaktivitet relaterad till associativt skräckminne i hippocampus och amygdala20,21.
Optisk avbildning av GECIs har flera fördelar22. Genetisk kodning gör det möjligt att stabilt uttrycka GECIs under en långsiktig tidsperiod i en specifik delmängd av celler som definieras av genetisk profil eller specifika mönster för anatomisk anslutning. Optisk avbildning möjliggör in vivo kronisk samtidig övervakning av hundratals till tusentals nervceller hos levande djur. Några optiska bildsystem har utvecklats för in vivo-avbildning och analys av GECIs i hjärnan av fritt beter sig möss med huvudmonterade miniatyriserade fluorescensmikroskop21,23,24,25. Trots att in vivo optisk bildteknik baserad på GECIs, GRIN-lins och ett huvudmonterat miniatyrmikroskop är ett kraftfullt verktyg för att studera sambandet mellan neural kretsaktivitet och beteende, har det varit svårt att tillämpa denna teknik på amygdala på grund av flera tekniska problem relaterade till att rikta GRIN-linsen till celler som uttrycker GECIs i amygdala utan att orsaka rörelseartefakter som allvarligt minskar kvaliteten på bildförvärv och hitta celler som uttrycker GECIs. Detta protokoll syftar till att ge en användbar riktlinje för kirurgiska ingrepp av baseplate bilaga och GRIN lins implantation som är kritiska steg för framgångsrika in vivo optiska kalcium imaging i amygdala. Även om detta protokoll riktar sig till amygdala, de flesta förfaranden som beskrivs här är allmänt tillämpliga på andra djupare hjärnregioner. Även om detta protokoll är baserat på ett visst system (t.ex. Inscopix), kan samma syfte lätt uppnås med andra alternativa system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skickliga kirurgi tekniker är avgörande för att uppnå framgångsrika in vivo optiska kalcium imaging med head-mount miniatyrmikroskopi i djupare hjärnregioner såsom amygdala som vi beskrev här. Därför, även om detta protokoll ger en riktlinje för optimerade kirurgiska processer av baseplate bilaga och GRIN lins implantation, ytterligare optimeringsprocesser kan vara nödvändiga för kritiska steg. Som nämnts i protokollavsnittet, amygdala koordinater i kirurgi, luftflödeshastighet i basplattans fastsättnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
